常見NGS方案實驗流程

及問題解析常見NGS方案實驗流程

及問題解析概要常見NGS方案實驗原理及流程介紹常見問題解析Hiseq測序儀相關知識及指標概要常見NGS方案實驗原理及流程介紹2概要常見NGS方案實驗原理及流程介紹常見問題解析Hiseq測序儀相關知識及指標概要常見NGS方案實驗原理及流程介紹3基因組學研究基因組重測序未知基因組測序單細胞基因組測序表觀遺傳學研究全基因組甲基化測序MeDIP-Seq簡化甲基化測序免疫組學研究ChIP-Seq靶向區域研究全外顯子組測序靶向捕獲測序擴增子測序轉錄組學研究mRNA-Seq全轉錄組測序單細胞轉錄組組測序轉錄表達調控研究sRNA-Seq轉錄因子研究RIP-SeqDNA測序DNA文庫cDNA測序基因組學研究表觀遺傳學研究免疫組學研究靶向區域研究轉錄組學研4NGS基本流程STEP1樣本前處理STEP2文庫構建STEP3上機測序STEP4生物信息分析NGS基本流程STEP1樣本前處理STEP2文庫構建STEP5樣本前處理樣本前處理都做些什么？核酸提?。―NA/RNA)樣本類型有哪些？人，動物的血液及器官組織等。植物（根莖葉，胚芽，種子等）。微生物（細菌，真菌）。樣本前處理樣本前處理都做些什么？6DNA提取DNA提取的基本原理DNA溶于水，在鈉鹽比在水中的溶解度較大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有機溶劑。萃取沉淀DNA提取DNA提取的基本原理萃取7DNA在生物體中的存在形式DNA在細胞中常以核酸—蛋白復合體（核蛋白）形式存在。DNA在生物體中的存在形式DNA在細胞中常以核酸—蛋白復合體8DNA提取基本流程細胞破碎雜質去除沉淀DNA溶解DNADNA提取基本流程細胞破碎雜質去除沉淀DNA溶解DNA9DNA提取總原則保證核酸一級結構的完整性；排除其它分子的污染。DNA提取總原則10DNA提取方法概述人，動物組織（SDS法）人，動物全血，體液等（離心柱法）植物組織提?。–TAB法）質粒DNA（堿裂解法/離心柱法）線粒體/葉綠體DNA（SDS差速離心法）DNA提取方法概述人，動物組織（SDS法）11DNA提取方法概述人，動物組織（SDS法）人，動物全血，體液等（離心柱法）植物組織提取（CTAB法）質粒DNA（堿裂解法/離心柱法）線粒體/葉綠體DNA（SDS差速離心法）DNA提取方法概述人，動物組織（SDS法）12LysisBuffer樣本破碎細胞裂解56℃離心取上清25:24:1酚氯仿異戊醇LysisBuffer離心取上清24:1氯仿異戊醇離心取上清乙醇異丙醇70%乙醇離心離心溶解DNALysisBuffer樣本細胞56℃離心取上清25:24:13LysisBuffer（裂解緩沖液）組分Tris-HCl(pH8.0)EDTA(pH8.0)SDSProteinaseK終濃度100mM50mM1%(w/v)加樣本前加入200ug/ml加樣本前加入Tris-HCl(pH8.0)：提供堿性反應條件，防止DNA酸解。EDTA(pH8.0)：大分子螯合二價陽離子，抑制DNase活性。SDS：去垢劑，破壞細胞膜，解離核蛋白，使蛋白質變性。ProteinaseK：廣譜蛋白酶，在SDS，EDTA存在下活性很高，高效催化蛋白質降解成多肽或氨基酸，釋放DNA。LysisBuffer（裂解緩沖液）組分Tris-HClE14樣本破碎盡量選取新鮮的組織樣本，若是冷凍樣本，避免反復凍融。研磨的整個過程必須保持低溫。佩帶棉手套后必須佩帶一層PE手套，防止液氮凍傷！樣本破碎盡量選取新鮮的組織樣本，若是冷凍樣本，避免反復凍融。15細胞裂解裂解需充分材料適量，過多的材料會導致裂解不充分，從而影響后續DNA得率低，質量差。消化過程中，定時輕輕震蕩。溫度55℃-60℃都可以。必要時，可消化過夜。細胞裂解裂解需充分16去除蛋白質酚:氯仿:異戊醇（25:24:1V/V）溶液酚：（被水或Tris-HCl8.0飽和的酚）強烈的蛋白質變性劑，在初步純化時，可有效的使蛋白質變性從而去除。異戊醇：消泡劑，幫助有機分相。去除蛋白質酚:氯仿:異戊醇（25:24:1V/V）溶液17去除其他有機雜質氯仿：異戊醇（24:1V/V）氯仿：1.高效蛋白質變性劑，具有高效溶脂性，可以有效去除脂類。2.本步驟中的氯仿可以萃取微量溶解在水相中的酚。異戊醇：消泡劑，幫助有機分相。去除其他有機雜質氯仿：異戊醇（24:1V/V）18DNA沉淀完整的基因組DNA（gDNA）片段大，可以直接使用2-3倍體積乙醇或0.6-1倍體積異丙醇常溫加入并顛倒數次，即可看見成團白色沉淀。降解或片段偏小的DNA，可用預冷的乙醇或異丙醇進行沉淀，必要時可放置-20℃沉淀過夜。DNA沉淀完整的基因組DNA（gDNA）片段大，可以直接使用19鹽離子去除70%乙醇DNA不溶于乙醇，鹽離子溶解于水。鹽離子去除70%乙醇20DNA干燥本步驟必須進行！乙醇殘留會抑制PCR反應，酶反應等等。干燥時間一般控制在2-5分鐘。不能過度干燥，否則沉淀很難溶解！DNA干燥本步驟必須進行！21DNA溶解長期保存DNA，建議用TE溶解，EDTA可抑制DNase活性。若需要立刻進行建庫反應，可用水或Tris-HCl（pH8.0）溶解。如果過度干燥導致沉淀溶解困難，可放置4℃輕度震蕩過夜溶解。DNA溶解長期保存DNA，建議用TE溶解，EDTA可抑制DN22DNA質檢質檢內容：濃度、純度、完整性質檢所用方法：Qubit2.0（熒光定量雙鏈DNA技術）

Nanodrop分光光度技術（OD）DNA水平凝膠電泳DNA質檢23濃度質檢NanoDrop也可以測濃度，為什么一定要用Qubit？NanoDrop基于核酸紫外吸收原理，若有單鏈DNA，RNA或部分蛋白，脂類也會影響紫外吸收，導致定量偏高。Qubit使用的熒光染料可以特異結合雙鏈DNA，提高定量準確性。DNA純度越高，NanoDrop定量結果與Qubit定量結果的差異就越小。Qubit與PicoGreen有什么區別？都使用熒光染料定量雙鏈DNA，從使用原理上沒有根本性區別。PicoGreen可實現自動化，使用酶標儀進行定量。兩者的定量范圍相同，但Picogreen在使用低濃度標準曲線的狀態下，對極微量的樣本定量較為準確。濃度質檢24純度質檢NanoDropOD260/OD280：核酸與蛋白的吸收比值OD260/OD230：核酸與糖的吸收比值純度質檢NanoDrop25完整度檢測瓊脂糖水平凝膠電泳RNA污染完整度檢測瓊脂糖水平凝膠電泳RNA污染26DNA質檢標準濃度c≥100ng/ul總量m

≥2ugOD260/OD280：

1.8-2.0OD260/OD230＞2.0電泳圖DNA質檢標準濃度c≥100ng/ul電泳圖27文庫構建為什么要構建文庫？基因組必須要經過均一化處理之后，才能被測序儀識別。文庫可以告知測序儀從哪個堿基開始識別。必須通過文庫進行信號放大。文庫構建為什么要構建文庫？28文庫構建的總原則不能有其他外來物種污染。不能有接頭二聚體。保證基因組覆蓋完整度。擴增偏好盡量低。單個項目必須保證統一試劑，統一操作！文庫構建的總原則不能有其他外來物種污染。29基礎文庫構建流程STEP1DNA片段化STEP2末端修復加dATPSTEP3連接測序接頭STEP4PCR擴增基礎文庫構建流程STEP1DNA片段化STEP2末端修復加d30DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增打斷方法打斷范圍特點及應用CovarisSystem(AFA)100bp-500bp應用廣泛，DNA測序主流打斷方法Nebulizer400bp-800bp600bp以上文庫構建HydroShear/g-TubeHydroShear2kb以上g-Tube2kb-20kb大片段文庫構建Tn5轉座酶100bp-8kb自動化文庫構建限制性內切酶根據具體情況簡化類文庫DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增打斷方法31DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增32DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增33DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增DNA純化目的：純化目的核酸片段，清除影響后續實驗的分子污染，保證核酸純度。純化方法：1、傳統的酚/氯仿抽提優點：適用性強，尤其可以純化大片段。缺點：酚、氯仿都是對人體有害的物質；耗時長；對操作要求高2、借助某些介質吸附柱離心法：純度達到80%以上；方便、快捷。磁珠：磁珠表面包被、修飾，捕獲特定的DNA片段，分離不用離心，容易集成到生物芯片上，實現樣品處理自動化和微型化。3、凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳膠回收、PAGE凝膠電泳等。在電泳后需要切膠回收，應用方法一或方法二。DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增DNA純34DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增DNA純化目的：純化目的核酸片段，清除影響后續實驗的分子污染，保證核酸純度。純化方法：1、傳統的酚/氯仿抽提優點：適用性強，尤其可以純化大片段。缺點：酚、氯仿都是對人體有害的物質；耗時長；對操作要求高2、借助某些介質：純度達到80%以上；方便、快捷。磁珠：磁珠表面包被、修飾，捕獲特定的DNA片段，分離不用離心，容易集成到生物芯片上，實現樣品處理自動化和微型化。3、凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳膠回收、PAGE凝膠電泳等。在電泳后需要切膠回收，應用方法一或方法二。吸附柱離心法DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增DNA純35DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增吸附柱離心法原理吸附膜主要成分硅膠、纖維，又稱硅膠膜、硅膠柱。硅膠是一種多孔性物質，分子中具有硅氧烷的交鏈結構，而硅氧烷分子含有硅醇基，其含量與其核酸的結合能力有關。在高鹽、低PH值條件下，硅膠表面上的硅醇基釋放出氫離子，通過高鹽溶液中的陽離子與DNA的磷酸基團結合，DNA被吸附在硅膠膜上；相反在低鹽、高PH值的條件下就會釋放出DNA。純化三原則：?不能混淆樣本?不能污染樣本、試劑?省時、省物DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增吸附柱離36DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增不要忘記加乙醇！DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增不要忘記37DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增純化步驟片段化DNA實驗準備結合洗滌空轉環吸及晾干洗脫10min50minDNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增純化步驟38實驗準備清理桌面準備試劑及耗材離心管準備及標注：取吸附柱和離心管需用鑷子。標注原則：名稱要與待純化樣本完全相同，并且純化后需標注“已純化”類似字樣，以便區分。標注要求：管蓋及管壁均標注，且寫在磨砂處。實驗準備清理桌面39樣本結合操作方法：加入5倍體積結合液PB混勻，轉入吸附柱中，靜置1min操作要求：分別轉移樣品或者懸空滴加PB盡量一個樣本使用1個槍頭多次轉移時，注意樣本間交叉污染切記靜置1min！

樣本結合操作方法：40過柱及棄廢液8000rpm，30sec倒廢液：倒前準備吸水紙；切勿伸入廢液瓶；沾液時不同樣品管切勿使用同一位置。離心力不可過大！×√過柱及棄廢液8000rpm，30sec倒廢液：倒前準備吸水紙41洗滌操作方法：加入740mlPW溶液8000rpm，30sec倒廢液（要求同前）操作要求：

懸空滴加盡量只使用1個槍頭槍頭一旦觸碰樣本，立刻棄掉，嚴禁污染試劑！×√洗滌操作方法：操作要求：槍頭一旦觸碰樣本，立刻棄掉，嚴禁污染42空轉、環吸及晾干操作方法：12000rpm，空轉3min環吸后晾干3min操作要求：1.環吸方法：用小槍頭對準管壁的余液，旋轉槍頭吸干余液。2.不可過度晾干！空轉、環吸及晾干操作方法：43洗脫操作方法：加入

EB（ElutionBuffer）靜置5min（55℃孵育可提高回收率）

12000rpm，2min操作要求：EB加在膜中央，加入后，環、壁上均無液體在棄管前做最后核對，以免串樣洗脫操作方法：44為什么要進行末端修復？隨機打斷后的DNA一般都會產生不規則的末端，無法直接進行測序接頭連接，因此需要進行末端修復。為什么要加dATP？為了提高連接效率，所以在測序接頭的3’端加1個dTTP，與Insert的dATP互補。DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增為什么要進行末端修復？DNA片段化末端修復加dATP連接測序45DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增基因組DNA打斷平端5’端突出3’端突出5’端突出3’端突出DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增基因組D46DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增基因組DNA打斷平端5’端突出3’端突出5’端突出3’端突出T4DNA聚合酶T4DNA聚合酶DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增基因組D47DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增已補平DNADNA磷酸化激酶PPAATaq聚合酶磷酸化的目的填補連接缺口，提高連接效率本步驟溫控程序25℃30min72℃20minPPDNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增已補平D48DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增Illumina接頭Rd1SeqPrimerP5Rd2SeqPrimerIndexP7Y型接頭的目的

減少接頭自連的可能性！TPDNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增Illu49DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增T4DNA連接酶TPPT連接溫控條件22℃1hr連接反應需注意：反應時間不可過長。測序接頭要足量。DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增T4D50DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增連接反應后必須純化的理由去除接頭二聚體（128bp）篩選合適的片段大小純化方法可選電泳+切膠篩選+膠回收2.磁珠純化并篩選大小DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增連接反應51DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增電泳2%瓊脂糖凝膠，100V1.5h同時選擇多個片段大小膠回收（Qiagen離心柱法）DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增電泳52DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增電泳的優點1.成本低。2.可同時篩選多個大小。3.篩選范圍可控，靈敏。電泳的缺點1.不可自動化。2.小分子在分子遷移過程中易殘留。3.DNA紫外燈下暴露易發生損傷。4.操作時間長。DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增電泳的優53DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增磁珠AmpureXPBeads(BeckmanCoulter）DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增磁珠A54DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增磁珠兩步結合法篩選DNA片段大小DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增磁珠兩步55DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增磁珠的優點1.可自動化，可重復性高。2.操作時間短。3.回收率高。4.可以高效去除小片段。磁珠的缺點1.成本高。2.篩選范圍偏寬，不適合片段要求窄的文庫構建。3.很難同時篩選多個大小。DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增磁珠的優56DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增PCR擴增P5P5P7P795℃DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增PCR擴57DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增PCR擴增P5P5P7P795℃P5P7P5P7DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增PCR擴58DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增P5P5P7P765℃P5primerP7primerDNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增P5P559DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增P5P5P7P755℃P5primerP7primer72℃DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增P5P560DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增P5P5P7P755℃P5primerP7primer72℃P5P5P7P7Rd1SPRd1SPRd2SPIndexRd2SPIndexDNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增P5P561DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增必須嚴格控制PCR循環數！過度PCR只會帶來差的測序數據！如果文庫濃度不夠，是不是可以多做幾個PCR循環？DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增必須嚴格62DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增63文庫質檢一個好的文庫應該符合哪些標準？完全沒有接頭二聚體和引物二聚體。峰型呈正態分布，并在期望范圍內。濃度滿足上機需要即可，沒有特別要求。不可出現過度PCR的大片段。文庫質檢一個好的文庫應該符合哪些標準？64文庫質檢常見文庫2100質檢圖文庫質檢常見文庫2100質檢圖65質量差的文庫引物二聚體接頭二聚體文庫過度PCR只占比50%！質量差的文庫引物二聚體接頭二聚體文庫過度PCR只占比50%！66基因組學研究全基因組重測序（WGRS）未知基因組測序（DeNovo）單細胞基因組測序（SingleCell）基因組學研究全基因組重測序（WGRS）67基因組學研究全基因組重測序（WGRS）未知基因組測序（DeNovo）單細胞基因組測序（SingleCell）研究對象：有參考基因組的物種。研究方法：建庫：最基本的DNA文庫構建方法。測序方案：個體測序一般30X，種群測序一般6X基因組學研究全基因組重測序（WGRS）研究對象：68基因組學研究全基因組重測序（WGRS）未知基因組測序（DeNovo）單細胞基因組測序（SingleCell）研究對象：無參考基因組的物種，物種的種群最好不要過大。研究方法：建庫：基本DNA文庫，長片段（Mate-Pair)文庫，必要時需要構建Fosmid或BAC文庫。測序方案：按照文庫長度遞增?；蚪M學研究全基因組重測序（WGRS）研究對象：69DeNovo大致流程DeNovo大致流程70基因組學研究全基因組重測序（WGRS）未知基因組測序（DeNovo）單細胞基因組測序（SingleCell）研究對象：主要是人的1個或者幾個細胞或者極少量DNA研究方法：建庫：單細胞擴增（MALBAC）+基本DNA文庫測序方案：全基因組測序30X基因組學研究全基因組重測序（WGRS）研究對象：71為何選擇MALBAC？檢驗方法：采用9對持家基因對擴增產物進行qPCRMALBAC與MDA各做3個生物學重復為何選擇MALBAC？檢驗方法：72靶向區域研究全外顯子組測序靶向捕獲測序擴增子測序靶向區域研究全外顯子組測序73靶向區域研究全外顯子組測序（WholeExomeSequencing）靶向捕獲測序擴增子測序研究對象：主要是人，Roche芯片現有一些特殊物種。研究方法：建庫：基本DNA文庫+外顯子雜交芯片捕獲測序方案：100X靶向區域研究全外顯子組測序研究對象：74雜交平臺探針攜帶生物素標記。捕獲富集的片段用親和鏈霉素磁珠進行篩選。RocheV3.064MbAgilentV554Mb雜交平臺探針攜帶生物素標記。75外顯子基本研究策略NatureGenetics，2009外顯子基本研究策略NatureGenetics，200976靶向區域研究全外顯子組測序靶向捕獲測序（TargetSequencing）擴增子測序研究對象：主要是人，捕獲用的探針是根據自身需要訂制的。研究方法：建庫：基本DNA文庫+訂制探針雜交芯片捕獲測序方案：200X以上比外顯子測序所需數據量更少，大幅提高測序深度，降低測序成本！靶向區域研究全外顯子組測序研究對象：比外顯子測序所需數據量更77靶向區域研究全外顯子組測序靶向捕獲測序擴增子測序（Amplicon）研究對象：主要是人，使用擴增特異性引物擴增目的片段。研究方法：建庫：擴增目的區域+DNA建庫測序方案：200X以上通量較小，適合幾個基因或較少位點的研究。PCR容易引入人為錯配，增加分析噪音。靶向區域研究全外顯子組測序研究對象：通量較小，適合幾個基因或78表觀遺傳學研究全基因組甲基化測序（BS-Seq）MeDIP-Seq簡化甲基化測序（RRBS）表觀遺傳學研究全基因組甲基化測序（BS-Seq）79表觀遺傳學研究全基因組甲基化測序（BS-Seq）MeDIP-Seq簡化甲基化測序（RRBS）研究對象：主要是人，人源細胞等。研究方法：建庫：DNA建庫+重亞硫酸鹽處理測序方案：30X以上表觀遺傳學研究全基因組甲基化測序（BS-Seq）研80表觀遺傳學研究全基因組甲基化測序（BS-Seq）MeDIP-Seq簡化甲基化測序（RRBS）研究對象：主要是人，人源細胞等。研究方法：建庫：DNA建庫+5mC抗體包被磁珠處理測序方案：50X以上表觀遺傳學研究全基因組甲基化測序（BS-Seq）研究對象：81表觀遺傳學研究全基因組甲基化測序（BS-Seq）MeDIP-Seq簡化甲基化測序（RRBS）研究對象：主要是人，小鼠，大鼠。研究方法：建庫：MspI酶切+DNA建庫+重亞硫酸鹽處理測序方案：50X以上表觀遺傳學研究全基因組甲基化測序（BS-Seq）研究對象：82免疫組學研究ChIP-Seq（染色質免疫共沉淀測序）

研究對象：主要是人，人源細胞等。研究方法：建庫：染色質免疫共沉淀+DNA建庫測序方案：50X以上免疫組學研究ChIP-Seq（染色質免疫共沉淀測序）

研究對83轉錄組學研究mRNA-Seq全轉錄組測序單細胞轉錄組組測序轉錄組學研究mRNA-Seq84轉錄組學研究mRNA-Seq全轉錄組測序單細胞轉錄組組測序研究對象：所有真核生物，沒有特別限制的物種。研究方法：建庫：mRNA富集+反轉錄+DNA建庫測序方案：100X以上轉錄組學研究mRNA-Seq研究對象：85轉錄組學研究mRNA-Seq全轉錄組測序（去除rRNA，包括原核生物）研究對象：原核生物，人源微生物，人，小鼠，大鼠，植物。研究方法：建庫：去除rRNA+反轉錄+DNA建庫測序方案：100X以上轉錄組學研究mRNA-Seq研究對象：86轉錄組測序RiboMinus?/Ribo-zeroLifeTech/EpicentreRibo-ZeroORRiboMinus?WO2011/019993PCT/US2010/045437全轉錄組測序√轉錄組測序RiboMinus?/Ribo-zeroRibo87轉錄組學研究mRNA-Seq全轉錄組測序單細胞轉錄組組測序研究對象：主要是人，人源細胞。研究方法：建庫：SMART技術+DNA建庫測序方案：100X以上轉錄組學研究mRNA-Seq研究對象：88轉錄表達調控研究sRNA-Seq研究對象：主要為人，小鼠，大鼠。研究方法：建庫：小RNA建庫技術測序方案：100X以上轉錄表達調控研究sRNA-Seq研究對象：89轉錄因子研究RIP-Seq（RNA免疫共沉淀測序）研究對象：主要為人源細胞。研究方法：建庫：RIP+RNA反轉錄+DNA建庫測序方案：100X以上轉錄因子研究RIP-Seq（RNA免疫共沉淀測序）研究對象：90HaveABreak!HaveABreak!91概要常見NGS方案實驗原理及流程介紹常見問題解析Hiseq測序儀相關知識及指標概要常見NGS方案實驗原理及流程介紹92DNA提取中的常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續酶解和PCR反應。原因1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質2.DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續酶解反應3.DNA中殘留有金屬離子

解決方案1.重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質2.重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發3.增加70％乙醇洗滌的次數（2-3次）

DNA提取中的常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續酶解和93DNA提取中的常見問題問題二：DNA降解。原因1.材料不新鮮或反復凍融2.未很好抑制內源核酸酶的活性3.提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷4.外源核酸酶污染

解決方案1.盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融2.液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前加入裂解緩沖液3.細胞裂解后的后續操作應盡量輕柔4.所有試劑用無菌水配制，耗材經高溫滅菌

DNA提取中的常見問題問題二：DNA降解。原因1.材料不新94問題三：DNA量太少DNA提取中的常見問題原因1.實驗材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4.洗滌時DNA丟失

解決方案1.盡量選用新鮮（幼嫩）的材料2.動植物要勻漿研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁3.裂解時，時間延長，可過夜4.低溫沉淀，延長沉淀時間5.加輔助物，促進沉淀6.洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒DNA提取遇到的問題，大多數都來自于裂解不完全！問題三：DNA量太少DNA提取中的常見問題原因1.實驗材料不95文庫構建的常見問題DNA片段化問題DNA量過大DNA質量差溶解buffer粘稠度過高Covaris使用不當原因解決每次打斷不超過10ug嚴格執行DNA質檢標準使用水或TE溶解DNA循環水位應在8以上循環水溫度應在4-8℃開啟機器后，需排氣30min以上文庫構建的常見問題DNA片段化問題DNA量過大原因解決每次打96問題一：打斷DNA之后純化產物濃度過低文庫構建的常見問題原因DNA初始定量出錯使用Nanodrop進行DNA初始定量。純化步驟中操作錯誤。解決方案1.使用Qubit定量樣本前，同一項目樣本必須重做標準品。2.濃度過高的樣本，需要稀釋后定量。3.檢查Qubit標準品的檢測值是否在正常范圍。4.初始DNA定量必須使用熒光定量方法(Qubit/Picogreen/qPCR)5.PW液在使用前沒有加乙醇。6.洗滌液和結合液混淆。問題一：打斷DNA之后純化產物濃度過低文庫構建的常見問題原因97問題二：連接測序接頭后純化無產物文庫構建的常見問題原因磁珠使用不當。切膠純化時，操作失誤。解決方案1.磁珠使用前必須放置在室溫下預熱半小時以上。2.80%乙醇必須新鮮配置。3.磁珠洗脫液一定要使用EB或者RSB，不可用水。4.膠塊沒有完全溶解。5.PW液沒有加乙醇就使用。6.PW和PB混淆。7.磁珠干燥時間過長。問題二：連接測序接頭后純化無產物文庫構建的常見問題原因磁珠使98問題三：構建出的文庫有接頭二聚體。文庫構建的常見問題原因連接反應時間過長。連接反應用的接頭量過大。連接反應時DNA量已經很少。跑膠進行片段篩選前沒有用磁珠純化。磁珠純化比例錯誤。解決方案1.連接反應時間必須嚴格控制。2.連接反應必須終止，可以采用熱終止或EDTA。3.接頭量必須嚴格控制，如果DNA量過少，必須減少接頭用量。4.跑膠前必須先用磁珠1:1進行純化。5.磁珠純化比例為DNA：磁珠=1:1或者可以適當減少磁珠用量，切勿增大！問題三：構建出的文庫有接頭二聚體。文庫構建的常見問題原因連接99文庫構建的常見問題打斷的DNA300bp文庫740bp問題四：連接產生了嵌合體(crossmapping)根本原因：連接導致！連接溫度過高。連接反應時間過長。接頭過少。某些AT極端偏好的物種。解決方法：嚴格控制連接反應時間和溫度。定期檢查接頭濃度，接頭一定要足量。打斷DNA后增加篩選大小步驟。采取一些有針對性的建庫手段。文庫構建的常見問題打斷的DNA300bp文庫740bp問題四100問題四：文庫后不正常的大片段？文庫構建的常見問題原因：連接反應時間過長。PCR循環過多！磁珠篩選時操作不當。解決方法：嚴格控制連接反應時間和溫度。PCR循環一定要嚴格遵守操作規則。磁力架磁力不足，磁珠容易掉落。反應產物過多，磁珠偏少。問題四：文庫后不正常的大片段？文庫構建的常見問題原因：解決方101一些較差的文庫示例操作不當是導致文庫構建失敗最根本的原因！一些較差的文庫示例操作不當是導致文庫構建失敗最根本的原因！102概要常見NGS方案實驗原理及流程介紹常見問題解析Hiseq測序儀相關知識及指標概要常見NGS方案實驗原理及流程介紹103Solexa測序原理Solexa測序原理104準備DNA片段兩端接上adapters將DNA片段通過adapter錨定在芯片上循環擴增DNA片段成“DNA簇”20micronsSequenceCluster形成準備DNA片段兩端接上adapters將DNA片段通過ad105可逆終止反應

ReversibleTerminatorChemistry

OPPPHNNOO熒光基團3’保護基團Nextcycle摻入檢測去保護基團去熒光基團ODNAHNNOO3’O5’游離3‘末端XOH4種標記過的核苷酸測序可逆終止反應

ReversibleTerminatorC106Sequencing-by-Synthesis(SBS)

5’GTCAGTCAGTCAGT3’5’CAGTCATCACCTAGCGTA

摻入一個堿基Cycle1: 加入反應體系

移除其他未摻入的核苷酸

信號檢測Cycle2-n:加入反應體系，循環cycle11、每輪測序反應加入四種帶有熒光標記的dNTP，末端帶有可以被去除的保護基團2、每輪反應只能整合一個核苷酸，儀器讀取相應的熒光信號3、信號讀取結束，用化學方法去除阻斷基團和熒光基團，進行下一輪測序反應測序Sequencing-by-Synthesis(SBS)

107123789456TTTTTTT

G

T…T

G

C

T

A

C

G

A

T…根據每個DNA簇每輪反應讀取的熒光信號序列，轉換成相應的DNA序列通過熒光信號分析核苷酸序列測序123789456TTTTTTTGT…T108測序種類Single-ReadSequencing(SR)測序種類Single-ReadSequencing(SR)109測序種類Single-ReadSequencing(SR)測序種類Single-ReadSequencing(SR)110測序種類Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)測序種類Single-ReadSequencing(SR)111測序種類Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)測序種類Single-ReadSequencing(SR)112測序種類Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)IndexSequencing(PE)測序種類Single-ReadSequencing(SR)113測序種類Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)IndexSequencing(PE)測序種類Single-ReadSequencing(SR)114測序種類Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)IndexSequencing(PE)√測序種類Single-ReadSequencing(SR)115Hiseq2500Hiseq25001161個flowcell8個lane2個flowcell1個flowcell2個flowcell117Hiseq2500的關鍵系統光路系統(OpticalSystem)流路系統(FluidicsSystem)溫控系統(TemperatureControlSystem)Hiseq2500的關鍵系統光路系統(OpticalSys118光路系統紅色激光：A，C綠色激光：G，T其中G堿基信號最弱光路系統紅色激光：A，C119常見的光路問題Autotilt正常異常常見的光路問題Autotilt正常異常120Focus常見的光路問題正常異常Focus常見的光路問題正常異常121流路系統流路系統122常見的流路問題氣泡異常常見的流路問題氣泡異常123溫控系統Flowcell溫控Hiseq冷卻系統試劑溫控溫控系統Flowcell溫控Hiseq冷卻系統試劑溫控124常見的溫控問題常見的溫控問題125如何監控1個run？SAV（SequencingAnalysisViewer)如何監控1個run？SAV（SequencingAnaly126SAV所需文件InterOp（文件夾）RunInfo.xmlrunParameters.xmlSAV所需文件InterOp（文件夾）127常見NGS方案實驗流程及常見問題解析-講義課件128常見NGS方案實驗流程及常見問題解析-講義課件129常見NGS方案實驗流程及常見問題解析-講義課件130測序質量差常見因素匯總文庫質量差！測序信號低激光器問題濾光片偏移前4個堿基不均勻測序噪音高流路臟溫控問題測序質量差常見因素匯總文庫質量差！測序信號低激光器問題濾光片131QuestionQuestion132常見NGS方案實驗流程

及問題解析常見NGS方案實驗流程

及問題解析概要常見NGS方案實驗原理及流程介紹常見問題解析Hiseq測序儀相關知識及指標概要常見NGS方案實驗原理及流程介紹134概要常見NGS方案實驗原理及流程介紹常見問題解析Hiseq測序儀相關知識及指標概要常見NGS方案實驗原理及流程介紹135基因組學研究基因組重測序未知基因組測序單細胞基因組測序表觀遺傳學研究全基因組甲基化測序MeDIP-Seq簡化甲基化測序免疫組學研究ChIP-Seq靶向區域研究全外顯子組測序靶向捕獲測序擴增子測序轉錄組學研究mRNA-Seq全轉錄組測序單細胞轉錄組組測序轉錄表達調控研究sRNA-Seq轉錄因子研究RIP-SeqDNA測序DNA文庫cDNA測序基因組學研究表觀遺傳學研究免疫組學研究靶向區域研究轉錄組學研136NGS基本流程STEP1樣本前處理STEP2文庫構建STEP3上機測序STEP4生物信息分析NGS基本流程STEP1樣本前處理STEP2文庫構建STEP137樣本前處理樣本前處理都做些什么？核酸提?。―NA/RNA)樣本類型有哪些？人，動物的血液及器官組織等。植物（根莖葉，胚芽，種子等）。微生物（細菌，真菌）。樣本前處理樣本前處理都做些什么？138DNA提取DNA提取的基本原理DNA溶于水，在鈉鹽比在水中的溶解度較大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有機溶劑。萃取沉淀DNA提取DNA提取的基本原理萃取139DNA在生物體中的存在形式DNA在細胞中常以核酸—蛋白復合體（核蛋白）形式存在。DNA在生物體中的存在形式DNA在細胞中常以核酸—蛋白復合體140DNA提取基本流程細胞破碎雜質去除沉淀DNA溶解DNADNA提取基本流程細胞破碎雜質去除沉淀DNA溶解DNA141DNA提取總原則保證核酸一級結構的完整性；排除其它分子的污染。DNA提取總原則142DNA提取方法概述人，動物組織（SDS法）人，動物全血，體液等（離心柱法）植物組織提?。–TAB法）質粒DNA（堿裂解法/離心柱法）線粒體/葉綠體DNA（SDS差速離心法）DNA提取方法概述人，動物組織（SDS法）143DNA提取方法概述人，動物組織（SDS法）人，動物全血，體液等（離心柱法）植物組織提?。–TAB法）質粒DNA（堿裂解法/離心柱法）線粒體/葉綠體DNA（SDS差速離心法）DNA提取方法概述人，動物組織（SDS法）144LysisBuffer樣本破碎細胞裂解56℃離心取上清25:24:1酚氯仿異戊醇LysisBuffer離心取上清24:1氯仿異戊醇離心取上清乙醇異丙醇70%乙醇離心離心溶解DNALysisBuffer樣本細胞56℃離心取上清25:24:145LysisBuffer（裂解緩沖液）組分Tris-HCl(pH8.0)EDTA(pH8.0)SDSProteinaseK終濃度100mM50mM1%(w/v)加樣本前加入200ug/ml加樣本前加入Tris-HCl(pH8.0)：提供堿性反應條件，防止DNA酸解。EDTA(pH8.0)：大分子螯合二價陽離子，抑制DNase活性。SDS：去垢劑，破壞細胞膜，解離核蛋白，使蛋白質變性。ProteinaseK：廣譜蛋白酶，在SDS，EDTA存在下活性很高，高效催化蛋白質降解成多肽或氨基酸，釋放DNA。LysisBuffer（裂解緩沖液）組分Tris-HClE146樣本破碎盡量選取新鮮的組織樣本，若是冷凍樣本，避免反復凍融。研磨的整個過程必須保持低溫。佩帶棉手套后必須佩帶一層PE手套，防止液氮凍傷！樣本破碎盡量選取新鮮的組織樣本，若是冷凍樣本，避免反復凍融。147細胞裂解裂解需充分材料適量，過多的材料會導致裂解不充分，從而影響后續DNA得率低，質量差。消化過程中，定時輕輕震蕩。溫度55℃-60℃都可以。必要時，可消化過夜。細胞裂解裂解需充分148去除蛋白質酚:氯仿:異戊醇（25:24:1V/V）溶液酚：（被水或Tris-HCl8.0飽和的酚）強烈的蛋白質變性劑，在初步純化時，可有效的使蛋白質變性從而去除。異戊醇：消泡劑，幫助有機分相。去除蛋白質酚:氯仿:異戊醇（25:24:1V/V）溶液149去除其他有機雜質氯仿：異戊醇（24:1V/V）氯仿：1.高效蛋白質變性劑，具有高效溶脂性，可以有效去除脂類。2.本步驟中的氯仿可以萃取微量溶解在水相中的酚。異戊醇：消泡劑，幫助有機分相。去除其他有機雜質氯仿：異戊醇（24:1V/V）150DNA沉淀完整的基因組DNA（gDNA）片段大，可以直接使用2-3倍體積乙醇或0.6-1倍體積異丙醇常溫加入并顛倒數次，即可看見成團白色沉淀。降解或片段偏小的DNA，可用預冷的乙醇或異丙醇進行沉淀，必要時可放置-20℃沉淀過夜。DNA沉淀完整的基因組DNA（gDNA）片段大，可以直接使用151鹽離子去除70%乙醇DNA不溶于乙醇，鹽離子溶解于水。鹽離子去除70%乙醇152DNA干燥本步驟必須進行！乙醇殘留會抑制PCR反應，酶反應等等。干燥時間一般控制在2-5分鐘。不能過度干燥，否則沉淀很難溶解！DNA干燥本步驟必須進行！153DNA溶解長期保存DNA，建議用TE溶解，EDTA可抑制DNase活性。若需要立刻進行建庫反應，可用水或Tris-HCl（pH8.0）溶解。如果過度干燥導致沉淀溶解困難，可放置4℃輕度震蕩過夜溶解。DNA溶解長期保存DNA，建議用TE溶解，EDTA可抑制DN154DNA質檢質檢內容：濃度、純度、完整性質檢所用方法：Qubit2.0（熒光定量雙鏈DNA技術）

Nanodrop分光光度技術（OD）DNA水平凝膠電泳DNA質檢155濃度質檢NanoDrop也可以測濃度，為什么一定要用Qubit？NanoDrop基于核酸紫外吸收原理，若有單鏈DNA，RNA或部分蛋白，脂類也會影響紫外吸收，導致定量偏高。Qubit使用的熒光染料可以特異結合雙鏈DNA，提高定量準確性。DNA純度越高，NanoDrop定量結果與Qubit定量結果的差異就越小。Qubit與PicoGreen有什么區別？都使用熒光染料定量雙鏈DNA，從使用原理上沒有根本性區別。PicoGreen可實現自動化，使用酶標儀進行定量。兩者的定量范圍相同，但Picogreen在使用低濃度標準曲線的狀態下，對極微量的樣本定量較為準確。濃度質檢156純度質檢NanoDropOD260/OD280：核酸與蛋白的吸收比值OD260/OD230：核酸與糖的吸收比值純度質檢NanoDrop157完整度檢測瓊脂糖水平凝膠電泳RNA污染完整度檢測瓊脂糖水平凝膠電泳RNA污染158DNA質檢標準濃度c≥100ng/ul總量m

≥2ugOD260/OD280：

1.8-2.0OD260/OD230＞2.0電泳圖DNA質檢標準濃度c≥100ng/ul電泳圖159文庫構建為什么要構建文庫？基因組必須要經過均一化處理之后，才能被測序儀識別。文庫可以告知測序儀從哪個堿基開始識別。必須通過文庫進行信號放大。文庫構建為什么要構建文庫？160文庫構建的總原則不能有其他外來物種污染。不能有接頭二聚體。保證基因組覆蓋完整度。擴增偏好盡量低。單個項目必須保證統一試劑，統一操作！文庫構建的總原則不能有其他外來物種污染。161基礎文庫構建流程STEP1DNA片段化STEP2末端修復加dATPSTEP3連接測序接頭STEP4PCR擴增基礎文庫構建流程STEP1DNA片段化STEP2末端修復加d162DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增打斷方法打斷范圍特點及應用CovarisSystem(AFA)100bp-500bp應用廣泛，DNA測序主流打斷方法Nebulizer400bp-800bp600bp以上文庫構建HydroShear/g-TubeHydroShear2kb以上g-Tube2kb-20kb大片段文庫構建Tn5轉座酶100bp-8kb自動化文庫構建限制性內切酶根據具體情況簡化類文庫DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增打斷方法163DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增164DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增165DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增DNA純化目的：純化目的核酸片段，清除影響后續實驗的分子污染，保證核酸純度。純化方法：1、傳統的酚/氯仿抽提優點：適用性強，尤其可以純化大片段。缺點：酚、氯仿都是對人體有害的物質；耗時長；對操作要求高2、借助某些介質吸附柱離心法：純度達到80%以上；方便、快捷。磁珠：磁珠表面包被、修飾，捕獲特定的DNA片段，分離不用離心，容易集成到生物芯片上，實現樣品處理自動化和微型化。3、凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳膠回收、PAGE凝膠電泳等。在電泳后需要切膠回收，應用方法一或方法二。DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增DNA純166DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增DNA純化目的：純化目的核酸片段，清除影響后續實驗的分子污染，保證核酸純度。純化方法：1、傳統的酚/氯仿抽提優點：適用性強，尤其可以純化大片段。缺點：酚、氯仿都是對人體有害的物質；耗時長；對操作要求高2、借助某些介質：純度達到80%以上；方便、快捷。磁珠：磁珠表面包被、修飾，捕獲特定的DNA片段，分離不用離心，容易集成到生物芯片上，實現樣品處理自動化和微型化。3、凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳膠回收、PAGE凝膠電泳等。在電泳后需要切膠回收，應用方法一或方法二。吸附柱離心法DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增DNA純167DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增吸附柱離心法原理吸附膜主要成分硅膠、纖維，又稱硅膠膜、硅膠柱。硅膠是一種多孔性物質，分子中具有硅氧烷的交鏈結構，而硅氧烷分子含有硅醇基，其含量與其核酸的結合能力有關。在高鹽、低PH值條件下，硅膠表面上的硅醇基釋放出氫離子，通過高鹽溶液中的陽離子與DNA的磷酸基團結合，DNA被吸附在硅膠膜上；相反在低鹽、高PH值的條件下就會釋放出DNA。純化三原則：?不能混淆樣本?不能污染樣本、試劑?省時、省物DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增吸附柱離168DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增不要忘記加乙醇！DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增不要忘記169DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增純化步驟片段化DNA實驗準備結合洗滌空轉環吸及晾干洗脫10min50minDNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增純化步驟170實驗準備清理桌面準備試劑及耗材離心管準備及標注：取吸附柱和離心管需用鑷子。標注原則：名稱要與待純化樣本完全相同，并且純化后需標注“已純化”類似字樣，以便區分。標注要求：管蓋及管壁均標注，且寫在磨砂處。實驗準備清理桌面171樣本結合操作方法：加入5倍體積結合液PB混勻，轉入吸附柱中，靜置1min操作要求：分別轉移樣品或者懸空滴加PB盡量一個樣本使用1個槍頭多次轉移時，注意樣本間交叉污染切記靜置1min！

樣本結合操作方法：172過柱及棄廢液8000rpm，30sec倒廢液：倒前準備吸水紙；切勿伸入廢液瓶；沾液時不同樣品管切勿使用同一位置。離心力不可過大！×√過柱及棄廢液8000rpm，30sec倒廢液：倒前準備吸水紙173洗滌操作方法：加入740mlPW溶液8000rpm，30sec倒廢液（要求同前）操作要求：

懸空滴加盡量只使用1個槍頭槍頭一旦觸碰樣本，立刻棄掉，嚴禁污染試劑！×√洗滌操作方法：操作要求：槍頭一旦觸碰樣本，立刻棄掉，嚴禁污染174空轉、環吸及晾干操作方法：12000rpm，空轉3min環吸后晾干3min操作要求：1.環吸方法：用小槍頭對準管壁的余液，旋轉槍頭吸干余液。2.不可過度晾干！空轉、環吸及晾干操作方法：175洗脫操作方法：加入

EB（ElutionBuffer）靜置5min（55℃孵育可提高回收率）

12000rpm，2min操作要求：EB加在膜中央，加入后，環、壁上均無液體在棄管前做最后核對，以免串樣洗脫操作方法：176為什么要進行末端修復？隨機打斷后的DNA一般都會產生不規則的末端，無法直接進行測序接頭連接，因此需要進行末端修復。為什么要加dATP？為了提高連接效率，所以在測序接頭的3’端加1個dTTP，與Insert的dATP互補。DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增為什么要進行末端修復？DNA片段化末端修復加dATP連接測序177DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增基因組DNA打斷平端5’端突出3’端突出5’端突出3’端突出DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增基因組D178DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增基因組DNA打斷平端5’端突出3’端突出5’端突出3’端突出T4DNA聚合酶T4DNA聚合酶DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增基因組D179DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增已補平DNADNA磷酸化激酶PPAATaq聚合酶磷酸化的目的填補連接缺口，提高連接效率本步驟溫控程序25℃30min72℃20minPPDNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增已補平D180DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增Illumina接頭Rd1SeqPrimerP5Rd2SeqPrimerIndexP7Y型接頭的目的

減少接頭自連的可能性！TPDNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增Illu181DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增T4DNA連接酶TPPT連接溫控條件22℃1hr連接反應需注意：反應時間不可過長。測序接頭要足量。DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增T4D182DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增連接反應后必須純化的理由去除接頭二聚體（128bp）篩選合適的片段大小純化方法可選電泳+切膠篩選+膠回收2.磁珠純化并篩選大小DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增連接反應183DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增電泳2%瓊脂糖凝膠，100V1.5h同時選擇多個片段大小膠回收（Qiagen離心柱法）DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增電泳184DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增電泳的優點1.成本低。2.可同時篩選多個大小。3.篩選范圍可控，靈敏。電泳的缺點1.不可自動化。2.小分子在分子遷移過程中易殘留。3.DNA紫外燈下暴露易發生損傷。4.操作時間長。DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增電泳的優185DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增磁珠AmpureXPBeads(BeckmanCoulter）DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增磁珠A186DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增磁珠兩步結合法篩選DNA片段大小DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增磁珠兩步187DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增磁珠的優點1.可自動化，可重復性高。2.操作時間短。3.回收率高。4.可以高效去除小片段。磁珠的缺點1.成本高。2.篩選范圍偏寬，不適合片段要求窄的文庫構建。3.很難同時篩選多個大小。DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增磁珠的優188DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增PCR擴增P5P5P7P795℃DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增PCR擴189DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增PCR擴增P5P5P7P795℃P5P7P5P7DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增PCR擴190DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增P5P5P7P765℃P5primerP7primerDNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增P5P5191DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增P5P5P7P755℃P5primerP7primer72℃DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增P5P5192DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增P5P5P7P755℃P5primerP7primer72℃P5P5P7P7Rd1SPRd1SPRd2SPIndexRd2SPIndexDNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增P5P5193DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增必須嚴格控制PCR循環數！過度PCR只會帶來差的測序數據！如果文庫濃度不夠，是不是可以多做幾個PCR循環？DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增必須嚴格194DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增DNA片段化末端修復加dATP連接測序接頭PCR擴增195文庫質檢一個好的文庫應該符合哪些標準？完全沒有接頭二聚體和引物二聚體。峰型呈正態分布，并在期望范圍內。濃度滿足上機需要即可，沒有特別要求。不可出現過度PCR的大片段。文庫質檢一個好的文庫應該符合哪些標準？196文庫質檢常見文庫2100質檢圖文庫質檢常見文庫2100質檢圖197質量差的文庫引物二聚體接頭二聚體文庫過度PCR只占比50%！質量差的文庫引物二聚體接頭二聚體文庫過度PCR只占比50%！198基因組學研究全基因組重測序（WGRS）未知基因組測序（DeNovo）單細胞基因組測序（SingleCell）基因組學研究全基因組重測序（WGRS）199基因組學研究全基因組重測序（WGRS）未知基因組測序（DeNovo）單細胞基因組測序（SingleCell）研究對象：有參考基因組的物種。研究方法：建庫：最基本的DNA文庫構建方法。測序方案：個體測序一般30X，種群測序一般6X基因組學研究全基因組重測序（WGRS）研究對象：200基因組學研究全基因組重測序（WGRS）未知基因組測序（DeNovo）單細胞基因組測序（SingleCell）研究對象：無參考基因組的物種，物種的種群最好不要過大。研究方法：建庫：基本DNA文庫，長片段（Mate-Pair)文庫，必要時需要構建Fosmid或BAC文庫。測序方案：按照文庫長度遞增。基因組學研究全基因組重測序（WGRS）研究對象：201DeNovo大致流程DeNovo大致流程202基因組學研究全基因組重測序（WGRS）未知基因組測序（DeNovo）單細胞基因組測序（SingleCell）研究對象：主要是人的1個或者幾個細胞或者極少量DNA研究方法：建庫：單細胞擴增（MALBAC）+基本DNA文庫測序方案：全基因組測序30X基因組學研究全基因組重測序（WGRS）研究對象：203為何選擇MALBAC？檢驗方法：采用9對持家基因對擴增產物進行qPCRMALBAC與MDA各做3個生物學重復為何選擇MALBAC？檢驗方法：204靶向區域研究全外顯子組測序靶向捕獲測序擴增子測序靶向區域研究全外顯子組測序205靶向區域研究全外顯子組測序（WholeExomeSequencing）靶向捕獲測序擴增子測序研究對象：主要是人，Roche芯片現有一些特殊物種。研究方法：建庫：基本DNA文庫+外顯子雜交芯片捕獲測序方案：100X靶向區域研究全外顯子組測序研究對象：206雜交平臺探針攜帶生物素標記。捕獲富集的片段用親和鏈霉素磁珠進行篩選。RocheV3.064MbAgilentV554Mb雜交平臺探針攜帶生物素標記。207外顯子基本研究策略NatureGenetics，2009外顯子基本研究策略NatureGenetics，2009208靶向區域研究全外顯子組測序靶向捕獲測序（TargetSequencing）擴增子測序研究對象：主要是人，捕獲用的探針是根據自身需要訂制的。研究方法：建庫：基本DNA文庫+訂制探針雜交芯片捕獲測序方案：200X以上比外顯子測序所需數據量更少，大幅提高測序深度，降低測序成本！靶向區域研究全外顯子組測序研究對象：比外顯子測序所需數據量更209靶向區域研究全外顯子組測序靶向捕獲測序擴增子測序（Amplicon）研究對象：主要是人，使用擴增特異性引物擴增目的片段。研究方法：建庫：擴增目的區域+DNA建庫測序方案：200X以上通量較小，適合幾個基因或較少位點的研究。PCR容易引入人為錯配，增加分析噪音。靶向區域研究全外顯子組測序研究對象：通量較小，適合幾個基因或210表觀遺傳學研究全基因組甲基化測序（BS-Seq）MeDIP-Seq簡化甲基化測序（RRBS）表觀遺傳學研究全基因組甲基化測序（BS-Seq）211表觀遺傳學研究全基因組甲基化測序（BS-Seq）MeDIP-Seq簡化甲基化測序（RRBS）研究對象：主要是人，人源細胞等。研究方法：建庫：DNA建庫+重亞硫酸鹽處理測序方案：30X以上表觀遺傳學研究全基因組甲基化測序（BS-Seq）研212表觀遺傳學研究全基因組甲基化測序（BS-Seq）MeDIP-Seq簡化甲基化測序（RRBS）研究對象：主要是人，人源細胞等。研究方法：建庫：DNA建庫+5mC抗體包被磁珠處理測序方案：50X以上表觀遺傳學研究全基因組甲基化測序（BS-Seq）研究對象：213表觀遺傳學研究全基因組甲基化測序（BS-Seq）MeDIP-Seq簡化甲基化測序（RRBS）研究對象：主要是人，小鼠，大鼠。研究方