一、生物學的幾個發展階段簡要回顧二、分子生物學的發展簡史三、分子生物學的概念、原理、研究內容四、分子生物學取得的主要理論成就五、分子生物學取得的重要應用成就六、分子生物學的主要技術進步七、遺傳的分子生物學八、基因工程現代生物學進展一、生物學的幾個發展階段簡要回顧二、分子生物學的發展簡史三、11、普通生物學階段：以個體、群體、博物、描述為特征的生物學2、細胞生物學階段：在細胞水平上揭示生命活動規律3、分子生物學階段：在生物大分子水平上研究生命活動規律4、反向生物學階段:由基因型到表型，由序列到功能的，與傳統生物學研究思路反向而行的生物學，從理論上探討生命的本質和生命運動的邏輯。一、生物學的幾個發展階段1、普通生物學階段：以個體、群體、博物、描述為特2、細胞生物2二、分子生物學發展簡史1944.Avery證明DNA為遺傳物質（轉化試驗）1953.Waston&CrickDNA雙螺旋結構1958.Crick提出遺傳中心法則1961.Monas&Jacob乳糖操縱子模型1966.Neriberg等破譯全部遺傳密碼1970.Arber等DNA限制性內切酶Khorana體外合成tRNA，發現連接酶Baltimore&Temin逆轉錄酶二、分子生物學發展簡史1944.Avery證明DNA為遺傳31972.Bergλ噬菌體與SV40DNA體外重組1973.Boyer&Cohen重組質粒表達成功1975.Southern發明雜交技術Bishop等發現第一個癌基因Src1977.Sanger.Maxman&Gilbert快速測序1978.Miniatis建立人類基因文庫1981.Cech&Altman發現核酶1983.McClintock發現的跳躍基因獲獎1984.Kohler單克隆抗體技術1985.Mullis首創PCR技術1972.Bergλ噬菌體與SV40DNA體外重組41990.人類基因組計劃正式啟動1993.Roberts&Sharp發現斷裂基因Smith進行基因的定點突變1994.Gilman&BodbellG蛋白信號轉導1995.Lewis等發現果蠅體節發育基因1997.Stanley發現朊病毒1999.Gunter.Blobel闡明胞內蛋白運輸機理2000.Carlsson等神經多巴胺在信號轉導中的作用2001.Hartwell等發現細胞周期調控因子CDK激酶等1990.人類基因組計劃正式啟動5三、分子生物學概念、原理、內容1、概念：

廣義：所有生物大分子的結構、功能、重要性、規律性及相互關系狹義：分子遺傳學2、內容：①生物大分子的結構與功能或①蛋白質的分子生物學②基因工程②核酸的分子生物學③基因表達調控③信號轉導的分子生物學3、三條基本原理：

①所有生物體大分子的構成單位相同②大分子建成規則相同③生物體的特異性由其大分子的特異性所規定三、分子生物學概念、原理、內容1、概念：2、內容：3、三條基6四、主要的理論成就1、DNA雙螺旋模板學說2、遺傳中心法則3、基因表達調控理論（操縱子模型）4、基因學說的豐富和發展（基因現代概念的確立）5、基因突變理論6、基因作圖理論7、分子進化學說8、信號轉導學說9、細胞周期調控理論10、癌變的分子機制11、通用遺傳密碼字典與非通用遺傳密碼字典12、生物信息學13、基因組學與比較基因組學14、“RNA世界”假說15、細胞衰老和程序化死亡機理四、主要的理論成就1、DNA雙螺旋模板學說9、細胞周期調控理7五、主要的應用成就（1）已用基因工程的技術研制出了一批珍貴的基因工程藥物：①人生長抑素②生產胰島素③生產生長激素④生產組織型血纖維蛋白溶酶原激活因子⑤抗血友病因子Ⅳ⑥制備乙型肝炎疫苗⑦生產多種細胞因子⑧制備基因工程抗體1、在醫學上的應用成就五、主要的應用成就（1）已用基因工程的技術研制出了一批珍貴8現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件9（2）基因診斷與基因治療①疾病診斷：遺傳病、腫瘤、病毒感染的診斷，具有特異性高，適應性強的特點，常用方法有核酸雜交、RFLP、PCR、DNA指紋圖譜②法醫診斷、親子鑒定③基因治療：方法有將目的基因與逆轉錄病毒重組、轉染受體細胞，使之表達以彌補缺陷；將目的基因對染色體進行定位整合，即基因打靶；裸DNA直接注射。（2）基因診斷與基因治療10

至1997年，美國已批準上市的基因工程藥物有近20種，它們是：胰島素、人生長激素、干擾素、白細胞介素2、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、紅細胞生成素、組織溶纖原激活劑、生長激素、促生長素、抗血友病因子Ⅷ、葡糖腦苷脂酶、脫氧核糖核酸酶、乙型肝炎疫苗、甲型肝炎疫苗、體內用單克隆抗體、鼠單克隆抗體。至1998年，我國已批準上市的基因工程藥物亦有10余種，如：干擾素、白細胞介素、粒細胞集落刺激因子、鏈激酶、紅細胞生成素、成纖維細胞生長因子等。至1997年，美國已批準上市的基因工程藥物有近11基因工程方法生產蛋白質藥物的優勢是非常明顯的基因工程方法生產蛋白質藥物的優勢是非常明顯的12已投入使用（含臨床試驗）的基因工程疫苗已投入使用（含臨床試驗）的基因工程疫苗13現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件14①轉基因植物：已克隆了100多個植物基因，使作物獲得高產、優質、抗病、抗蟲、抗逆等多種優良性狀，下表列出了各國轉基因作物的大田釋放情況：轉基因作物性狀批準項數所占比例（%）抗除草劑129729.6抗蟲104623.8優質88620.2抗病毒4369.9農學性狀優2114.8抗真菌2084.7其它3036.92、在農業上的應用成就①轉基因植物：已克隆了100多個植物基因，使作物獲得高轉基因15作物性狀批準數馬鈴薯抗病、抗逆、品種5，1，1水稻抗蟲、抗病、抗除草劑1，4，1棉花抗蟲9玉米抗蟲3大豆抗除草劑1小麥抗除草劑、品質1，1廣藿香抗病1煙草抗病毒、抗蟲2，2楊樹抗蟲1微生物提高固氮效率6我國獲準進入大田的轉基因植物（1998）作物性狀批準數馬16②轉基因動物：相繼培育成功的轉基因動物包括，鼠、豬、羊、雞、兔、鯉魚、鯰魚、金魚等。③克隆動物：1997年，英國科學家克隆成功“多莉”綿羊（由成年乳腺細胞發育而來）和“波莉”綿羊，它的乳汁中含有人類基因的蛋白產物。④分子輔助育種：改選育性狀為選育標記。.②轉基因動物：相繼培育成功的轉基因動物包括，鼠、豬、③克隆動173、在能源開發和環保中的成就①利用超級工程菌以植物秸桿作材料生產有“綠色石油”之稱的新型能源——酒精。②構建超級工程菌迅速清除海洋中的石油污染及其它環境污染。4、在采礦工業中的應用用工程菌浸礦，浸出銅、鈾、鈷、錳、鋅、鋁等金屬加拿大用細菌浸出的鈾已達230萬噸。3、在能源開發和環保中的成就①利用超級工程菌以植物秸桿作材料18①人類基因組計劃②水稻基因組計劃③模式生物基因組研究：已闡明基因組序列的生物有19種（均為單細胞生物），此外小鼠、果蠅、家蠶、擬南芥等模式生物的基因組序列也將很快闡明。④建立了世界共享的三大分子數據庫5、基因組學的重大進展①人類基因組計劃5、基因組學的重大進展19六、技術進步1.超離技術2.電泳技術3.電鏡技術4.X衍射與核磁共振5.分子雜交技術(Southern/Northern/Western/FISH)6.基因克隆、基因文庫7.PCR8.DNA測序9.DNA化學合成10.載體構建11.染色體步查12.基因定點誘變13.基因打靶14.基因轉移15.動物克隆六、技術進步1.超離技術8.DNA測序2016.單克隆抗體17.基因工程抗體18.基因診斷19.基因治療20.基因作圖21.差異顯示22.分子進化工程23.分子輔助育種24.生物芯片25.DNA指紋26.酵母雙雜交27.基因捕獲28.RNAi29.基因敲除16.單克隆抗體23.分子輔助育種21ＰＣＲ法：PCR（polymerasechainreaction)技術是Mullis于1986年發明的一項體外快速大量擴增ＤＮＡ片段的方法（獲1994年諾貝爾獎）。其基本原理就是在體外模擬體內DNA復制的過程，在反應系統中加入欲被擴增的DNA片段，作為模板；人工合成的寡聚核苷酸，作為引物；耐熱的DNA聚合酶（Taq）以及四種核苷酸三磷酸。反應時，先加熱至約92℃，使模板變性。降溫至約50℃使引物與模板結合（退火），加溫至７２℃，在Taq酶作用下，使新ＤＮＡ鏈延伸。重復92℃（變性）、50℃（復性）、72℃（延伸）的過程使ＤＮＡ片段得到不斷的擴增，可以重復幾十個周期。ＤＮＡ片段將2n（ｎ為反應周期數）的倍數增加。ＰＣＲ法：22現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件23現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件24現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件25現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件26現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件27現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件28人類基因組計劃1993-1998年的目標和截止到1998年10月全球定量完成的情況以及1998-2003年的新目標人類基因組計劃1993-1998年的目標和截止到1998年129現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件30七、生物信息學簡介研究內容：（1）各種生物數據庫的建立和管理。這是一切生物信息學工作的基礎，通常要有計算機科學背景的專業人員與生物學家密切合作。（2）數據庫接口和檢索工具的研制。數據庫的內容來自萬千生物學者的日積月累，最終又為生物學者們所用。但不能要求一般生物學工作者具有高深的計算機和網絡知識，因此，必須發展查詢數據庫和向庫里提供數據的方便接口。這是專業人員才能勝任的工作，通常在生物信息中心里進行。七、生物信息學簡介研究內容：（1）各種生物數據庫的建立和管理31（3）人類基因組計劃的實施，配合大規模的DNA自動測序，對信息的采集和處理提出了空前的要求。從各種圖譜的分析，大量序列片段的拼接組裝，尋找基因和預測結構與功能，到數據和研究結果的視像化，無不需要高效率的算法和程序。研究新算法、發展方便適用的程序，是生物信息學的日常任務。（4）生物信息學最重要的任務，是從海量數據中提取新知識。這首先是從DNA序列中識別編碼蛋白質的基因，以及調控基因表達的各種信號。其次，從基因組編碼序列翻譯出的蛋白質序列的數目急劇增加，根本不可能用實驗方法一一確定它們的結構和功能。從已經積累的數據和知識出發，預測蛋白質的結構和功能，成為常規的研究任務。（5）DNA芯片和微陣列的發展，把一定組織或生物體內萬千基因時空表達的研究提上日程．研究基因表達過程中的聚群關系，從中提取調控網絡和代謝途徑的知識，進而從整體上模擬細胞內的全部互相輔合的生化反應，在亞細胞層次理解生命活動。只有掌握已有數據、發展嶄新算法，才能創造新的知識。這是生物信息學剛剛掀開的新篇章。（3）人類基因組計劃的實施，配合大規模的DNA自動測序，對信322、在基因組計劃中的作用1）高度自動化的實驗數據的獲得、加工和整理2）序列片段的拼接3）基因區域的預測4）基因功能預測5）分子進化的研究2、在基因組計劃中的作用33遺傳的分子生物學基因的化學基礎是什么？遺傳的染色體理論認為：基因位于細胞核內染色體上；染色體的主要化學成份——蛋白質和核酸何者為基因的化學基礎？*“蛋白質是遺傳物質”觀點及其主要論據。基因化學本質的條件：具有三種功能(p31)。遺傳功能(復制與世代傳遞)；表型功能(具有適當的控制性狀的表達機制)；進化功能(能夠產生變異滿足生物進化的要求)。遺傳的分子生物學基因的化學基礎是什么？34三個學派E.Schr?dinger(1945)(薛丁格)：Whatislife?二十世紀，由于物理學、化學和數學研究工作者的加入，在生物學與遺傳學研究領域形成了三個學派：物理學——結構——結構學派；化學——生化——生化學派；數學——信息——信息學派。三個學派E.Schr?dinger(1945)(薛丁格)：35第一節DNA作為主要遺傳物質的證據一、DNA是遺傳物質的間接證據二、DNA是遺傳物質的直接證據(一)、細菌轉化試驗(二)、噬菌體侵染與繁殖試驗(三)、煙草花葉病毒拆合實驗*三、非核酸類的遺傳物質第一節DNA作為主要遺傳物質的證據一、DNA是遺傳物質的36一、DNA是遺傳物質的間接證據1.DNA含量的恒定性；2.DNA代謝的穩定性；3.基因突變與紫外線誘變波長的關系。一、DNA是遺傳物質的間接證據1.DNA含量的恒定性；37(二)、噬菌體侵染與繁殖試驗1.背景知識噬菌體侵染與繁殖基本過程：T2噬菌體浸染大腸桿菌后，遺傳物質進入細菌細胞；利用大腸桿菌的遺傳復制系統復制噬菌體遺傳物質；利用大腸桿菌的遺傳信息表達系統合成噬菌體組件；最后組裝形成完整的T2噬菌體。因此只要弄清侵染時進入細菌的是噬菌體的哪一部分，就可能證明哪種物質是遺傳信息的載體。另外：P是DNA的組成部分，但不存在于蛋白質中；S存在于蛋白質中，但DNA中沒有。(二)、噬菌體侵染與繁殖試驗1.背景知識382.Hershey和Chase的實驗(p33)2.Hershey和Chase的實驗(p33)39結果與結論試驗結果表明：主要是由于DNA進入細胞內才產生完整的噬菌體；結論：DNA才是(噬菌體的)遺傳物質。題外話：與Avery等人研究比較，本試驗的精度低得多。但是由于放射性標記法(也稱為示蹤原子法)，當時為人們普遍采用；同時由于核酸研究及其它相關的成果，本試驗結果很快得到人們的廣泛認同。結果與結論試驗結果表明：40(三)、煙草花葉病毒拆合試驗煙草花葉病毒(TMV)是由RNA與蛋白質構成的管狀微粒：中心是單鏈螺旋RNA、外部是蛋白質外殼。1.拆分感染試驗：將TMV的RNA與蛋白質分離、提純；分別接種煙葉，發現RNA能使煙葉致病，而蛋白質不能；用RNA酶處理RNA后接種煙葉也不能致病，表明RNA可能就是TMV的遺傳物質。(三)、煙草花葉病毒拆合試驗煙草花葉病毒(TMV)是由RN412.重組合試驗Frankel-Conrat,Singer(1956)進行了圖示試驗：綜上所述：到上世紀中期，多方面證據都直接或間接地表明DNA是主要的遺傳物質，而在缺乏DNA的某些病毒中RNA就是遺傳物質。2.重組合試驗Frankel-Conrat,Singe42第二節核酸的化學結構與DNA復制*一、早期對核酸化學性質的研究二、DNA的一級結構三、DNA的二級結構*四、RNA的分子結構*五、DNA的復制第二節核酸的化學結構與DNA復制*一、早期對核酸化學性質的43*一、早期對核酸化學性質的研究雖然上世紀中才認識到DNA的生物學功能，核酸研究卻已有一百多年歷史：F.Mischer(1869)從外科繃帶上膿細胞核中分離出一種不同于蛋白質的物質，含磷量高、并具有很強的酸性。他將這種物質稱核質(素)(nuclein)；A.Kossel(1879)發現酵母等核質具有A、G、T、C四種堿基；R.Altamm(1889)將核素命名為核酸(nucleicacid)。Kossel(1901)又發現核酸中具有碳水化合物(糖)；P.A.T.Levene(1909)研究表明：酵母核酸含有五碳糖——核糖；Fisher(1914)人工合成核苷酸；P.A.T.Levene(1929)又發現動物胸腺細胞核酸含有脫氧核糖.Levene將前者命名為核糖核酸(ribonucleicacid,RNA)，后者命名為脫氧核糖核酸(deoxy-ribonucleicacid,DNA)。并指出動、植物中均存在這兩種核酸。*一、早期對核酸化學性質的研究雖然上世紀中才認識到DNA的生44二、核酸的一級結構關于堿基的種類、分子式、核苷酸的種類、結構等內容是生物化學中討論的內容，請課后復習。在此談三個關于核酸一級結構的內容：(一)、“四核苷酸”假說；(二)、查伽夫定則及其意義；*(三)、核苷酸序列及其測定。二、核酸的一級結構關于堿基的種類、分子式、核苷酸的種類、結45(一)、“四核苷酸”假說P.A.T.Levene(1930)提出“四核苷酸”假說，認為：核苷酸是核酸的基本組成單位；核酸是“磷酸—核糖(堿基)—磷酸”的核苷多聚體。四核苷酸假說奠定了核酸化學基礎。但同時認為：核酸多聚體是由“四核苷酸結構”重復形成；每個四核苷酸結構包含四種堿基各一個；所以事實上認為在任何DNA中，四種堿基是等量的，DNA是四核苷酸結構的簡單重復。這種觀念影響了人們對核酸生物學功能的進一步認識。(一)、“四核苷酸”假說P.A.T.Levene(19346(二)、查伽夫定則及其意義E.Chargaff于1946-1950年根據紙層析、離子交換層析和紫外分光光度試驗結果提出查伽夫定則：四種堿基的數量不是等量的；同一物種DNA堿基組成不變，而物種間則有很大不同；嘌呤堿基總量與嘧啶堿基的總量(克分子總量)相等(A+G=T+C)，且A=T、G=C。(二)、查伽夫定則及其意義E.Chargaff于1946-47*(三)、核苷酸序列及其測定查伽夫定則表明：核酸并不是四核苷酸結構的簡單重復，核酸的堿基序列信息可能具有重要意義。以后的研究表明：堿基序列正是核酸生物學功能的基礎，是遺傳信息的內在形式。DNA及RNA分子序列分析技術也是最重要的分子遺傳學研究技術：Sanger雙脫氧法；Maxam&Gillbert化學法；基于化學法的DNA序列自動分析儀已成為常規實驗設備。*(三)、核苷酸序列及其測定查伽夫定則表明：核酸并不是四核48三、DNA的二級結構*(一)、DNA分子結構的研究1.鮑林研究小組2.威爾金斯、富蘭克林研究小組3.沃生、克里克研究小組(二)、DNA分子雙螺旋結構模型1.DNA分子雙螺旋結構模型要點2.DNA雙螺旋結構模型的意義3.DNA分子構型的多態性三、DNA的二級結構*(一)、DNA分子結構的研究49*(一)、DNA分子結構的研究在“四核苷酸結構”理論的誤導下，人們普遍認為核酸的組成、結構簡單，可能不具有重要功能，一度忽略了對核酸的研究。上世紀中期，眾多研究表明：核酸是遺傳信息的載體，顯然DNA的結構研究是進一步研究其功能和作用方式的基礎。也由此激發了科學家從事核酸結構研究的興趣，當時進行DNA結構研究的科學家很多，最重要有：*(一)、DNA分子結構的研究在“四核苷酸結構”理論的誤導下501.鮑林研究小組主要工作：鮑林(Pauling)等1951年(提出蛋白質α-螺旋模型后)開始研究DNA分子結構。根據阿斯伯利Astbury等1938年獲得的DNA分子晶體X射線衍射圖像(顯示DNA分子晶體呈螺旋結構)進行研究。提出DNA分子三鏈螺旋結構模型：引入多鏈、螺旋和氫鏈等概念。評價：雖然他們提出的模型并不正確，但是其研究方向和所采用的方法卻為DNA分子結構模型研究確立了方向。注：1954年鮑林因研究物質聚合力而獲得諾貝爾化學獎。1.鮑林研究小組主要工作：512.威爾金斯、富蘭克林研究小組主要工作成就：Wilkins和Franklin改進了DNA分子晶體X射線衍射圖譜技術；于1951年獲得了更為清晰的圖像；結果表明：

堿基位于螺旋內側而磷酸基團在外側，

同時測得了DNA螺旋的直徑和螺距。2.威爾金斯、富蘭克林研究小組主要工作成就：523.沃生、克里克研究小組Waston、Crick(1951-1953)：研究手段非常簡單：用紙板等做磷酸、核糖和堿基模型，拼湊DNA分子的三維結構。理論知識深厚、富于創造性；視野廣闊、收集信息全面并善于分析利用。3.沃生、克里克研究小組Waston、Crick(195533.沃生、克里克研究小組主要基于Chargaff、Pauling和Wilkins等三個方研究成果，Waston和Crick于1953年提出了他們的第三個DNA雙螺旋結構模型。現在人們公認這是分子遺傳學建立的標志。為此Waston，Crick和Wilkins于1962年獲得了諾貝爾生理學及醫學獎。3.沃生、克里克研究小組主要基于Chargaff、Pau541.DNA分子雙螺旋結構模型要點1.DNA分子雙螺旋結構模型要點552.DNA雙螺旋結構模型的意義DNA雙螺旋模型結構同時表明：DNA復制的明顯方式——半保留復制。Waston和Crick在1953年就指出：DNA可以按堿基互補配對原則進行半保留復制。而在此之前對復制方式人們對一無所知。基因和多肽成線性對應的一個可能的理由：DNA核苷酸順序規定該基因編碼蛋白質的氨基酸順序；DNA中的遺傳信息就是堿基序列；并存在某種遺傳密碼(geneticcode)，將核苷酸序列譯成蛋白質氨基酸順序。在其后的幾十年中，科學家們沿著這兩條途徑前進，探明了DNA復制、遺傳信息表達與中心法則等內容。2.DNA雙螺旋結構模型的意義DNA雙螺旋模型結構同時表明563.DNA分子構型的多態性3.DNA分子構型的多態性57*四、RNA的分子結構*四、RNA的分子結構58*五、DNA的復制DNA復制的起點(單起始點與多起始點)；復制的方向(單向與雙向)；復制的拓撲學；鏈的延伸(半不連續)；復制的終止；單鏈環狀DNA的復制；復制的忠實性(準確性)；復制的酶學；復制的調控。*五、DNA的復制DNA復制的起點(單起始點與多起始點)；59半保留復制半保留復制60復制叉的結構復制叉的結構61*第三節遺傳信息的表達與調控一、中心法則及其發展二、遺傳信息的轉錄(RNA的合成)

與RNA的加工三、遺傳密碼及其特性四、遺傳信息的翻譯五、基因表達調控*第三節遺傳信息的表達與調控一、中心法則及其發展62一、中心法則及其發展中心法則(centraldogma)闡述生物世代、個體以及從遺傳物質到性狀的遺傳信息流向，即遺傳信息在遺傳物質復制、性狀表現過程中的信息流向。最初由Crick提出，并經過了多次修正。一、中心法則及其發展中心法則(centraldogma)闡63中心法則的發展反轉錄(逆轉錄)：反轉錄酶；cDNA。RNA的自我復制。DNA指導蛋白質合成。中心法則的發展64三、遺傳密碼及其特性遺傳密碼的基本特性：三聯性；非重疊性；連續性；簡并性；有序性；通用性。三、遺傳密碼及其特性遺傳密碼的基本特性：65三、遺傳密碼及其特性起始密碼子與終止密碼子：起始密碼子：

AUG(甲硫氨酸/甲酰甲硫氨酸)；終止密碼子(無義密碼子)：

UAA(赭石)、UAG(琥珀)、UGA(乳白)。通用性的另外情況：三、遺傳密碼及其特性起始密碼子與終止密碼子：66第四節基因的概念與發展一、經典遺傳學中基因的概念二、生化遺傳和早期分子遺傳學對基因概念的發展三、基因的微細結構與性質四、現代分子遺傳學關于基因的概念第四節基因的概念與發展一、經典遺傳學中基因的概念67二、生化遺傳學對基因概念的發展生化遺傳及早期分子遺傳研究在兩個重要方面發展了基因的概念：基因是DNA分子上帶有遺傳信息的特定核苷酸序列區段，并且在染色體上位置固定、序列連續；遺傳信息就存在于核苷酸(堿基)序列中。“一個基因一個酶”，基因表達為蛋白質；基因的核苷酸序列決定蛋白質氨基酸序列。二、生化遺傳學對基因概念的發展生化遺傳及早期分子遺傳研究在68T4突變型(rII)遺傳研究SeymourBenzer(1955)用E.Coli烈性噬菌體T4突變型遺傳研究證明：擬等位基因的說法是不正確的。T4野生型在E.Coli菌苔上產生小而不規則噬菌斑。T4突變品系按表型可分為：rI、rII、rIII三類。其中rII在E.ColiB上產生快速溶菌現象，形成大而圓噬菌斑，在E.ColiK(λ)上不能生長。T4突變型(rII)遺傳研究SeymourBenzer(169試驗方法與結果試驗方法：最初得到8個不同的rⅡ突變型品系，8個突變基因均定位于T4DNA的一個區段內(rII區段)；將8種突變型兩兩組合混和感染E.ColiB菌株(雙重感染,doubleinfection)；從混和培養物中提取噬菌體顆粒感染E.coliK(λ)。試驗結果：在菌苔上獲得了許多小而粗糙的野生型噬菌斑。試驗方法與結果試驗方法：70雙重感染試驗雙重感染試驗71野生型的產生與基因內重組結果分析：回復突變的頻率很小，不會產生如此高頻率的野生型噬菌體(斑)；所以野生型只能由重組產生。用擬等位基因可以解釋試驗結果；但同時意味著：rII區段內至少存在8個擬等位基因。Benzer先后分離到400多個不同的rII突變。在rII區段內存在如此多的基因顯然是不可能的。結論：這些基因并不是所謂的擬等位基因，而就是rII區段突變形成的復等位基因。基因是由更小的重組單位構成，野生型產生于基因內重組，從而推翻了經典遺傳學基因不可分性的性質。野生型的產生與基因內重組結果分析：72*雙重感染法繪制rII區段連鎖圖操作方法：用兩種rII突變型雙重感染B品系，收集溶菌液；分別接種到B品系、K(λ)品系菌苔上；考察兩個品系菌苔上的噬菌斑數目，就可以計算兩個突變位點間的重組值；繪制連鎖遺傳圖。由于采用了條件致死選擇系統(即在E.ColiK(λ)上rII不能生長)，分辨率極高，可以檢測到十萬分之一的重組值。*雙重感染法繪制rII區段連鎖圖操作方法：73B品系雙重感染的結果B品系雙重感染的結果743.最小的結構單位重組值檢測精度可達十萬分之一，但實際結果不會低于0.01%；可推斷基因內存在最小重組單位，本澤爾將最小重組單位定義為重組子(recon)。rII區段存在多種突變的結構表明：基因也并非最小突變單位。Benzer提出用突變子(muton)來描述基因突變的最小單位。理論上講突變子不必等于重組子。但以后研究顯示：突變子和重組子都是一個核苷酸對或者堿基對(bp)。所以基因內每個堿基均可能發生突變，任意兩個堿基間均能發生交換重組。3.最小的結構單位重組值檢測精度可達十萬分之一，但實際結果751.雙突變雜合體的互補作用假定有兩個獨立起源的隱性突變，具有類似的表型，如何判定是屬于同一基因(功能單位)的突變還是分別屬于兩個基因(功能單位)的突變呢？在二倍體生物中，可以建立雙突變雜合體。雙突變體雜合體有兩種形式，即順式(cis)和反式(trans)，如圖所示：1.雙突變雜合體的互補作用假定有兩個獨立起源的隱性突變，具76順反測驗與順反子根據兩突變反式雙雜合體有無互補作用可以判斷它們是否為同一個功能單位的突變：突變型無互補作用為同一功能單位的突變；野生型有互補作用為不同功能單位的突變。這種測驗稱為互補測驗，也稱為順反測驗(cis-transtest)。Benzer將順反測驗所確定的最小遺傳功能單位稱為順反子(cistron)，順反子內發生的突變間不能互補。順反測驗與順反子根據兩突變反式雙雜合體有無互補作用可以判斷它77rII順反測驗rII區段突變的性質：rII突變具有共同性狀，按經典遺傳學理論，rII區段為一個基因；如果基因是最小的功能單位，它也是一個順反子。Benzer通過順反測驗表明：100多個rII突變型可以分為A、B兩組，組間突變型間能夠突變，而組內的突變型間不能互補；與rII區段連鎖圖對照發現：兩組突變分別位于rII區段的兩端|A|B|。rII順反測驗rII區段突變的性質：78rII的兩個順反子經典遺傳學意義上的一個基因(rII區段)實際上有兩個順反子(功能單位)。因此基因也很可能不是遺傳的最小功能單位。有些基因具有一個順反子，有些基因具有多個順反子。在多順反子情況下，基因是幾個功能單位的復合體。Benzer提出“一個順反子一條多肽鏈”。rII的兩個順反子經典遺傳學意義上的一個基因(rII區段)實79四、現代分子遺傳學關于基因的概念(一)、現代基因概念基因是DNA分子上帶有遺傳信息的特定核苷酸序列區段。基因由重組子、突變子序列構成的。重組子是DNA重組的最小可交換單位；突變子是產生突變的最小單位；重組子和突變子都是一個核苷酸對或堿基對(bp)。基因可以包含多個功能單位(順反子)。四、現代分子遺傳學關于基因的概念(一)、現代基因概念80(二)、基因的功能類型根據基因的原初功能可以將基因分為：1.編碼蛋白質的基因，即有翻譯產物的基因。如結構蛋白、酶等結構基因和產生調節蛋白的調節基因。2.沒有翻譯產物，不產生蛋白質的基因。轉錄產物RNA不翻譯，如編碼tRNA、rRNA。3.不轉錄的DNA區段。如啟動基因、操縱基因。啟動基因是轉錄時RNA多聚酶與DNA結合的部位。操縱基因是阻遏蛋白、激活蛋白與DNA結合的部位。(二)、基因的功能類型根據基因的原初功能可以將基因分為：81(三)、基因的幾種特殊形式1.重復基因：指在染色體組上存在多份拷貝的基因。重復基因往往是生命活動中最基本、最重要的功能相關的基因。最典型的重復基因是rRNA、tRNA和組蛋白基因等。2.重疊基因：同一段DNA序列，由于閱讀框架(轉錄范圍)不同，同時成為兩個或兩個以上基因的組成部分。因此基因在染色體上可能有重疊，甚至一個基因完全存在于另一個基因內部。(三)、基因的幾種特殊形式1.重復基因：823.斷裂基因或隔裂基因生物遺傳和早期分子遺傳認為基因是一個連續的、完整的結構。1977年Doel研究表明：卵清蛋白基因中間存在不表達的堿基序列，表明基因的DNA序列可能是不連續的。外顯子：參加蛋白質編碼的DNA片段；內含子：不參加蛋白質編碼的DNA片段。真核生物基因可能是不同外顯子的組合——斷裂基因。3.斷裂基因或隔裂基因生物遺傳和早期分子遺傳認為基因是一834.跳躍基因(jumpinggene)又稱為轉座子(transposon)、轉座因子、轉位因子(transposableelement)。生化遺傳和早期分子遺傳學還認為基因在染色體上的相對位置是固定的。后來發現某些DNA序列可以在染色體上轉變位置。轉座子轉位的過程也是一個遺傳重組過程；轉座子在染色體上轉位可能會引起插入位置基因功能喪失(突變)，再次轉位離開插入點時便會發生基因功能的恢復。4.跳躍基因(jumpinggene)又稱為轉座子(t84第五節基因突變的分子機制一、locus與site二、基因突變的類型三、DNA的防護機制四、DNA修復與突變的產生五、化學因素誘變的分子機制第五節基因突變的分子機制一、locus與site85一、locus與site經典遺傳學認為：基因是染色體上的一個點，稱位點(site)。現代基因概念認為：基因是DNA分子帶有遺傳信息的堿基序列區段；基因是由眾多堿基對構成，此時將一個堿基對稱為基因的一個位點(site)；而將基因在染色體上的位置則稱為座位(locus)。一、locus與site經典遺傳學認為：86二、基因突變的類型1.根據突變所引起的表型改變分為：形態突變型；生化突變型；致死突變型；條件致死突變型。2.根據基因結構的改變方式：堿基替換突變；堿基倒位；移碼(插入與缺失)突變。二、基因突變的類型1.根據突變所引起的表型改變分為：87二、基因突變的類型3.從DNA堿基序列改變的多少：單點突變(替換)；

與經典遺傳學的點突變pointmutation比較.多點突變(移碼)。4.從突變所引起的遺傳信息意義的改變：同義突變；錯義突變；無義突變。二、基因突變的類型3.從DNA堿基序列改變的多少：88第六節遺傳工程一、遺傳工程概述*二、染色體工程*三、細胞工程四、基因工程第六節遺傳工程一、遺傳工程概述89一、遺傳工程概述遺傳研究要闡明遺傳與變異的現象和基本規律，探索遺傳與變異的原因及其物質基礎。在此基礎上：解釋、研究生物進化的原因、過程和規律(遺傳與進化)。改善動、植物和微生物的遺傳特性——按照人類的意愿，創造、培育各種生物的新類型、新品種的人工進化過程(育種學)。育種工作的理論和技術水平在很大程度上取決于遺傳學所取得的成就。訖今為止，動、植物育種的絕大部分成就都是以經典遺傳、細胞遺傳和數量遺傳理論為基礎所取得的。六、七十年代的綠色革命；育種工作面臨的問題。一、遺傳工程概述遺傳研究要闡明遺傳與變異的現象和基本規律，90一、遺傳工程概述(一)、遺傳工程的基礎人類對自然改造的能力取決于對自然規律的認識水平。分子遺傳、生物化學及分子生物學、細胞生物學的理論和技術發展使生物遺傳操作的能力正在不斷提高。遺傳工程的理論與技術基礎主要來自于：1.分子遺傳學的理論；2.生物化學及分子生物學的成就；3.細胞生物學理論和技術。一、遺傳工程概述(一)、遺傳工程的基礎91(二)、遺傳工程的含義生物技術生物工程：遺傳工程；蛋白質工程、酶工程；微生物工程；……遺傳工程：在分子遺傳理論、技術的基礎上，通過工程設計與施工方式，從細胞、分子水平改造生物遺傳特性。作為一個綜合性的技術群體系，廣義的遺傳工程包含許多相關的組成部分，其主要的部分有三個：1.染色體工程；2.細胞工程；3.基因工程。狹義的遺傳工程指的是基因工程。(二)、遺傳工程的含義生物技術作為一個綜合性的技術群體系，92*三、細胞工程細胞工程的主要技術和研究領域包括：細胞、原生質體的分離、培養；細胞、原生質體植株再生；體細胞無性系變異的誘導、篩選與應用；以細胞、原生質體作為基因工程受體；細胞、原生質體融合、雜種細胞篩選、鑒定與應用。*三、細胞工程細胞工程的主要技術和研究領域包括：93(一)、細胞、原生質體植株再生采用體細胞雜交在物種間進行遺傳轉移與應用的必要條件是：細胞、原生質體遺傳全能性能充分實現，再生成新的生物個體。對植物而言，細胞和原生質體再生技術已經比較成熟。曾經是人們公認難題的禾本科植物原生質體再生在近二十多年來也已取得巨大進展。對動物而言，克隆羊“多利”的誕生表明：動物細胞(包括人體細胞)再生成為個體都是可能，其技術實現需要的僅僅是時間。(一)、細胞、原生質體植株再生采用體細胞雜交在物種間進行遺傳94(二)、植物原生質體作為基因工程的受體最初常用的轉基因受體有葉圓片、幼胚、愈傷組織等植物組織器官。在這些組織、器官中：細胞壁的存在會增加操作的難度；產生細胞嵌合體現象，難以篩選轉化子。因此原生質體是最具潛力的植物基因工程受體，轉化效率高、篩選方便。(二)、植物原生質體作為基因工程的受體最初常用的轉基因受體有95(三)、細胞、原生質體融合采用細胞、原生質體融合產生雜種細胞，通過誘導再生獲得雜種個體(雙二倍體)，可避免有性雜交障礙。動物細胞不具有細胞壁，細胞融合技術較植物成熟和成功。當然動物細胞融合都局限于獲得雜種細胞及其無性細胞系。可以預見：用雜種細胞核代替維爾·穆特獲得克隆羊所采用的乳腺細胞核可以獲得物種間雜種生物個體。人與小鼠雜種細胞的無性細胞系曾在人類基因染色體定位研究上發揮重要的作用。植物細胞融合由于細胞壁的存在而受到極大的限制。因此，去除細胞壁分離原生質體的技術是植物細胞雜交的基礎。獲得雜種細胞及其再生植株后，即可進行物種間細胞核、染色體以及細胞器的轉移。(三)、細胞、原生質體融合采用細胞、原生質體融合產生雜種細胞96基因工程基因工程97現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件98所謂的遺傳工程就是在分子水平上，用人工方法提取（或合成）不同生物的遺傳物質，在體外切割、拼接和重新組合。然后通過載體把重組ＤＮＡ分子引入受體細胞，使外源ＤＮＡ在受體細胞中進行復制和表達。按人們的需要生產不同的產物或定向地創造生物的新性狀，并使之穩定地遺傳給下一代。所以基因工程（geneengineering）也稱為遺傳工程（geneticengineering）、基因操作（genemanipulation）、ＤＮＡ重組技術（recombinationDNAtechniques）。有時人們還稱它為基因克隆（genecloning）或分子克隆（molecularcloning）。遺傳工程的基本操作程序大致包括：目的基因的制備，載體的選擇，體外ＤＮＡ重組，重組ＤＮＡ引入受體細胞，克隆轉化子的篩選，重組ＤＮＡ的檢測等。所謂的遺傳工程就是在分子水平上，用人工方法提99第一節基因工程的酶學基礎一、限制性核酸內切酸（restrictionendonuclease）：這類酶又簡稱為限制性內切酶或限制酶（restrictionenzyme）。限制性內切酶本來是微生物細胞中用于專門水解外源ＤＮＡ的一類酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干擾或噬菌體的感染，是細胞中的一種防御機制。根據酶的功能、大小和反應條件，及切割ＤＮＡ的特點，可以將限制性內切酶分為三類：第一節基因工程的酶學基礎100Ⅰ型酶：分子量較大，反應需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。這類酶有特異的識別位點但沒有特異的切割位點，所以在基因工程中應用不大。Ⅱ型酶：分子量較小（105Da），反應只需Mg++的存在，并且具有以下兩個特點，使這類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應用。識別位點是一個回文對稱結構，并且切割位點也在這一回文對稱結構上。許多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重組。Ⅲ型酶：這類酶可識別特定順序，并在這一順序的3’端24~26bp處切開ＤＮＡ，所以它的切割位點也是沒有特異性的。Ⅰ型酶：分子量較大，反應需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸101現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件102現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件103同裂酶（isoschizomers)：指來源不同但識別相同靶序列的核酸內切酶。同裂酶進行同樣的切割，產生同樣的末端。但有些同裂、酶對甲基化位點的敏感性不同。同尾酶（isocaudamer）：指來源不同、識別靶序列不同但產生相同的粘性末端的核酸內切酶。利用同尾酶可使切割位點的選擇余地更大。同裂酶（isoschizomers)：104限制性核酸內切酶的命名原則：第一個字母：大寫，表示所來自的微生物的屬名的第一個字母。第二、三字母：小寫，表示所來自的微生物種名的第一、二個字母。其它字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號。羅馬數字：表示該菌株發現的限制酶的編號。例：EcoRI:來自于Escheriacoli

RY13的第一個限制酶。限制性核酸內切酶的命名原則：105二、末端轉移酶（terminaltransferase）該酶全稱為末端脫氧核苷酸轉移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它所催化的反應與DNApolI相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段為引物，在３’－ＯＨ端加入核苷酸達幾百個。末端轉移酶常用于在平頭ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。

二、末端轉移酶（terminaltransferase）106現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件107平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linker）進行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約10~20個核苷酸，其結構特征是含有多種限制性核酸內切酶的酶切位點的回文結構。如：CCGGATCCGGGGCCTAGGCC將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內切酶酶切，便可產生粘性末端。這種方法的優點是克隆位點具有限制酶的酶切位點。

HpaIIHpaIIBamHI或Sau3A平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linker108三、ＤＮＡ連接酶（DNAligase）該酶常從Ｔ４噬菌體的受感細胞中提取，是由Ｔ４噬菌體基因組所編碼的，所以基因工程中常用的連接酶是Ｔ４連接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個片段以共價鍵的形式結合起來。DNA連接酶對具有粘性末端的DNA分子經退火后能很好地連接，對平末端的DNA分子也可以進行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量。三、ＤＮＡ連接酶（DNAligase）109現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件110四、反轉錄酶（reversetranscriptase）這類酶來自于反轉錄病毒，它可以ＲＮＡ為模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反轉錄酶兩種。五、DNApolI及Klenow片段該酶常用于制備放射性比度比活體標記高得多的ＤＮＡ探針，探針的制備方法是采用所謂的缺口平移（nicktranslation）法制備的。該酶還用于裂口（gap）修補、反轉錄第二條鏈的合成（Klenow）、隱蔽末端的填平反應（Klenow）等。Klenow片段：DNApolI用枯草桿菌蛋白酶水解成兩個片段，小片段（36KD）具有5’3’核酸外切酶活性，大片段（76KD）稱為Klenow片段，具有DNA鏈聚合及3’5’核酸外切酶的活性。四、反轉錄酶（reversetranscriptase）111KlenowKlenow112第二節目的基因的制備一、化學合成法：1979年Khorana首先成功地合成了tRNA基因。在體外，可以合成一系列長約幾百ｂｐ的寡聚核苷酸鏈，然后按照基因的順序將這些短的核苷酸鏈連接起來。化學合成的不足之處在于：（１）要已知基因的核苷酸順序；（２）基因不能太大，這一方面是測定核苷酸（或氨基酸）順序比較困難，另一方面是因為每次僅能合成幾百ｂｐ的短片段，短片段越多，要連接成正確的基因順序就越困難，得率越低；（３）價格昂貴。第二節目的基因的制備113化學合成的最大優點是可以合成一些分離較困難的基因。同時，所合成的基因不含內含子。在原核生物中由于不能進行內含子剪接，所以一旦將含有內含子的基因引入原核生物中表達，其產物往往是沒有活性的。由于化學合成法有上述一些優缺點，所以這種方法較多地用于合成一些比較小的基因，如某些激素基因。并也取得一些成功的例子，例如胰島素基因，生長激素釋放抑制激素基因等。由于技術的進步，目前已極少利用化學合成法制備目的基因，而是利用DNA的化學合成法合成一些短的DNA片段作為探針（probe）或PCR的引物。化學合成的最大優點是可以合成一些分離較困難的114現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件115二、從cDNA文庫或基因組文庫中分離cDNA文庫及基因組文庫的構造我們將在后面討論，如果制備好了cDNA文庫或基因組文庫，那么用原位雜交法來篩選（screening）所需要的目的基因所在的克隆子。將這一克隆子大量繁殖，提取ＤＮＡ，便可獲得所需的目的基因。必要的時候還可以建立差示文庫（differentiallibrary）。二、從cDNA文庫或基因組文庫中分離116現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件117現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件118三、ＰＣＲ法：PCR（polymerasechainreaction)技術是Mullis于1986年發明的一項體外快速大量擴增ＤＮＡ片段的方法（獲1994年諾貝爾獎）。其基本原理就是在體外模擬體內DNA復制的過程，在反應系統中加入欲被擴增的DNA片段，作為模板；人工合成的寡聚核苷酸，作為引物；耐熱的DNA聚合酶（Taq）以及四種核苷酸三磷酸。反應時，先加熱至約92℃，使模板變性。降溫至約50℃使引物與模板結合（退火），加溫至７２℃，在Taq酶作用下，使新ＤＮＡ鏈延伸。重復92℃（變性）、50℃（復性）、72℃（延伸）的過程使ＤＮＡ片段得到不斷的擴增，可以重復幾十個周期。ＤＮＡ片段將2n（ｎ為反應周期數）的倍數增加。三、ＰＣＲ法：119四、mRNA差別顯示分離目的基因根據表達特征，真核細胞的基因可以分為兩類：一是所謂的看家基因（house-keepinggene），另一類是發育調控基因（developmentalregulatedgene）。在不同的生長時期、在個體的發育與分化的不同階段、在生物體對外界環境的壓力的反應、在個體的衰老與死亡等不同的環境下發育調控基因的表達是不同的，這就是基因的差別表達（differentialexpression）。mRNA的差別顯示技術就是用來分離這些差別表達的基因的一項有用的技術。該技術是P.Liang&A.D.Pardee1992年建立的，全稱為mRNA差別顯示PCR(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionchainreaction,DDRT-PCR)四、mRNA差別顯示分離目的基因120原理：該技術是利用兩組特殊的引物對差別表達的基因進行擴增。3’端引物：利用mRNA的polyA尾巴設計。根據mRNA結構分析知道，polyA尾巴之前的兩個堿基只有12種可能的排列組合：原理：該技術是利用兩組特殊的引物對差別表達的基因進行擴增。121根據這12種排列組合，設計12種不同的引物，這樣就將所有mRNA分成了12組。這些引物由11~12個T及兩個其它的堿基組成，用通式5’-T11MN或5’-T12MN表示，M為A、G、C的任一種，N為A、G、C、T的任一種。這種引物稱錨定引物。5’端引物：5’端為10個堿基（10-mer）組成的隨機引物。每一個隨機引物都可能與總mRNA中的某一些分子發生雜交，雜交位點也可能在mRNA的不同位點上。用一種3’錨定引物和一種5’隨機引物進行擴增，可獲得50~100條100~500bp的DNA擴增帶。為了要尋找更多的DNA差異帶，應使用全部的12種錨定引物以及盡可能多的5’隨機引物。根據這12種排列組合，設計12種不同的引物，這樣就將所有mR122現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件123第三節基因工程載體載體（ｖｅｃｔｏｒ）是由在細胞中能夠自主復制的ＤＮＡ分子構成的一種遺傳成分，通過實驗手段可使其它的ＤＮＡ片段連接在它的上面，而進行復制，作為基因工程的載體，必須具備以下幾個性能：現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件124分子較小，可攜帶比較大的ＤＮＡ片段。能獨立于染色體而進行自主復制并且是高效的復制。要有盡可能多種限制酶的切割位點，但每一種限制酶又要最少的切割位點。有適合的標記，易于選擇。有時還要求載體要能啟動外源基因進行轉錄及表達，并且盡可能是高效的表達。從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉移，僅限于在某些實驗室內特殊菌種內才可復制等等。分子較小，可攜帶比較大的ＤＮＡ片段。125一、質粒（plasmid）載體質粒是一種獨立于染色體外的小分子環狀ＤＮＡ，一般大小約106~108D，可自身復制和表達，有的質粒還帶有可做為選擇性標記的抗藥性基因，所以質粒經過適當改選后便可成為良好的載體。作為載體的質粒大多是由天然質粒經人工適當改造而成的，目前已有多種經改造的良好的質粒載體。一、質粒（plasmid）載體126以Ampr和Tetr為選擇性標記，克隆位點在這兩個選擇性標記的單酶切位點上。選擇AmprTets或AmpsTetr的重組子。（4363bp）以Ampr和Tetr為選擇性標記，克隆位點在這兩個選擇性標記127pUC系列：是目前最常用的E.coli質粒載體。包括pUC7、pUC8、pUC9、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119等。優點：分子量更小，拷貝數更高：分子量在3KB左右，拷貝數可達每細胞500~700個，因此不需要氯酶素擴增。引入多克隆位點（multiplecloningsites,MCS）方便操作。引入lacZ’基因方便篩選。pUC系列：128現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件129現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件130篩選原理——α互補——蘭白篩選：LacZ’是lacZ基因的突變型，編碼半乳糖苷酶N端的146個氨基酸（全長1201氨基酸）。MCS也在這個區域內。這類載體的適合宿主細胞必須是Z基因突變型，只具有Z基因C端的序列。當兩個Z基因的突變產物在一起時可產生蛋白質間的互補，稱α互補。具有α互補的細菌培養在含IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的培養基上會形成的蘭色菌落。相反，不互補則產生白色的菌落。X-gal本身是無色的，在半乳糖苷酶的水解下產生蘭色的物質（被水解為無色的半乳糖及深蘭色的5-溴-4-氯靛蘭），因此菌落為蘭色。如果在MCS位點上插入DNA片段導致插入突變，則不能產生α互補，因此菌落是白色的。IPTG起誘導表達的作用，相當于乳糖，但它的誘導效率遠高于乳糖。篩選原理——α互補——蘭白篩選：131現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件132原核表達載體：pGEM系列包括pGEM-3、pGEM-3Z、pGEM-3Zf（-）、pGEM-4、pGEM-4Z等。帶有噬菌體編碼的RNA聚合酶啟動子SP6及T7啟動子，可用于外源基因的表達。原核表達載體：133現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件134pGEX系列：包括pGEX-1、pGEX-1λT、pGEX-2T、pGEX-3X等。該系列是一類融合表達載體，在克隆位點上游有一個谷胱甘肽巰基轉移酶（glutathioneS-transferase，GST）基因的一個片段。融合位點上有特異蛋白酶水解位點，方便GST的去除。在GST上游有一個啟動子Ptac（trp操縱子啟動子與lac操縱子啟動子的融合啟動子），在IPTG誘導下表達。pGEX系列：135現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件136現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件137二、噬菌體（bacteriumphage,phage）載體：1、λ噬菌體載體：λ噬菌體的基因組結構：二、噬菌體（bacteriumphage,phage）載體138AWBCDEFZUVGHMLKIJb2

cIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS頭部基因尾部基因功能不明區溶原化重組早期控制阻遏DNA合成溶菌生長非必須區段cI基因：溶原過程控制基因，AWBCDEFZUVGHML139現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件140插入式載體：λ噬菌體載體相對于質粒載體來說，克隆片段較大，所以一般用于cDNA文庫或基因組文庫的構建。cI基因插入失活：如λgt10、λNM1149等載體，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位點。外源基因插入后將導致cI基因的失活。cI基因失活后將導致噬菌體不能溶原化，產生清晰的噬菌斑。相反，產生混濁的噬菌斑。LacZ基因插入失活：如charon16A載體，在非必須區段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位點，插入失活后利用X-gal法篩選（蘭白篩選）。由于λ噬菌體包裝時，只包裝它的野生型DNA（48.5KB）的75%~105%左右的ＤＮＡ，所以插入式載體可攜帶的外源ＤＮＡ片段較取代式為小。

插入式載體：141現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件142cIEcoRILA32.7RA10.6λgt10

lacZLA19.9RA21.9EcoRICharon16AcIEcoRILA32.7RA10.6143取代式載體：野生型噬菌體染色體的中段對于噬菌體的感染和復制是非必要的，外源DNA可以取代這一片段，例如Charon4A、λEMBL3/4、Charon40等載體，這些載體是用Lac5（乳糖操縱子的大部分系列，包括完整的LacZ）替換入噬菌體的中間區段，同時將Lac5作為選擇標記，使用時用EcoRI水解，去掉中間的片段，再與欲克隆片段在體外進行重組、包裝。而后，感染E.coli使之在E.coli內繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。取代式載體：野生型噬菌體染色體的中段對于噬菌體的感染和復制是144Lac5EcoRIEcoRIEcoRIBanHISalISalIBamHIEcoRIMCSMCSCharon4AEMBL3/4Charon40Lac5EcoRI145（左右臂連接）（三段自身連接）（插入片段）（左右臂連接）（三段自身連接）146為避免載體自身連接產生的假陽性，可采用雙酶解的方法。例如：λEMBL4EBSSBEEBSSBE

BSBSB欲克隆片B為避免載體自身連接產生的假陽性，可采用雙酶解的方法。例如：147體外包裝：

λ噬菌體DNA體外重組后，一般必須經過體外包裝，然后以噬菌體感染的方式將重組DNA導入E.coli細胞內。這是因為以感染方式導入細胞的頻率可達106~108/μgDNA，而以轉染（translation）的方式導入的頻率僅為103~105/μgDNA。

λ噬菌體的包裝限制為野生噬菌體DNA（約48.5kb）的75%~105%。體外包裝：1482、M13噬菌體載體：M13是一種含單鍵（+）DNA（ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為6.4kb。這類載體主要用來獲得大量的單鏈ＤＮＡ片段，這種單鏈ＤＮＡ片段在遺傳學研究中主要用來測定ＤＮＡ序列（sanger雙脫氧法）、基因的定點突變研究、異源雙鏈DNA的分析等。2、M13噬菌體載體：149M13噬菌體的特點：感染Ecoli后，在宿主細胞內會形成雙鏈的復制型ＤＮＡ（replicationformDNA,RFDNA）。可以象質粒ＤＮＡ那樣在體外進行純化和操作。成熟的噬菌體顆粒僅能感染E.coli的F+細胞，這是因為這種噬菌體的感染位點在性散毛上。但是無論是RFDNA或ssDNA都能轉染E.coli的F+或F-細胞。噬菌體顆粒的大小是受其ＤＮＡ的大小制約的，這一點正好與λ噬菌體相反。所以M13噬菌體并不存在包裝限制的問題。M13噬菌體的特點：150現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件151RFDNARFDNA152現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件153三、質粒與噬菌體的重組載體：1、cosmid載體：也稱粘粒、柯撕載體。這是一類用于克隆大片段DNA的載體，它是由λ噬菌體的cos（cohesive）末端及質粒（plasmid）重組而成的載體。cosmid載體帶有質粒的復制起點、克隆位點、選擇性標記以及λ噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導入受體細胞。但它不會產生子代噬菌體，而是以質粒DNA的形式存在于細胞內。三、質粒與噬菌體的重組載體：154現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件155現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件1562、噬菌粒載體：噬菌粒（phagemidorphasmid）是由單鏈噬菌體M13或f1與質粒載體重組而成的新型載體。它具有質粒的復制起點、選擇性標記、多克隆位點等，方便DNA的操作，可在細胞內穩定存在；又具有單鏈噬菌體的復制起點，在輔助噬菌體的存在下，可進行噬菌體的繁殖，產生單鏈的子代噬菌體。2、噬菌粒載體：157現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件158現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件159四、YAC載體與YAC文庫：YAC（yeastartificialchromosome，酵母人工染色體）質粒載體是在人類基因組計劃（HGP）實施的背景下發展起來的一類克隆特大片段的載體。這類載體含有酵母菌的復制起點ARS（automaticreplicationsequence,ARS），著絲粒CEN（centromere），端粒TEL（telomere），以及選擇性標記和克隆位點；同時還含有大腸桿菌的復制起始點，可以在大腸桿菌中以環狀質粒的形式存在。DNA體外重組后以原生質體轉化的方式導入酵母細胞。這類載體克隆能力可達1~2Mb。主要用于基因組文庫的構建。四、YAC載體與YAC文庫：160現代生物學進展-現代分子生物學的若干主要進展資料課件161原核生物主要載體用途小結：載體用途質粒

λcosmidM13YAC大片段DNA克隆—++—+基因文庫構建—++—+cDNA文庫構建++———序列分析+——+—單鏈探針———+—工程菌+————原核生物主要載體用途小結：載體質162五、真核生物載體：由于真核生物與