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DB37山 東 省 地 方 標 準DB37/T4032—2020非洲豬瘟恒溫擴增檢測技術規范TechnicalspecificationforisothermalamplificationdetectionofAfricanswinefever20202020070920200809山東省市場監督管理局發布前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規則起草。本標準由山東省畜牧獸醫局提出并組織實施。本標準由山東省畜牧業標準化技術委員會歸口。非洲豬瘟恒溫擴增檢測技術規范范圍本標準適用于非洲豬瘟的快速檢測、診斷、檢疫、監測和流行病學調查。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法原理單鏈狀態并保護它的完整性。引物與模板雜交，然后在DNA聚合酶的催化下開始擴增。4試劑或材料除非另有規定，在分析中僅使用確認為分析純的試劑。單鏈狀態并保護它的完整性。引物與模板雜交，然后在DNA聚合酶的催化下開始擴增。4試劑或材料除非另有規定，在分析中僅使用確認為分析純的試劑。4.1水：GB/T66821×PBS(pH7.4A.1K（20mg/mL）：A.2；10（SDSpH7.2）A.3；Tris70A.4DEPCB.11.5mL5主要儀器設備10μL、20μL、100μL、1000μLPCR：Peltier16（0.2mL，2×8）0.001g8000樣品GB19489—2008和NY/T541—2016無菌操作，采集豬口腔拭子。無菌操作，取豬的脾、肺、腎、扁桃體、淋巴結、肌肉等組織樣品。2℃～8℃低溫運至實驗室。無菌操作，取豬的脾、肺、腎、扁桃體、淋巴結、肌肉等組織樣品。2℃～8℃低溫運至實驗室。6.2.3環境樣品相關場所的糞便、飼料、污水樣品。2℃～8℃低溫運至實驗室?？谇皇米庸?000r/min震蕩45s，取200μL進行核酸提取。取0.05gPBS6000r/min45s，制成約10離心min，取200μL取1g糞便、飼料放入盛有PBS緩沖液的研磨管中，6000r/min震蕩研磨45s，制成約10%的勻漿液，5000g離心5min，取200μL上清液進行核酸提取。取200μL污水進行核酸提取。7操作步驟7.1取6.250μL1%SS5μL2mgmL蛋白酶K10μL5h～37.2200μLTris，412000g15min7.3500μL200μLTris200μL412000g15min7.4400μL200μL412000g15min7.5300μL22020min，4℃12000g15min1mL7020μL20DNADNA50μLB.2DNAB.3C.1序號通道Ct值結果判斷1FAM未檢測到或40樣本核酸濃度低于檢測限，報告為陰性2FAM≤37報告為陽性3FAM37-40復檢一次，如仍為37-40，則報告為陰性附錄A（規范性附錄）試劑的配制1×PBS(pH7.4)磷酸二氫鉀(KH2PO4)：0.27g。磷酸氫二鈉(Na2HPO4)：1.42g。氯化鈉(NaCl)：8g。氯化鉀(KCl)：0.2g。加滅菌水約800mL充分攪拌溶解，然后加入濃鹽酸調pH值至7.4，最后定容到1L。K(20mg/mL)K100mg滅菌一級水5mL10(SDS溶液，pH7.2)1080mLpH7.2100mLA.470%乙醇無水乙醇70mL30mL附錄B（規范性附錄）恒溫核酸擴增引物、反應液體系與反應條件見表B.1。表B.1恒溫核酸擴增引物引物序列Asfv-F5’-CTTCAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCAC-3’Asfv-R5’-GAGATACAGCTCTTCCAGAYGCATGTTCATC-3’Asfv-Probe5’-AGAGCTGCAGAACTTTGATGGAAACTTA[F]C[T]A[B]AAGATTGATACCATG-3’注：[F]為FAM熒光基團標記、[T]為THF、[B]為BHQ1淬滅基團標記、3’末端為C3Spacer標記。表B.2恒溫核酸擴增反應液體系B.3恒溫核酸擴增反應條件見表B.3。表B.2恒溫核酸擴增反應液體系B.3恒溫核酸擴增反應條件見表B.3。表B.3恒溫核酸擴增反應條件組分用量μLDEPC水8.5ABuffer29.410μM上游引物210μM下游引物210μM探針0.6模板DNA5BBuffer2.5反應條件反應溫度39oC循環數40信號采集每30S反應時間20min圖C.1樣品檢測結果圖圖C.1樣品檢測結果圖附錄C（規范性附錄）樣品檢測結果圖樣品檢測結果見圖C.1。附錄D（規范性附錄）英文縮略表英文縮略表見表D.1。表D.1英文縮略表英文縮寫英文全稱中文名ASFVAfricanswinefevervirus非洲豬瘟病毒RPARecombina