EMSA原理流程綱領綱領EMSA原理流程綱領綱領EMSA原理流程綱領綱領凝膠遷徙或電泳遷徙率實驗〔EMSA〕能夠：〔1〕研究DNA聯合蛋白和其有關的DNA聯合序列互相作用；〔2〕可用于DNA定性和定量分析；〔3〕用于研究RNA聯合蛋白和特定的RNA序列的互相作用。實驗方法原理凝膠遷徙或電泳遷徙率實驗〔EMSA-electrophoreticmobilityshiftassay〕是一種研究DNA結

合蛋白和其有關的DNA聯合序列互相作用的技術，可用于定性和定量分析。這一技術最先用于研究DNA聯合蛋白，當前已用于研究RNA聯合蛋白和特定的RNA序列的互相作用。平常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標志的DNA或RNA探針一起保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分別復合物和非聯合的探針。DNA-復合物或RNA-復合物比非聯合的探針挪動得慢。同位素標志的探針依研究的聯合蛋白的不一樣樣，但是雙鏈或許是單鏈。當檢測如轉錄調控因子一類的DNA聯合蛋白，可用純化蛋白，局部純化蛋白，或核細胞抽提液。在

檢測RNA聯合蛋白時，依照目的RNA聯合蛋白的地點，可用純化或局部純化的蛋白，也可用核或胞質細胞抽提液。競爭實驗中采納含蛋白聯合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段〔特異〕，和其余非有關的片段〔非特異〕，來確立DNA或RNA聯合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依照復合物的特色和強度來確立特異聯合。試劑、試劑盒[γ-32P]ATPT4多聚核苷酸激酶Nuclease-FreeWaterT4多聚核苷酸激酶緩沖液醋酸銨TE無水乙醇TBEbuffer重蒸水甲叉雙丙烯酰胺丙烯酰胺甘油過硫酸銨TEME〔D四甲基乙二胺〕EMSAGel-Shift聯合緩沖液溴酚藍儀器、耗材水浴鍋PCR儀離心計電泳儀電泳槽實驗步驟一、探針的標志1.?以下設置探針標志的反應系統：〔1〕待標志探針(1.75pmol/微升)：2微升。〔2〕T4PolynucleotideKinaseBuffer(10X)：1微升。〔3〕Nuclease-FreeWater：5微升。〔4〕[γ-32P]ATP(3000Ci/mmolat10mCi/ml)：1微升。〔5〕T4PolynucleotideKinase(5-10u/微升)：1微升。

〔6〕整體積10微升〔7〕依照上述反應系統挨次參加各樣試劑，參加同位素后，Vortex混勻，再參加T4PolynucleotideKinase，混勻。2.?使用水浴或PCR儀，37℃反應10分鐘。3.?參加1微升探針標志停止液，混勻，停止探針標志反應。4.?再參加89微升TE，混勻。此時能夠取少許探針用于檢測標志的效率。平常標志的效率

在30%以上，即總放射性的30%以上標志到了探針上。為實驗簡單起見，平常不用測定探針的標志效率。5.?標志好的探針最好立刻使用，最長使用時間一般不宜超出3天。標志好的探針能夠保留在-20℃。二、探針的純化平常為實驗簡單起見，能夠不用純化標志好的探針。在有些時候，純化后的探針會改良EMSA的電泳結果。如需純化，能夠依照以下步驟操作：1.?關于100微升標志好的探針，參加1/4體積即25微升的5M醋酸銨，再參加2體積即200微升的無水乙醇，混勻。2.?在-70℃至-80℃積淀1小時，或在-20℃積淀留宿。3.?在4℃，12000g-16000g離心30分鐘。當心去除上清，切不能夠涉及沉。4.?在4℃，12000g-16000g離心1分鐘。當心吸去節余液體。微晾干積淀，但不宜過分干燥。5.?參加100微升TE，完滿溶解積淀。標志好的探針最好立刻使用，最長使用時間一般不宜超出3天。標志好的探針能夠保留在-20℃。

三、EMSA膠的配制1.?準備好倒膠的模具。能夠使用常例的灌制蛋白電泳膠的模具，或其余適合的模具。最好選擇能夠灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續操作。為獲得更好的結果，能夠選擇可灌制較大EMSA膠的模具。2.?依照以下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝膠(注意：使用29:1等不一樣樣比率的Acr/Bis

對結果影響不大)。〔1〕TBEbuffer(10X)：1毫升。

重蒸水16.2毫升。〔2〕39:1acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v)：2毫升。〔3〕80%甘油：625微升。〔4〕10%過硫酸銨(ammoniumpersulfate)：150微升。〔5〕TEMED：10微升3.?依照上述序次參加各個溶液，參加TEMED前先混勻，參加TEMED后立刻混勻，并立刻參加到制膠的模具中。防備產生氣泡，并加上梳齒。假如發現特別簡單形成氣泡，能夠把一塊制膠的玻璃板進行硅烷化辦理。四、EMSA聯合反應1.?以下設置EMSA聯合反應陰性比較反應：(1〕Nuclease-FreeWater：7微升。〔2〕EMSA/Gel-Shift聯合緩沖液(5X)：2微升。〔3〕細胞核蛋白或純化的轉錄因子：0微升。〔4〕標志好的探針：1微升。〔5〕整體積：10微升。樣品反應：〔1〕Nuclease-FreeWater：5微升。〔2〕EMSA/Gel-Shift聯合緩沖液(5X)：2微升。〔3〕細胞核蛋白或純化的轉錄因子：2微升。

〔4〕標志好的探針：1微升。〔5〕整體積：10微升。探針冷競爭反應：〔1〕Nuclease-FreeWater：4微升。〔2〕EMSA/Gel-Shift聯合緩沖液(5X)：2微升。〔3〕細胞核蛋白或純化的轉錄因子：2微升。〔4〕未標志的探針：1微升。

〔5〕標志好的探針：1微升。〔6〕整體積：10微升。突變探針的冷競爭反應：〔1〕Nuclease-FreeWater：4微升。〔2〕EMSA/Gel-Shift聯合緩沖液(5X)：2微升。〔3〕細胞核蛋白或純化的轉錄因子：2微升。〔4〕未標志的突變探針：1微升。〔5〕標志好的探針：1微升。〔6〕體積：10微升Super-shift反應：〔1〕Nuclease-FreeWate：r4微升。〔2〕EMSA/Gel-Shift聯合緩沖液(5X)：2微升。

〔3〕細胞核蛋白或純化的轉錄因子：2微升。〔4〕目的蛋白特異抗體：1微升。〔5〕標志好的探針：1微升。〔6〕整體積：10微升。2.?依照上述序次挨次參加各樣試劑，在參加標志好的探針前先混勻，而且室溫(20-25℃)放

置10分鐘，進而除去可能發生的探針和蛋白的非特異性聯合，或許讓冷探針優先反應。此后參加標志好的探針，混勻，室溫(20-25℃)擱置20分鐘。3.?參加1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色，10X)，混勻后立刻上樣。注意：有些時候

溴酚藍會影響蛋白和DNA的聯合，建議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。假如關于使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到沒法上樣，能夠在無色上樣緩沖液里面增添很少許的藍色的上樣緩沖液，至能察看到藍顏色即可。五、電泳分析1.?用0.5XTBE作為電泳液。依照10V/厘米的電壓預電泳10分鐘。預電泳的時候假如有空余

的上樣孔，能夠參加少許稀釋好的1X的EMSA上樣緩沖液(藍色)，以察看電壓能否正常進行。2.?把混淆了上樣緩沖液的樣品參加到上樣孔內。在節余的某個上樣孔內參加10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(藍色)，用于察看電泳進行的狀況。3.?依照10V/厘米的電壓電泳。保證膠的溫度不超出30℃，假如溫度高升，需要適合降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處，停止電泳。4.?剪一片大小和EMSA膠大小周邊或略大的比較厚實的濾紙。當心取下夾有EMSA膠的膠

板，用吸水紙或一般廁紙大概擦干膠板邊沿的電壓液。當心打開兩塊膠板中的上邊一塊(注：平常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側漸漸覆遮住整個EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠輕輕浸潤后(大概缺少1分鐘)，輕輕揭起濾紙，這時EMSA膠會被濾紙一起揭起來。把濾紙側向下，放平，在EMSA膠的上邊覆蓋一層保鮮膜，保證保鮮膜和膠之間沒有氣泡。5.?干膠儀器上無聊EMSA膠。此后用X光片壓片檢測，或用其余適合儀器設施檢測。其余一、常有問答1.什么是凝膠遷徙或電泳遷徙率實驗？凝膠遷徙或電泳遷徙率實驗〔EMSA〕是一種研究DNA聯合蛋白和其有關的DNA聯合序列互相作用的技術，可用于定性和定量分析。這一技術最先用于研究DNA聯合蛋白，當前已用于研究RNA聯合蛋白和特定的RNA序列的互相作用。平常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標志的DNA或RNA探針一起保溫，在非變性

的聚丙烯凝膠電泳上，分別復合物和非聯合的探針。DNA復合物或RNA復合物比非聯合的探針挪動得慢。同位素標志的探針依研究的聯合蛋白的不一樣樣，但是雙鏈或許是單鏈。當檢測如轉錄調控因子一類的DNA聯合蛋白，可用純化蛋白，局部純化蛋白，或核細胞抽提液。

在檢測RNA聯合蛋白時，依照目的RNA聯合蛋白的地點，可用純化或局部純化的蛋白，也可用核或胞質細胞抽提液。競爭實驗中采納含蛋白聯合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段〔特異〕，和其余非有關的片段〔非特異〕，來確立DNA或RNA聯合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依照復合物的特色和強度來確立特異聯合。2.實驗中需要用到什么試劑？凝膠遷徙實驗需要的聯合蛋白，可根源于純化或局部純化的蛋白，或粗的核和胞質抽提液。還必然制備同位素標志的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探針用32P和T4多核苷酸激酶來作尾端標志，同位素標志的RNA用噬菌體RNA聚合酶和同位素標志的核苷酸在體外合成。Promega企業的Riboprobe/sup系統〔a,b〕可用于同位素標志的RNA的體外合成，DNA5'末

端標志系統，用于制備DNA探針，聯合反應所需的組分有：含鹽的溶液〔氯化鎂，氯化鈉，或氯化鉀〕、緩沖系統〔Tris-HCl或HEPES〕、還原劑〔DTT〕、甘油、非特異的競爭DNA〔poly〔dI:dC〕dI:dC〕，也可能含非離子去污劑。在聯合蛋白和同位素標志的探針作用后，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分別復合物，隨后將凝膠無聊并放射自顯影，或用PhosphorImage/sup分析。3.凝膠遷徙實驗系統供給了什么試劑？Promega企業供給一種凝膠遷徙實驗系統檢測DNA聯合蛋白，系統可作為這種實驗的一種陽

性比較。系統包含目的寡核苷酸，比較DNA聯合蛋白，聯合緩沖液，用于寡核苷酸探針末端標志所需的試劑。Core系統包含含重組AP2蛋白〔AP2抽提液〕的大腸桿菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。AP2抽提液是從表達AP2蛋白的大腸桿菌中提取的。其余，Core系統還含SP1同源寡核苷酸，凝膠遷徙聯合緩沖液，和能作20次比較實驗的HeLa核抽提液。Complete系統含其余5個雙鏈寡核苷酸，分別是AP1、OCT1、CREB、NF-kB、TFIID聯合位點的同源序列。這些寡核苷酸能夠在尾端標志后用作特異性探針，或在競爭實驗頂用作非特異性探針。4.成功進行凝膠遷徙實驗，需要優化哪些要素？凝膠遷徙實驗在理論上很簡單也很迅速，但要成功地進行凝膠遷徙實驗，需要優化一些參數，這主要受聯合蛋白的根源和探針聯合位點特色的影響。以下是需要優化的要素：抽提液的制備〔核酸酶和磷酸酶污染會使探針降解〕，聯合蛋白的濃度，探針的濃度，非特異性探針的濃度，緩沖液的配方和pH，聚丙烯凝膠電泳的特色和電泳條件，保溫時間和溫度，載體蛋白，能否有協助因子〔比方鋅，或鎘等金屬離子，或激素〕。總之，反應整體積應最小〔20μ〕l。為知足一般要求，聯合緩沖液含4%甘油，1mMMgCl2，0.5mMEDTA，0.5mMDTT，50mMNaCl，10mMTris-HCl〔〕，0.05mg/mlpolydI:dC，或10mMHEPES〔〕，50mMKCl，1mMDTT，1mMEDTA，10%甘油，0.05mg/mlpolydI:dC可作為優化實驗的初步。5.在DNA探針的選擇上，要考慮哪些重要要素？目的DNA的長度應小于300bp，以有益于非聯合探針和蛋白DNA復合物的電泳分別。雙鏈的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝膠遷徙實驗頂用作探針。如目的蛋白已被判斷，那么應用短的寡核苷酸片段〔約為25bp〕，這樣聯合位點可和其余因子的聯合位點差別開。長

的限制性酶切片段可用于對推定的啟動子/加強子地區內的蛋白聯合位點定位。隨后可用DNaseI印跡對蛋白聯合的特異地區在DNA序列水平上作出分析。6.用以下一些轉錄調理因子和HeLa細胞核抽提物可形成哪些復合物：AP1,AP2,CREB,NFkB,Oct1,Sp1,TFIID,TFIIB。當用HeLa細胞核抽提物作為聯合蛋白的根源時，每1個轉錄調理因子和它有關的DNA同源序列聯合形成特色型的聯合形態。以下的文字描繪了每一個獨自的轉錄調理因子，包含鑒識的同源序列，因子的大小，特定的聯合條件，以及和HeLa細胞核抽提物可形成的復合物的數量。1．細胞核蛋白提取：取約8.8×106個HSC-T6細胞，5mlPBS/PhosphataseInhobitors沖刷，采集細胞。參加0.25ml1×Hypotonicbuffer重懸，冰浴15min；參加25μlNP-40，震蕩10s；14000×g離心，30s，4℃；采集上清即胞漿蛋白，于‐70℃保留。將積淀重懸于50μlLysisbuffer〔含DTT和ProteaseInhibitorCocktail〕中，震蕩10s；置于搖床中冰浴30min，150次/min；再次震蕩30s，14000×g離心，10min，4℃；取上清即為核蛋白，于‐70℃保留，測定蛋白質濃度。2．寡核苷酸探針的標志和純化:rat：NF-κB：5′AGTTGAGGG