免疫(miǎnyì)共沉淀技術(shù)第一頁(yè)，共16頁(yè)。定義及原理操作(cāozuò)流程優(yōu)點(diǎn)和不足注意事項(xiàng)應(yīng)用及實(shí)例展望第二頁(yè)，共16頁(yè)。定義(dìngyì)及原理免疫共沉淀定義免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CO-IP)也稱免疫共吸附或免疫下拉技術(shù)，能夠從細(xì)胞裂解物中特異性的分離(fēnlí)并富集目標(biāo)蛋白。

CO-IP是通過(guò)抗原抗體之間的專一性作用為基礎(chǔ)來(lái)研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。也是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。第三頁(yè)，共16頁(yè)。基本原理在細(xì)胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結(jié)合(jiéhé)的偶聯(lián)于sepharosebeads上的proteinA/G,與細(xì)胞中的抗體結(jié)合(jiéhé)，形成一種復(fù)合物：目的蛋白/目的蛋白-抗目的蛋白抗體-proteinA/G,經(jīng)過(guò)變性凝膠電泳，復(fù)合物分開(kāi)。最后通過(guò)免疫印跡或質(zhì)譜檢測(cè)目的蛋白。第四頁(yè)，共16頁(yè)。原理(yuánlǐ)流程示意圖第五頁(yè)，共16頁(yè)。操作(cāozuò)流程免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)流程(1)蛋白樣品準(zhǔn)備（如果為細(xì)胞樣品需先裂解）(2)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)(3)ProteinA/G與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合

(4)免疫復(fù)合物與proteinA/G解離（2%SDS煮沸處理(chǔlǐ)）(5)分析鑒定（WesternBlot或質(zhì)譜分析）第六頁(yè)，共16頁(yè)。實(shí)驗(yàn)(shíyàn)流程如圖所示第七頁(yè)，共16頁(yè)。優(yōu)點(diǎn)(yōudiǎn)和不足優(yōu)點(diǎn)1.可以分離到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物2.蛋白的相互作用是在自然(zìrán)狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為影響。缺點(diǎn)和局限性1.難以檢測(cè)蛋白質(zhì)的低親和力和短暫的相互作用2.不能夠確定第三種蛋白的橋聯(lián)作用第八頁(yè)，共16頁(yè)。應(yīng)用(yìngyòng)及實(shí)例應(yīng)用領(lǐng)域：免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)用途非常廣泛，但一般主要用于低豐度蛋白的富集和濃縮，為SDS和MS質(zhì)譜分析鑒定準(zhǔn)備樣品。應(yīng)用范圍:1.尋找(xúnzhǎo)新的相互作用蛋白2.驗(yàn)證目的蛋白和待測(cè)蛋白是否有相互作用第九頁(yè)，共16頁(yè)。一、固定在活細(xì)胞狀態(tài)下，用甲醛固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，然后用化學(xué)（微球菌酶）或者機(jī)械（超聲波）的手段將其隨機(jī)(suíjī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段。難以檢測(cè)蛋白質(zhì)的低親和力和短暫的相互作用將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段最后通過(guò)免疫印跡或質(zhì)譜檢測(cè)目的蛋白。驗(yàn)證目的蛋白和待測(cè)蛋白是否有相互作用陽(yáng)性對(duì)照：如組蛋白抗體(kàngtǐ)驗(yàn)證目的蛋白和待測(cè)蛋白是否有相互作用定義(dìngyì)及原理(4)免疫復(fù)合物與proteinA/G解離原理(yuánlǐ)流程示意圖P53基因是一種人體抑癌基因，人體癌癥一半由于該基因突變失活它不僅可以靈敏地檢測(cè)目標(biāo)蛋白與特異DNA片段的結(jié)合情況，還可以用來(lái)研究組蛋白與基因表達(dá)(biǎodá)的關(guān)系。最后通過(guò)免疫印跡或質(zhì)譜檢測(cè)目的蛋白。尋找(xúnzhǎo)新的相互作用蛋白定義(dìngyì)及原理CO-IP是通過(guò)抗原抗體之間的專一性作用為基礎(chǔ)來(lái)研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。實(shí)例(shílì)鼻咽癌細(xì)胞中p53相結(jié)合蛋白的分離和鑒定(jiàndìng)P53基因是一種人體抑癌基因，人體癌癥一半由于該基因突變失活1.抗P53抗體與HEN1和HEN2細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀。分離免疫沉淀復(fù)合物3.切取p53結(jié)合蛋白條帶，酶解后進(jìn)行電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析，得到相應(yīng)肽列標(biāo)簽4.搜索數(shù)據(jù)庫(kù)分析目的蛋白相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)研究第十頁(yè)，共16頁(yè)。操作(cāozuò)流程將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段難以檢測(cè)蛋白質(zhì)的低親和力和短暫的相互作用可以分離到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物定義(dìngyì)及原理蛋白的相互作用是在自然(zìrán)狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為影響。不能夠確定第三種蛋白的橋聯(lián)作用(1)蛋白樣品準(zhǔn)備（如果為細(xì)胞樣品需先裂解）也是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。染色質(zhì)免疫沉淀(CHIP)CHIP原理(yuánlǐ)抗P53抗體與HEN1和HEN2細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀。驗(yàn)證目的蛋白和待測(cè)蛋白是否有相互作用通過(guò)免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段操作(cāozuò)流程(4)免疫復(fù)合物與proteinA/G解離染色質(zhì)免疫沉淀(CHIP)研究體內(nèi)DNA－蛋白質(zhì)相互作用的重要工具。它不僅可以靈敏地檢測(cè)目標(biāo)蛋白與特異DNA片段的結(jié)合情況，還可以用來(lái)研究組蛋白與基因表達(dá)(biǎodá)的關(guān)系。第十一頁(yè)，共16頁(yè)。CHIP原理(yuánlǐ)在活細(xì)胞狀態(tài)下固定(gùdìng)蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段通過(guò)免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)第十二頁(yè)，共16頁(yè)。操作步驟一、固定在活細(xì)胞狀態(tài)下，用甲醛固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，然后用化學(xué)（微球菌酶）或者機(jī)械（超聲波）的手段將其隨機(jī)(suíjī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段。二、免疫沉淀利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合體，然后沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段。三、純化與檢測(cè)經(jīng)蛋白質(zhì)與DNA解偶聯(lián)，DNA片段純化等處理后，用PCR等方法檢測(cè)DNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合情況.第十三頁(yè)，共16頁(yè)。注意事項(xiàng)超聲波破碎條件的選擇抗體(kàngtǐ)量的選擇PCR反應(yīng)條件的選擇Input對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照：如組蛋白抗體(kàngtǐ)陰性對(duì)照：陰性引物條件(tiáojiàn)選擇對(duì)照設(shè)置第十四頁(yè)，共16頁(yè)。基因表達(dá):