淺談幾種常用分子生物學技術的原理及其在昆蟲分類中的應用摘要：在以分子生物學技術占主導地位的生物世紀，分子生物學技術已被應用到生物科學當中，當然應用到昆蟲分類中也起到了很明顯的成效。本文主要介紹了核酸序列分析、RFLP技術、RAPD技術、分子雜交技術、同工酶電泳技術、SSCP和DSCP技術等幾種常見分子生物學技術的原理及其在昆蟲分類中的應用。通過總結分析得出分子生物學技術在昆蟲分類中有著重大的意義。關鍵字：分子生物學技術；昆蟲分類；核酸序列分析；同工酶電泳技術隨著生命科學和化學的不斷發展，人們對生物體的認知已經逐漸深入到微觀水平。從單個的生物體到器官到組織到細胞，再從細胞結構到核酸和蛋白的分子水平，人們意識到可以通過檢測分子水平的線性結構（如核酸序列），來橫向比較不同物種，同物種不同個體，同個體不同細胞或不同生理（病理）狀態的差異。因此分子生物學技術在現代生物學研究工作中起著至關重要的作用。這里主要介紹了幾種常用分子生物學技術的原理及其在昆蟲分類中的應用。1核酸序列分析現代生物學研究業已證實核酸是生物遺傳的本質，他決定著生物體的形態性狀。因此通過核酸序列分析能從根本上對生物進行鑒定分類，當然核酸序列分析在昆蟲分類工作中也會起著至關重要的作用。在昆蟲體內，有細胞核DNA和線粒體DNA兩種DNA。1.1線粒體DNA的研究線粒體DNA為雙鏈閉環分子,昆蟲的線粒體DNA大小為15.4～16.3kb,其中含有編碼2個核糖體RNA(12SrRNA,16SrRNA)、22個tRNA、1個細胞色素b、3個細胞色素氧化酶(COI、COII、COIII)、6個NADH降解酶(ND1～6)和2個ATP酶(6和8)的基因。目前,通常用于鞘翅目昆蟲分類研究的基因有以下幾種:16SrRNA、ND4、ND5、COI等。我國研究者劉曉麗和任國棟測定了9種擬步甲科昆蟲的16SrDNA部分基因序列,并與GenBank中的1種步甲的基因序列作同源性比較,構建了分子系統樹,對它們的親緣關系進行研究,結果與傳統的分類觀點相吻合[1]。李偉豐等對來自不同國家的7種長蠹科害蟲的線粒體DNAND4基因的部分序列進行測定,發現這7種昆蟲不僅在外形特征上存在差異,并且在ND4基因序列上也存在明顯差異[2]。這為長蠹科昆蟲的準確鑒定提供了充分的證據。日本學者普遍認為日本步甲是在冰河世紀時從歐亞大陸傳入日本的,然而Tominaga等學者通過線粒體ND5基因比較和日本地史學研究,發現日本的步甲是來源于在歐亞大陸分離時本身居住在日本的步甲祖先[3]。我國也有不少研究者也利用線粒體DNA的部分基因序列對瓢蟲進行分類。1.2核糖體DNA的研究核糖體DNA(ribosomalDNA,rDNA)是編碼核糖體RNA的基因,是一類中度重復的DNA序列,以串聯多拷貝形式存在于染色體DNA中。每個重復單位由非轉錄間隔區、轉錄間隔區和3種RNA基因編碼區組成。由于rDNA是生物界普遍存在的遺傳結構,具有多拷貝性、編碼區保守、轉錄間隔區中度保守等優點,因而在個體及群體內有較好的均一性,少量樣品能有效代表其來源群體的rDNA的變異情況。因此,rDNA已成為生物系統進化研究中一個非常有用的分子標記。日本學者利用28SrDNA對發光叩甲的進化進行研究,通過構建系統樹發現叩甲祖先是不發光的,這表明發光的叩甲是獨立于其它發光的甲蟲而進化的。Bocakova等對核基因18SrDNA和28SrDNA、線粒體基因16SrDNA和COI進行擴增,并構建系統進化樹,研究發現盡管鞘翅目的關鍵特征在叩甲類昆蟲中受到很大程度限制,但它們有多重的起源,說明世系和獨立地獲得相似特征的關系密切[4]。鄭福山等通過對我國菱角螢葉甲6個地理種群和褐背小螢葉甲揚州種群的ITS1進行測序,發現ITS1在小螢葉甲屬昆蟲中進化速度較快,種下具有一定差異,種間差異明顯,該基因適合小螢葉甲屬種間和屬下的分類鑒定研究[5]。Kawamura等對世界各主要疫區甘薯象甲的ITS1進行擴增,獲得557～587bp的序列,來源于印度的象甲ITS1序列明顯較長,系統發生樹明顯可以分為印度的和東亞的2個分支[6]。Contreras2Díaz等利用線粒體DNA和ITS2序列對加那利群島的步甲進行分析,系統進化樹表明該地區步甲可以分為2個分支,一支包含由來源于拉戈梅拉島照葉林和特納里夫的步甲,另一支包含大加那利島和來源于西方4個島嶼的步甲[7]。Gómez2Zurita等對47個葉甲樣品(34種)的ITS2序列進行研究,發現葉甲的ITS2序列和其它葉甲總科昆蟲的ITS2有相似性,但和其它節肢動物的ITS2沒有明顯相似性[8]。2RFLP技術限制性片段長度多態性(RFLP)是指用限制性內切酶處理不同的DNA，產生不同長度的限制性片段所呈現的多態現象?？筛鶕盖袌D譜,計算類群之間的遺傳距離,構建系統樹,此方法既可以進行近緣種及種內群體間的比較,同時也可以進行遠緣物種的比較,主要用于構建基因組連鎖圖譜及確定物種間的親緣關系。由于RFLP技術存在許多局限性：現有的限制性內切酶不可能檢出所有的核苷酸改變、酶切所產生的不同長度的酶切片段所能提供的多態信息量有限等,目前在鞘翅目昆蟲分類研究中的應用不多,國內主要應用于雙翅目、膜翅目等昆蟲的快速鑒定。3RAPD技術隨機擴增多態性DNA(RAPD)技術在PCR的基礎上,利用隨機合成的寡聚核苷酸序列為引物(一般為10個nt),分別與DNA的2條單鏈結合,在DNA聚合酶的作用下,對基因組特定區域進行PCR擴增。由于不同物種基因組中與引物相匹配的堿基序列的空間位置和數量都可能不同,所以擴增產物的大小也有可能不同,即擴增片段DNA的多態性反應了基因組DNA相應區域的多態性。此方法的優點是快速簡便、反應靈敏,對遺傳背景不清楚的材料也能可應用。目前已經廣泛應用于同翅目、蜻蜓目、等翅目、直翅目、雙翅目、鱗翅目、膜翅目等昆蟲的分類研究中。其中在鞘翅目的分類研究中應用最多。安榆林等利用RAPD技術對采自中國和美國光肩星天牛8個地理種群進行遺傳關系分析,發現美國的和中國的光肩星天牛種群的樣本之間存在顯著差異,遺傳關系較遠。隨后,他們又對更多的采自中國、美國和韓國各地的光肩星天牛進行RAPD聚類分析,研究結果與前一結果一致。李志強等利用RAPD技術證實遼寧省不同地域稻水象甲存在遺傳差異,并分析了這一差異性對追溯稻水象甲傳播過程和開展其傳播蔓延控制的意義。張迎春等利用RAPD技術對瓢蟲科的6個種進行親緣關系分析,該結果與形態學分類結果一致[9]。Scataglini等利用RAPD對來自不同國家的墨西哥棉鈴象甲進行系統發育分析,其系統樹顯示了墨西哥棉鈴象甲不同種群的親緣關系的遠近，從而揭示了南美洲棉鈴象甲是先于棉花的粗放耕作而自然發生的，它們的爆發可能是和耕地的增加相聯系的[10]。Taberner等利用RAPD技術分析了糖料作物害蟲鞘翅目象甲科的種群遺傳特性,并對各個種群之間的關系進行分析,明確了西班牙南部種群間的生態和進化關系[11]。4分子雜交技術分子雜交是將少量變性的核酸固定在固體支持膜上,用專一性檢測互補核酸序列的標記探針與樣品進行雜交,再通過反射自顯影或酶標顏色反應進行檢測。分子雜交的關鍵是制備特異性強、靈敏度高、具有高比活的探針,目前應用較多的是地高辛和生物素等非放射性標記探針。Lorite等利用原位雜交對葉甲科昆蟲的微衛星進行了研究[12]。由于分子雜交技術要求對研究類群的遺傳背景有一定了解,且該技術相對復雜和昂貴,故在鞘翅目的分類研究中應用并不廣泛。5同工酶電泳技術由于同工酶是基因的產物,能直接反映基因的異同,易于觀察研究,目前已作為一種生化遺傳標志廣泛地應用于發育生物學、群體遺傳學、系統分類學等各個領域。通過物種同工酶的研究,可以推測物種在基因水平的不同,進而可以推測其血緣關系和進化地位。自20世紀70年代中期以來，應用電泳技術進行昆蟲同工酶的研究日益普遍,涉及的昆蟲類群有蜉蝣目、蜚蠊目、直翅目、同翅目、半翅目、虱目、雙翅目、蚤目、鱗翅目、膜翅目等。在鞘翅目昆蟲中,多見于天牛科、瓢甲科、葉甲科。唐樺等通過酯酶同工酶電泳發現光肩星天牛和黃斑星天牛在酯酶帶上差異甚微,認為這2種天牛應歸屬于同1個種[13]。張迎春等分析了瓢蟲科2屬5種的酯酶同工酶,結果顯示屬間的酶譜有顯著差別,在屬內具有某些共性[14]。每個種都具有自己特有的譜型,彼此易于區分。聚類分析顯示5個種親緣關系的遠近,與形態分類結果一致。聶傳朋等分別于2005年和2007年對葉甲科昆蟲酯酶同工酶進行研究,結果表明利用酯酶同工酶分類與傳統分類結果基本一致。說明以酯酶同工酶作為研究手段來進行葉甲類昆蟲亞科以下階元的分類是可行的,同時也說明它們酯酶同工酶酶譜的差異和其分類地位是一致的。6SSCP和DSCP技術單鏈構象多態性(SSCP)技術的原理是基于序列不同的DNA單鏈片段,其空間構象亦有所不同，當其在非變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳時，其電泳的位置亦發生變化而表現出不同序列單鏈電泳遷移率的差異，據此判斷有無突變或多態性存在。該方法對檢測基因的單個堿基置換或短核苷酸片段的插入或缺失的篩查提供了有效而快速的手段。雙鏈構象多態性(DSCP)技術的原理和SSCP基本相似，由于突變引起DNA雙螺旋構象不同,從而在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度發生變化。SS2CP技術已被廣泛應用于人體醫學[43244]、畜牧學[45246]、植物病理學[47251]、昆蟲和線蟲分類學[52257]等研究領域。Boge等采用SSCP技術對步甲屬進行了種的鑒定[30],Sedlimair等也應用泛素基因SSCP技術研究了步甲亞屬的進化關系。隨著分子生物學的迅猛發展,以及核酸序列分析、RFLP技術、RAPD技術、分子雜交技術、同工酶電泳技術、SSCP以及DSCP等分子生物學技術在昆蟲分類研究中的應用和有益探索,或是解決了傳統分類中所存在的學術疑難問題,或是驗證了傳統分類所得出的結論,已顯示出其應有的優勢和廣闊的發展前景。然而分子生物學技術在昆蟲分類研究中的應用時間畢竟不長,還存在不少問題。首先是目的基因或DNA片段的選擇,如何在龐大的昆蟲DNA文庫中選擇最有利于昆蟲分類、最能反映其進化關系的基因或DNA片段,仍存在較大難度。其次是用不同的目的基因或DNA片段對同一昆蟲進行研究,可能會得到不同的結果。再次是分析軟件或程序包的應用,目前有大量的分子生物學分析軟件,不同的軟件或程序包有許多不同的假設和參數,研究者采用不同的分析軟件或采用同一軟件而設置不同的參數,同樣的數據可能會得到不同的結果。如何解決好這些問題是今后昆蟲分子科學研究工作中的重要任務。參考文獻：[1]劉曉麗,任國棟.9種擬步甲16SrDNA部分序列及其親源關系[J].河北大學學報(自然科學版),2004,24(4):3992405.[2]李偉豐,黃永成,陳邦祿,等.7種長蠹科昆蟲的線粒體DNAND4基因序列比較分析[J].植物檢疫,2001,15(5):2572262.[3]TOMINAGAO,SUZH,KIMCG,etal.FormationoftheJapaneseCarabinaFaunainferredfromaphylogenetictreeofmitochondrialND5genesequences(Coleoptera:Carabidae)[J].JMolEvol,2000,50:5412549.[4]BOCAKOVAM,BOCAKL,HUNTT,etal.Molecularphylo2geneticsofElateriformia(Coleoptera):evolutionofbiolumi2nescenceandneoteny[J].Cladistics,2007,23:4772496.[5]鄭福山,杜予州,丁建清.菱角螢葉甲不同地理種群及近緣種rDNA2ITS1基因序列初步分析[J].動物分類學報,2007,32(2):3502354.[6]KAWAMURAK,SUGIMOTOT,KAKUTANIK,etal.Ge2neticvariationofsweetpotatoweevils,Cylasformicarius(Fabricius)(Coleoptera:Brentidae),inmaininfestedareasintheworldbasedupontheinternaltranscribedspacer21(ITS21)region[J].ApplEntomolZool,2007,42(1):89296.[7]CONTRERAS2D1AZHG,MOYAO,OROMIP,etal.Evolutionanddiversificationoftheforestandhypogeanground2bee2tlegenusTrechusintheCanaryIslands[J].MolecularPhylo2geneticsandEvolution,2007,42:6872699.[8]G7MEZ2ZURITAJ,JUANC,PETITPIERREE.Sequence,secondarystructureandphylogeneticanalysesoftheribosomalinternaltranscribedpacer2(ITS2)intheTimarchaleafbee2tles[J].InsectMolecularBiology,2000,9(6):5912604.[9]張迎春,鄭哲民.6種瓢蟲的RAPD分析及在分類上應用的研究[J].西北大學學報(自然科學版),2002,32(4):4092412.[10]SCATAGLINIMA,CONFALONIERIVA,LANTERIAA.Dispersalofthecottonbollweevil(Coleoptera:Curculionidae)inSouthAmerica:evidenceofRAPDanalysis[J].Genetica,2000,108:1272136.[11]TABERNERA,DOPAZOJ,CASTANERAP.Geneticcharacterizationofpopulationsofadenovoarisensugarbeetpest,Aubeonymusmariaefranciscae(Coleoptera:Curculionidae)byRAPDanalysis[J].MolEvol,1997,45:24231.[12]LORITEP,PALOMEQUET,GARNERI,etal.Characteriza2tionandchromosomelocationofsatelliteDNAintheleafbeetleChrysolinaamericana(Coleoptera:Chrysomelidae)[J].Ge2netica,2001,110:1432150.[13]唐樺,鄭哲民.光肩星天牛與黃斑星天牛酯酶同工酶的比較研究[J].北京林業大學學報,2002,24(1):66268.[14]張迎春,鄭哲民,楊建雄,等.五種瓢蟲酯酶同工酶的比較研究及其在分類上的應用(鞘翅目:瓢蟲科)[J].昆蟲分類學報,1999,21(2):1232127.[15]聶傳朋,李焰焰,崔亞東.葉甲三亞科十三種葉甲酯酶同工酶的研究[J].動物分類學報,2007,32(1):1432146.[16]趙煒,高洪梅.PCR2SSCP法檢測人肝癌組織中nm232H1基因突變的研究[J].中國優生與遺傳雜志,2007,15(1):23225.[17]王晶,劉新元.應用PCR2SSCP法檢測乳腺癌患者血中p53基因突變[J].大連醫科大學學報,2006,28(5):4142417.[18]吳珍芳,熊遠著,鄧昌彥,等.豬LPL基因多態及其部分DNA片段的測序[J].華中農業大學學報,1999,18(5):4612465.[19]張淑君,熊遠著,鄧昌彥,等.卵泡刺激素受體基因作為產仔數候選基因的研究[J].華中農業大學學報,2002,21(6):5062508.[20]喬艷艷,楊翠云,于翠,等.煙草環斑病毒外殼蛋白基因片段原核表達載體的構建及表達[J].華中農業大學學報,2008,27(3):3452349.[21]林含新,魏太云,吳祖建,等.應用PCR2SSCP技術快速檢測我國水稻條紋病毒的分子變異[J].中國病毒學,2001,16(2):1662169.[22]魏太云,林含新,吳祖建,等.PCR2SSCP技術在植物病毒學上的應用[J].福建農業大學學報,2000,29(2):1812186.[23]紀春艷,李云鋒,王振中.稻瘟菌糖蛋白激發子CSBⅠ