細胞因子及免疫細胞功能檢測方法簡介劉素俠山東大學醫學院免疫學研究所2011-2-23內容細胞因子檢測的常用方法免疫細胞功能的常用檢測方法一、免疫學檢測的基本原理抗原與抗體反應的特異性是各種免疫學檢測技術的基本原理二、細胞因子檢測方法細胞因子的臨床意義常規測定法胞內細胞因子檢測方法細胞因子檢測的主要臨床應用

（一）細胞因子的臨床意義細胞因子與疾病：正常情況下，細胞因子表達和分泌受機體的嚴格調控，在病理狀態下細胞因子會出現異常性表達，表現為細胞因子及其受體的缺陷，細胞因子表達過高，以及可溶性細胞因子受體的水平增加等。細胞因子與治療：重組細胞因子做為生物應答調節劑。已批準生產：IFN-α、β、γ，Epo，GM-CSF，G-CSF，IL-2，正在進行臨床試驗的：IL-1、3、4、6、11，M-CSF，SCF，TGF-β等

（二）常規檢測方法分子生物學測定法生物活性檢測法免疫化學測定法

1.分子生物學測定法是測定細胞因子mRNA的表達水平，主要有兩種方法：分子雜交技術多聚酶鏈反應技術（PCR）多聚酶鏈反應技術（PCR）PCR（polymerasechainreaction)技術，是一種高效的基因體外擴增技術；將細胞因子產生細胞的RNA提取出來，再經逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，在細胞因子引物的引導下，即可進行PCR擴增；優點：靈敏度高操作簡便缺點：測定結果只能代表細胞因子基因的表達，而不能代表活性細胞因子的水平。

5’3’5’3’變性退火延伸第二循環dsDNAssDNA加入引物5’3’3’5’dNTP,Taq酶5’3’5’5’3’3’3’5’5’3’5’5’RTPCRRT-PCR反應過程反轉錄PCR：

mRNA---cDNA---PCR抽提RNA反轉錄合成cDNAPCR擴增RT反應體系模板：總RNA，mRNA引物：隨機引物，Oligo(dT)，基因特異性引物（GSP)逆轉錄酶：AMVM-MLVQuantReverseTranscriptasePCR反應體系模板：逆轉錄產物cDNA目的基因特異性引物；反應混合液：dNTP，Taq聚合酶，Mg++RT-PCR反應產物檢測凝膠電泳分析：初步判斷產物的特異性。酶切分析：對擴增產物進行鑒定、對靶基因分型及進行變異性研究。分子雜交：檢測產物特異性，分析堿基突變核酸序列分析（測序）：是檢測PCR產物特異性的最可靠方法（1）原理實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

1)常用名詞概念擴增曲線熒光閾值Ct值設定熒光域值PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號；熒光域值的設置是3-15個循環的熒光信號的標準差的10倍，即：threshold=10′SDcycle3-15

意義：大于熒光背景值和陰性對照熒光最高值，進入指數期的最初階段；真正熒光信號：熒光信號大于閾值熒光閾值（threshold）Ct值的確定橫坐標：PCR循環數縱坐標：熒光信號強度黑線：熒光域值紅線：無模板---域值下一直線綠線：樣品Ct值=17（第17個循環時，熒光信號強度達到域值）Ct值與起始模板的關系

研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線（2）常用標記方法非特異性熒光標記：

SYBRGreenI特異性熒光標記：

TaqManProbe；

分子信標SYBRGreenI染料法原理注意事項因為SYBRGreenI可以與所有dsDNA結合而激發熒光，因此，如果反應體系中有非特異性擴增或引物二聚體，也可以同時被檢測，將導致結果不準確；關鍵：設計特異性引物！結果判定——融解曲線（3）qPCR結果分析——

相對定量解析1）相對定量的必要性必須用內對照基因（管家基因）進行校正2）管家基因篩選管家基因：維持細胞生命活動代謝所必須的基因，如GAPDH,beta-Actin,18srRNA等；篩選方法：根據文獻提供；通過具體實驗。3）分析方法雙標準曲線法2-△△Ct法（Ct值比較法）1）雙標準曲線法通過標準曲線對對照樣品、待測樣品目的基因及管家基因進行定量，然后根據公式計算相對值，即為相對表達量。公式：校正值目的基因定量結果管家基因定量結果相對值待測樣品校正值對照樣品校正值==校正值=目的基因定量結果校正值=管家基因定量結果目的基因定量結果校正值=對照樣品校正值待測樣品校正值對照樣品校正值=待測樣品校正值對照樣品校正值相對值=待測樣品校正值對照樣品校正值優缺點優點：分析簡單，實驗優化相對簡單；缺點：對每一個基因，每一輪實驗均需要做標準曲線；應用：基因表達調控研究2）2-△△Ct法2-△△Ct法：假設目的基因、對照基因擴增效率均是100%

△Ct（處理前/對照組）=18-17=1

△Ct（處理后/實驗組）=16-17.4=-1.4

△△Ct=△Ct（處理后）-△Ct（處理前)=-2.4

比率（處理后/處理前）=2-△△Ct=2--2.4=5.3結論：JUN處理后表達水平是處理前的5.3倍修正：擴增效率不是1，而是E，

2-△△Ct可修正為（1+E）-△△Ct優點特異性好；簡單、安全、自動化程度高；速度快、高通量；線性關系好、線性范圍寬2.生物活性檢測法

測定細胞因子的生物學活性：刺激細胞增殖、維持細胞生長和存活、抑制細胞生長、溶解或殺滅細胞、抗病毒、促進細胞趨化、刺激細胞生成集落等活性；指示細胞：多選用造血系統或淋巴系統細胞，最好用依賴性細胞株細胞；顯示細胞反應：用3H-胸腺嘧啶核苷參入，或用四唑鹽轉化引致的顏色反應。（1）依賴性細胞株

一些腫瘤細胞株必須依賴于細胞因子方能在體外增殖，如DTLL細胞株依賴IL-2；FDC-PL細胞株依賴于小鼠IL-3；TF-1細胞株依賴于人IL-3和人GM-CSF，因而可利用這些依賴細胞株檢測相應的細胞因子；優點：敏感性高，特異性強；缺點：應用有限。

（2）功能檢測

利用一些細胞因子的功能特性，可建立相應的活性測定方法，如干擾素的抑制病毒感染效應，腫瘤壞死因子對L929細胞的殺傷作用等。優點：敏感性高；缺點：特異性不夠，容易受一些擾因素的影響。A.增殖或增殖抑制法

其基本原理是應用某一細胞因子能特異地刺激或抑制某些指示細胞的增殖，通過3H-TdR摻入或MTT法顯色，反映待檢細胞因子的活性水平。B.集落形成法

其基本原理是應用骨髓干細胞體外半固體培養系統，根據不同造血因子能誘導干細胞或定向造血祖細胞形成某一種或某些種類細胞的集落，通過對形成集落形態學、酶學鑒定，計算不同種類集落形成的數量和比例，反映待測標本中CSF的種類和活性水平。C.直接殺傷靶細胞

細胞因子TNF-α、TNF-β具有直接殺傷某些腫瘤細胞的作用，采用TNF敏感的細胞株如小鼠成纖維細胞株L929，以WEHI164亞克隆13（鼠纖維肉瘤細胞系）作為指示細胞，通過3H-TdR釋放法或染料染色等可檢測待檢樣品中TNF的活性水平。

D.抗病毒效應靶細胞受某些病毒感染后可發生明顯病變和死亡，干擾素可保護靶細胞免受病毒的攻擊；常用的病毒是水皰性口炎病毒（vesicularstomatitisvirus,VSV），敏感的指示細胞為喉癌的上皮細胞株Hep2和羊膜的上皮細胞WISH，通過干擾素（IFN-α、IFN-β、IFN-γ）抑制病毒致病變的程度，計算出待測樣品中IFN的活性單位。

E.趨化作用IL-8對多形核細胞、淋巴細胞具有趨化作用，可用小室法或軟瓊脂趨化法，PMN或淋巴細胞作為指示細胞，以細胞趨化的程度來反映樣品中IL-8活性水平。F.抗體形成法IL-6可在體外刺激某些B淋巴細胞系產生和分泌免疫球蛋白；指示細胞：分泌IgG的ARH-77、CESS分泌IgM的SKW6.CL-4方法：在一定條件下，待檢樣品中IL-6水平與培養細胞上清IgG或IgM水平正相關，通過標準IL-6的對照可推算出待檢樣品中IL-6的活性。IL-2的誘生及生物活性測定（試驗四）

一般方法

細胞因子敏感的細胞株

細胞因子的標準品及待測品指示劑：MTT，3H-TdR酶聯免疫吸附測定儀測定OD值繪制標準曲線標準品50%最大OD值找出與標準品50%最大OD值相對應的標準品稀釋度(S)找出與標準品50%最大OD值相對應的待測品稀釋度(A)待測品單位數=S/A×標準品單位稀釋度OD值

1/81/4S1/2A1100%OD50%OD標準品待測品對生物學活性測定法的評價優點：靈敏度高；測定的是有生物活性的細胞因子缺點：維持靶細胞株，操作繁雜和難定量特異性差實驗周期較長易受其它因素的影響3.免疫化學測定法

用來檢測細胞因子蛋白質的抗原特性，利用抗體對抗原表位的識別，測定的是可溶性細胞因子的抗原性。基本原理是細胞因子（或受體）與相應的特異性抗體（單克隆抗體或多克隆抗體）結合，通過同位素、熒光素或酶等標記技術加以放大和顯示，從而定性或定量顯示細胞因子（或受體）的水平。免疫標記技術

RadioimmunoassayImmunofluorescence酶免疫分析

(EIA)：ELISA：體液中的細胞因子

免疫組織化學

ELISPOT：分泌細胞因子的T細胞（頻率）60（三）胞內細胞因子檢測方法測定的是細胞因子的前體分子，是單一細胞行為；一般要用先活化細胞，使之合成欲測細胞因子。在活化過程中加入蛋白質運輸抑制物，如莫能菌素(monensin)和布雷菲爾德菌素A，阻止了細胞因子分泌，提高了胞內檢測的陽性率；檢測方法：ELISPOT

熒光標記：熒光顯微鏡或FCM

活化劑活化T細胞：除特異性抗原外，主要植物血凝素(PHA)、巴豆酯(PMA)、離子霉素（ionomycin）、鈣離子載體A23187、T細胞受體抗體或CD3的抗體等；活化B細胞：特異性抗原，脂多糖（LPS）、金黃色葡萄球菌腸內毒素A、B細胞受體抗體；活化單核細胞：LPS和某些細胞因子。人外周血單個核細胞IL-17A流式檢測方法

人外周血單個核細胞（PBMC）的分離；調整細胞濃度接種24孔板或96孔板；加入BrefeldinA，PMA和ionomycin（離子霉素），進行細胞培養；一定時間后，收集細胞進行表面抗原染色（如CD4或CD8）、固定和通透、細胞內細胞因子染色、流式細胞儀測定和結果分析。(1)抗凝靜脈血(2)加等量NS(4)密度梯度離心血漿分離液RBCPBMCPMN(3)混勻后，緩慢加于分離液上

圖1.表達IL-17和IFN-的CD4+T細胞分析圖2.CD4+T細胞表達轉錄因子FoxP3的檢測（四）細胞因子檢測的臨床應用

機體免疫狀態的評估；

疾病預后及治療監測指標；病理變化和損傷機理研究；輔助診斷。三、常用免疫細胞功能檢測方法評價機體的特異性和非特異性免疫功能內容

淋巴細胞的功能檢測

T細胞功能檢測B細胞功能檢測NK細胞功能檢測吞噬細胞功能檢測免疫細胞功能檢測的臨床應用

（一）淋巴細胞功能檢測淋巴細胞功能測定可分為體內實驗和體外實驗；體內實驗主要是間接了解淋巴細胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應答反應；體外實驗主要包括淋巴細胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應、細胞毒性試驗及淋巴細胞分泌產物的測定淋巴細胞T細胞：介導細胞免疫B細胞：介導體液免疫NK細胞：固有免疫

1.T細胞功能檢測體外實驗：T細胞增殖試驗T細胞分泌功能測定T細胞介導的細胞毒試驗.體內試驗（1）T淋巴細胞增殖試驗A.原理：淋巴細胞DNA合成分化母細胞刺激物細胞變大細胞漿擴大空泡核仁明顯核染色質疏松

未轉化和轉化淋巴細胞的形態特征轉化的淋巴細胞未轉化的淋巴細胞淋巴母細胞過渡型細胞大小(直徑μm)12～2012～166～8核大小、染色質增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4個有或無無有絲分裂有或無無無胞質、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無B.刺激物特異性刺激物：異種抗原：破傷風類毒素、鏈球菌激酶、純化蛋白衍生物（purifiedproteinderivative，PPD）和白色念珠菌同種組織抗原：HLA非特異性刺激物：

PHA：人T細胞

ConA：小鼠T細胞

PWM：T、B細胞

LPS：B細胞T細胞非特異性抗原刺激植物血凝素(PHA)---人刀豆蛋白A(ConA)---小鼠淋巴母細胞化核酸、蛋白合成增加細胞體積增大分裂、增殖模擬特異性抗原刺激下T細胞的分裂、增殖過程反映T細胞功能和機體細胞免疫水平常用方法形態計數法同位素摻入法CCK-8法MTT法FCM法,第4次實驗形態計數法外周血或分離的淋巴細胞PHA涂片染色共培養形態學觀察計算轉化率方法評價優點：簡便易行，普通光學顯微鏡便能觀察結果。缺點：是依靠肉眼觀察形態學變化，判斷結果易受主觀因素影響，重復性和準確性較差。同位素摻入法外周血或分離的淋巴細胞PHA共培養DNA合成增加3H-TdR3H摻入到DNA中液體閃爍儀檢測信號SI＝PHA刺激管cpm均值/對照管cpm均值優點：敏感性高，客觀性強，重復性好。缺點：但需一定設備條件，同時還存在放射性核素污染問題。CCK8法(CellCountingKit8)外周血或分離的淋巴細胞PHA共培養DNA合成增加CCK-8存活細胞內線粒體脫氫還原酶還原CCK-8水溶性、黃色甲躦顆粒光密度值酶標儀MTT法CFSE染色檢測淋巴細胞增殖(2)T細胞分泌功能測定體外培養的T細胞經各種絲裂原或抗原刺激后,分泌各種細胞因子,可借助免疫學、細胞生物學及分子生物學技術分別檢測細胞因子含量、生物學活性或基因表達水平，以反映T細胞功能。(3)T細胞介導的細胞毒實驗T細胞介導的細胞毒性是致敏的T細胞再次遇相應靶細胞抗原，可表現出對靶細胞的破壞和溶解作用。評價機體細胞免疫水平；測定腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細胞的能力，常作為判斷預后和觀察療效的指標之一；選用適當的靶細胞，常用可傳代的已建株的人腫瘤細胞如人肝癌、食管癌、胃癌等細胞株，經培養后制成單個細胞懸液，按一定比例與受檢的淋巴細胞混合，共溫一定時間，觀察腫瘤細胞被殺傷情況。A.原理：靶細胞抗原T細胞觀察殺傷活力致敏CTL靶細胞形態學方法：淋巴細胞+腫瘤細胞計數殘留腫瘤細胞同位素法：淋巴細胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細胞腫瘤細胞破壞51Cr釋放測定γ射線B.方法意義：腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細胞的能力

圖15-2T細胞細胞毒試驗示意圖（4）體內試驗特異性抗原皮膚試驗PHA皮膚試驗2.B細胞功能檢測B細胞增殖能力的試驗B細胞抗體形成功能的檢測體內試驗(1)B細胞增殖能力檢測抗IgM細菌脂多糖SPA

B細胞增殖形態學3H－TdR摻入法（2）體外抗體形成細胞檢測微量溶血分光光度法測定抗體形成細胞——QHS

溶血空斑實驗PFC——液相小室法

固相瓊脂法ELISPOT檢測特異性抗體形成細胞功能溶血空斑試驗又稱為PFC（Plaqueformingcell）測定技術，是一種體外檢測單個抗體形成細胞（漿細胞）的方法。分為直接溶血空斑試驗和間接溶血空斑試驗；直接溶血空斑試驗：測定產生IgM型抗體的細胞，只加細胞和補體；間接溶血空斑試驗：檢測產生IgG或IgA的細胞，加靶細胞、顯斑劑、補體；顯斑劑：抗各類Ig高純度的抗血清原理將經綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞與一定量的綿羊紅細胞（靶細胞）混合，在補體參與下，使抗體形成細胞周圍結合了抗體分子的羊紅細胞溶解形成肉眼可見的溶血空斑。

溶血空斑試驗主要用于測定藥物和手術等因素對體液免疫功能的影響;評價免疫治療或免疫重建后機體產生抗體的能力。B細胞抗體形成功能的檢測

——酶聯免疫斑點法該方法既可檢測抗體分泌細胞，又可檢測抗體分泌量。優點：穩定、特異、抗原用量少；可同時檢測不同抗原誘導的不同抗體分泌，并可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細胞。(4)體內實驗體內抗體產生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風類毒素、多價肺炎鏈球菌菌苗等。將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分別采血，分離血清，測定受檢者免疫前后相應抗體的效價，判斷受檢者體內B細胞的功能。染色計數離心取上清測LDH或AKP離心取沉淀測活細胞熒光測發光強度測CPM值形態法酶釋法熒光法同位素法化學發光法3、NK細胞活性測定靶細胞溶解