..同行評議組別生理、病理及病理生理學項目編號Y205695XX省自然科學基金申請書申報類別:一般項目項目名稱:促紅細胞生成素受體在心肌缺血再灌注過程中的表達及功能申請者:葉挺梅電話:依托單位:XX學院通信地址:XX市XX學院科研處郵政編碼:323000E-mail:申報日期:2005-5-30XX省自然科學基金委員會二OO五年制基本信息申請者信息姓名葉挺梅性別女出生日期1954年04月01日最終學位其他獲學位年份職稱副教授主要研究領域心血管呼吸生理與藥理E-mail電話個人網頁依托單位XX學院證件類型身份證證件號碼332521540228002申請者是否近三年調入在浙單位工作否調入時間申請者曾主持的XX省自然科學基金資助項目編號:申請者正在主持的國家和省部資助經費在20萬元及以上的研究項目名稱、來源和研究期限:項目基本信息項目名稱促紅細胞生成素受體在心肌缺血再灌注過程中的表達及功能申報類別一般項目研究屬性前瞻性應用基礎研究同行評議組別醫(yī)藥科學/生理、病理及病理生理學依托基地名稱預計研究年限20XX01月－20XX12月總經費預算8.0萬元申請經費8.0萬元項目研究目標、內容和意義簡介<限400字>研究缺血性心臟病時EPO受體的表達和功能。探討心肌細胞表達EPO受體的調控機制,缺血再灌注損傷時心肌組織EPO受體表達分布和時間特征,以及外源性EPO的心臟保護作用與心肌EPO受體功能的關系。同時,觀察外源性EPO治療對于心臟EPO受體表達情況的影響等。通過研究以明確缺血性心臟病時是否存在EPO/EPO受體的內源性保護機制和外源性EPO治療的最佳時間窗,為臨床使用EPO治療急性心肌缺血性損傷提供實驗依據。關鍵詞〔不超過4個心肌；促紅細胞生成素；受體；缺血再灌注同行評議分組說明疾病的生理、病理及病理生理學基礎

重點資助方向重要疾病機理及防治研究..項目組主要成員編號姓名出生日期性別職稱學位單位名稱電話項目分工每年工作時間〔月〔〔<月>1葉挺梅1954年04月01日女副教授其他XX學院負責人62任少華男主任醫(yī)師學士XX市中心醫(yī)院臨床試驗33秦麗君女主治醫(yī)師其他XX市中心醫(yī)院分析試驗34陳偉偉男主任醫(yī)師碩士XX市中心醫(yī)院臨床試驗45郭偉女講師碩士XX學院基礎實驗86陳楠女助教學士XX學院基礎實驗107總人數高級中級初級博士后博士生碩士生參加單位數63210001說明：1.個人介紹部分申請者必須填寫,其他人員可以不填寫；2.高級、中級、初級、博士后、博士生、碩士生及參加單位數由申請者負責填報,總人數自動生成；3.第一人必須是申請者,信息從前面自動讀入,但每年工作時間必須手工錄入。..個人介紹：葉挺梅：大學本科,副教授,XX大學動物科學院兼職碩導,XX省生理科學理事。主要從事醫(yī)學生理學、生物學等生命科學研究。積累了豐富經驗,已發(fā)表論文及教材共30余篇〔本,其主要發(fā)表學術論文有：

1、 葉挺梅、任少華、秦麗君,鈍性心肌挫傷臨床診斷的研究進展,醫(yī)學綜述雜志,20XX5月第5期。

2、 葉挺梅,XX市社區(qū)居民心腦血管病危險因素調查,XX預防醫(yī)學,20XX第16卷第7期。

3、 葉挺梅、葉治國、高琴、夏強,線粒體SLO1通道激活引起的心肌保護作用涉及線粒體滲透性轉換機制,XX大學學報〔自然科學版20XX第6期。

4、 葉挺梅、朱滿蓮,消化系統(tǒng)惡性腫瘤病人及家屬心理健康狀況調查,中國健康心理學雜志,20XX第13卷第3期。

5、 葉挺梅,關于慢性阻塞性肺部疾病急性惡化的臨床研究進展,醫(yī)學綜述雜志,20XX第6卷第6期。

6、 葉挺梅,生理學多媒體仿真教學的改革與探討,XX學院學報,20XX第26卷第7期。

7、 葉挺梅,類風濕性關節(jié)炎患者在騎車和水中奔跑時的心肺反應,國外醫(yī)學,1994年第4期。

8、 葉挺梅,副主編,生理學綱要及試題,中國科學技術出版社出版,20XX1月。

9、 葉挺梅,主編,人體生理學目標檢測,人民中國出版社出版,1998年12月

10、 葉挺梅,主編,生理學學習輔導,中國科學技術出版社出版,1994年12月。

主要主持的項目：

1、 菊米對心血管作用的有效成份及其提取技術研究,項目編號：2004C33104,XX省科技廳項目,資助15萬元,研究起止年月：20XX1月至20XX12月。

2、 混胺鉑類配合物的合成及其抗腫瘤作用的研究,項目編號：20040496,XX省教育廳項目。

3、 欠發(fā)達地區(qū)中老年身心健康研究,項目編號：KY04003,XX學院校級項目,立項時間：20XX3月。

學術獎勵：1、獲第十二屆〔2001---20XXXX省自然科學優(yōu)秀論文二等獎〔證書編號：032087003

2、獲XX學院教師現代教學技能比賽三等獎,證書編號：2003145

任少華：

主任醫(yī)師,從事心血管、呼吸方面研究,現任XX中心醫(yī)院呼吸科主任醫(yī)師、科教科副科長。是國家級刊物《國外醫(yī)學呼吸分冊》第三屆編委會和《國外醫(yī)學腫瘤學分冊》第二屆編委會特邀編輯。在心血管和呼吸專業(yè)領域具有較高的學術造詣。率先開展了"纖維支氣管鏡替代胸腔鏡檢查和治療""纖維支氣管鏡引導下經鼻氣管插管","經纖維支氣管鏡選擇性支氣管造影","根據支氣管肺泡灌洗液內毒素水平快速診斷革蘭氏陰性菌肺炎"和"控制性高碳酸血癥機械通氣治療"和"胸管負壓吸引引流治療巨型肺大皰"〔該技術被北平醫(yī)藥信息中心收編于《中國疑難病求醫(yī)問藥信息庫》等診療新技術。善于學習引用國際先進醫(yī)學科學技術,應用于臨床實踐,積極總結臨床經驗和引進先進醫(yī)學知識,在《中華結核和呼吸雜志》、美國《Chest》和英國《Thorax》等大型權威雜志發(fā)表臨床論文１５篇,其中多篇被《BiologicalAbstract》,《CurrentScience》等國際索引文獻收錄。多次獲省自然科學論文獎。在國家級刊物發(fā)表綜述文章50余篇,文摘200余篇。公開發(fā)表文字40余萬,連續(xù)三屆榮獲"世界科技譯報"好譯者獎。XX市第三批有突出貢獻中青年專業(yè)技術人才。

申請經費預算8.0萬元計劃開支項目名稱計算根據及理由金額〔萬元1．信息費資料費文印費上網信息費論文版面費0.52．專題學術活動費國際國內學術會議差旅會務費國內外期刊論文版面費0.53．儀器和設備購置費實驗等相關儀器如顯微鏡電子天平0.54．能源材料費公辦耗材費實驗動物實驗藥品等5.55．計劃管理費按學校規(guī)定提取0.46．人員費加班等補助費0.6注：開支范圍和標準參見《XX省省級科技項目經費管理暫行辦法》〔浙財教字[2002]20號。申請者承諾：我保證：〔1申請書內容是真實的；〔2恪守科學道德,倫理道德的基本原則；〔3項目組成員知曉申請書內容,并自愿參與研究工作；〔4已如實填報申請者正在主持的國家和省部資助經費在20萬元及以上的研究項目名稱、來源和研究期限；〔5如果獲得資助,我將履行項目負責人職責,嚴格遵守XX省自然科學基金委員會的有關規(guī)定,切實保證研究工作時間,認真開展工作,按時報送有關材料。若填報失實或違反規(guī)定,本人將承擔全部責任。簽字：日期：項目依托單位承諾:已按規(guī)定對申請人的資格和申請書內容進行了審核。申請項目如獲資助,我單位保證對計劃實施所需要的人力、物力和工作時間等條件給予保障,嚴格遵守XX省自然科學基金委員會有關規(guī)定,督促項目組遵守科學道德和倫理道德的基本原則,督促項目負責人和本單位項目管理部門按照規(guī)定及時報送有關材料。依托單位公章日期.促紅細胞生成素受體在心肌缺血再灌注過程中的表達及功能1、項目研究意義隨著溶栓和急診介入治療的廣泛開展,心肌梗死患者短期和長期的生存率得到顯著提高,但仍有相當部分存活的患者隨后發(fā)生進行性心力衰竭。缺血/再灌注導致的心肌損傷是目前心機梗死治療中有待解決的關鍵問題,有文獻報道,心肌缺血/再灌注過程中凋亡的發(fā)生是導致心肌損傷的重要機制之一[1]。凋亡是細胞程序性死亡,因此,可以通過早期干預減少凋亡的發(fā)生,從而降低心肌在缺血復灌過程中的損傷[2]。在動物實驗中已經證實,應用抗凋亡藥物,細胞因子或采用基因治療可減輕心肌缺血/再灌注損傷。但目前某些抗凋亡方法尚不能應用于臨床,而已有抗心肌再灌注損傷的臨床試驗未見顯著的心肌保護作用[1]。因此,有必要探索一種既可用于臨床,又具有顯著心肌保護作用的治療方法,作為心肌梗死再灌注治療的輔助治療,以減輕心肌損傷。促紅細胞生成素〔Erythropoietin,EPO是第一個被克隆的造血生長因子,以往主要用于促進紅細胞生成以糾正貧血,在臨床上已被廣泛使用十余年。其造血活性的主要機制為抑制晚紅系祖細胞凋亡而非直接刺激細胞生成[3]。隨著EPO受體在腦、肝臟、子宮等器官及實體腫瘤組織的發(fā)現,EPO的髓外作用日益受到重視[4]。近十年的研究主要集中于EPO的腦保護作用,EPO/EPO受體通過抗凋亡、抗炎、抗氧化等機制,可預防或減輕神經系統(tǒng)缺血/再灌注損傷[5]。一項已完成的EPO對缺血性中風病人安全性和療效的隨機雙盲臨床試驗,對于中風8小時內的患者,連續(xù)3天經靜脈使用重組EPO〔recombinantEPO,rEPO,觀察30天顯示rhEPO對于急性缺血性中風患者能有效縮小梗塞面積和改善臨床表現[6]。同時在心肌細胞也發(fā)現EPO受體的存在。已有研究表明EPO可在細胞水平顯著減少缺氧誘導的大鼠心肌細胞凋亡,同時器官水平研究表明EPO可減少缺血再灌注心肌損傷和梗死心肌的范圍,改善心功能[7]。在缺血再灌注的不同時期,包括心肌缺血前、缺血時及再灌注時使用單一劑量rEPO均能產生顯著心肌保護作用[8]。由于單一劑量EPO治療后3~5天才可見外周循環(huán)中紅細胞增加,因此EPO的心臟保護作用與增加紅細胞濃度無關,直接保護機制可能包括：〔1減少心肌細胞凋亡；〔2穩(wěn)定內皮細胞和促進血管生成[9]；〔3動員骨髓內皮祖細胞[10]；〔4減輕缺血和再灌注引起的炎癥反應[11]等。體內EPO主要由腎臟分泌入循環(huán),EPO和細胞膜的EPO受體結合發(fā)揮生物活性,激活多種信號轉導途徑發(fā)揮抗凋亡作用[12]。多種神經細胞可分泌EPO和表達EPO受體,EPO/EPO受體系統(tǒng)被認為是腦缺血損傷的內源性保護機制,在腦缺血/再灌注或持續(xù)局部腦缺血時,神經細胞上調EPO受體和分泌EPO增強,并且上調EPO受體要早于增加EPO分泌[13,14]。EPO受體在成年大鼠心肌細胞、內皮細胞和纖維母細胞均有表達[15],細胞EPO受體表達可能與缺氧,胰島素樣生長因子〔insulinlikegrowthfactor,IGF,腫瘤壞死因子〔tumornecrosisfactor,TNF,白介素-1〔interleukin,IL-1和白介素-6〔interleukin6,IL-6等有關[4]。目前尚無心肌組織分泌EPO的證據,調控心肌細胞EPO受體表達的因素尚不明確,對于心肌梗死時是否也存在EPO受體上調尚不清楚。EPO受體的表達分布和時間,對于外源性EPO的治療效果起決定作用。在大鼠離體心臟Langendorff灌注模型中,40min缺血和2h再灌注,EPO受體的表達量和在心肌細胞內皮細胞和纖維母細胞的表達分布未見顯著改變,并且發(fā)現外源性EPO治療使心肌組織EPO受體下調[15]。是否持續(xù)缺血或更長的再灌注時間能使EPO受體的表達量和分布產生影響,以及EPO治療是否會導致EPO受體持久下調等情況,需進一步研究。本項目研究缺血性心臟病時EPO受體的表達和功能。重點探討心肌細胞表達EPO受體的調控機制,缺血和再灌注損傷時心肌組織EPO受體表達分布和時間特征,以及外源性EPO的心臟保護作用與心肌EPO受體功能的關系。同時,觀察外源性EPO治療對于心臟EPO受體表現情況影響等。通過研究以明確缺血性心臟是否存在EPO/EPO受體的內源性保護機制和外源性EPO治療的最佳時間窗,為臨床使用EPO治療急性心肌缺血性損傷提供實驗依據。2、項目研究目標及與申請者研究工作長期目標的關系研究目標：探索心肌細胞表達EPO受體的影響因素,明確心肌缺血損傷時是否存在EPO/EPO受體的內源性保護機制。探索外源性EPO對于心肌保護作用及與EPO受體表達的關系,明確EPO治療的時間要求。EPO治療缺血性心臟病提供實驗依據。與申請者研究工作長期目標的關系：本課題組成員長期從事心血管疾病治療和細胞移植治療的研究,在心血管生理學、細胞生物學分子生物學、分子遺傳學和病理學等方面做了大量的工作,積累了豐富的理論和實踐經驗。3、項目研究內容,研究方案和進度安排研究內容：第一部分：體外實驗：大鼠心肌細胞EPO受體表達及影響因素1、低氧及IL-6等細胞因子對體外培養(yǎng)的心肌細胞EPO受體表達的影響：觀察體外培養(yǎng)的心肌細胞EPO受體表達情況,以及在低氧和/或與心肌梗死相關的IL-6等細胞因子對于心肌細胞EPO受體表達的影響。2、外源性EPO對缺氧心肌細胞損傷的保護作用及EPO受體的表達變化：觀察外源性EPO對于心肌細胞的保護作用,以及EPO處理對于心肌細胞表達EPO受體的變化。第二部分：在體實驗：缺血損傷對于心肌細胞表達EPO受體的影響1、缺血性損傷時心肌表達EPO受體改變及分布：觀察缺血再灌注及心肌梗死模型中缺血區(qū)域心肌細胞、內皮細胞及間質細胞表達EPO受體情況及隨時間的改變。2、缺血性心肌損傷時循環(huán)中EPO濃度改變及時間特征：觀察缺血再灌注及心肌梗死時循環(huán)中EPO濃度改變,隨時間的濃度曲線,以及與EPO表達相關的細胞因子水平的改變。3、外源性EPO對缺血心肌的保護作用及對EPO受體影響：觀察外源性EPO對于缺血再灌注及心肌梗死的保護作用和EPO治療開始時間及維持治療對于保護作用的影響。觀察外源性EPO對于缺血心肌表達EPO受體的影響。研究方案：第一部分體外培養(yǎng)的心肌細胞EPO受體表達及影響因素1、新生大鼠心肌細胞原代培養(yǎng),光鏡及免疫細胞化學染色鑒定；2、低氧、低糖、TNF、IL-6、EPO等單一或復合條件下培養(yǎng)心肌細胞,使用半定量RT-PCR,WesternBlot和免疫細胞化學染色檢測EPO受體表達情況。并與正常條件培養(yǎng)的心肌細胞對照。3、低氧條件下培養(yǎng)的心肌細胞中加入不同濃度的rEPO,TUNEL法檢測凋亡細胞,免疫細胞化學染色檢測凋亡細胞和存活細胞表達EPO受體表達情況。第二部分缺血損傷對于心肌細胞表達EPO受體的影響1、鉗夾3min或結扎大鼠前降支分別建立大鼠心肌缺血/再灌注和心肌梗死模型。2、再灌注或心肌梗死即刻、2h、6h、12h、24h、4d、7d等不同時間,使用半定量RT-PCR,WesternBlot和免疫組織化學染色檢測EPO受體表達情況,同時以免疫組化確定細胞類型：心肌細胞〔TnT、Cardiacmyosin、內皮細胞〔VE-cadherin,factorⅧ、血管平滑肌細胞〔anti-a-smoothmusclemyosin及疤痕組織〔1型和3型膠原抗體混合物的特異性抗原。TUNEL法檢測凋亡細胞。檢測不同的時間點血漿EPO及IL-6等細胞因子濃度的變化。3、分別在建立模型前、再灌注或心肌梗心即刻、心肌梗死后3h、6h等不同時間點開始皮下注射不同濃度的rEPO〔1000-5000U/Kg,單交或1/d*7,以假手術組和生理鹽水治療組為對照。4、不同時間獲取大鼠心臟,觀察心功能主要參數改變,觀察梗塞區(qū)域病理變化,測定梗死面積,原位凋亡檢測和EPO受體抗體雙染色檢測相關區(qū)域凋亡細胞數量,以及EPO受體表達的關系。關鍵技術：〔1具有心肌細胞細胞原代培養(yǎng)、細胞移植、基因治療及動物體內實驗等相關研究經驗和技術。〔2本校動物實驗、病理檢測、細胞分類鑒定、凋亡檢測及其他實驗條件已具備,可配合實驗的完成。〔3免疫組織化學雙抗體染色：可能出現兩種抗體染色過程相互干擾,擬根據不同的細胞特導性抗體和EPO抗體雙染色,摸索最佳的實驗方案。研究進度計劃：整個研究需要3年完成〔12006.1~2006.12心肌細胞原代培養(yǎng),低氧及細胞因子等條件下心肌細胞表達EPO受體的改變。〔22007.1~2007.6EPO對于體外培養(yǎng)心肌細胞的缺氧損傷保護作用及對于EPO受體表達的影響。〔32007.6~2008.12在大鼠心肌缺血/再灌注和心肌梗死模型中觀察EPO受體表達情況,外源性EPO對心肌的保護作用及對受體表達的影響。總結實驗資料、撰寫論文。技術路線：體外實驗新生大鼠心肌細胞原代培養(yǎng)及鑒定不同條件下培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞原代培養(yǎng)及鑒定不同條件下培養(yǎng)2h-48h低氧、低糖、IL-6、TNF、EPO等低氧條件下加入不同濃度rEPO觀察EPO受體表達情況及與細胞凋亡的關系〔RT-PCR、WesternBlot、TUNEL檢測在體實驗建立大鼠缺血再灌注模型和心梗模型不同時間點給予建立大鼠缺血再灌注模型和心梗模型不同時間點給予rEPO不同時間點觀察缺血組織EPO受體表達分布、表達量及時間特征心功能、梗死范圍、凋亡細胞分布循環(huán)EPO及其他細胞因子濃度等4、項目創(chuàng)新之處〔1EPO被認為具有多種器官的保護作用。腦缺血損傷時,EPO/EPO受體上調發(fā)揮內源性保護機制,目前對于心肌缺血時是否存在同樣的內源性保護機制尚不清楚。本項目探索心肌缺血/再灌注損傷時EPO受體表達的改變,以明確是否存在內源性的EPO心肌保護機制。〔2已有的研究主要觀察EPO對心肌缺血時的保護作用及信號途徑,對于EPO受體在心肌組織中的表達分布及缺血時的表達改變情況尚未見系統(tǒng)研究。本研究重點觀察心肌缺血/再灌注損傷時相應區(qū)域EPO受體的表達情況及時間特征,并研究EPO的心肌保護作用與EPO受體的關系。〔3EPO長期治療腎性貧血時出現療效下降的部分原因為EPO受體下調,目前對于EPO治療后心肌組織EPO受體是否會出現下調而導致保護作用減弱尚不清楚。本研究觀察EPO治療對心臟EPO受體表達的影響。5、工作基礎與工作條件工作基礎：本實驗室已掌握心肌細胞原代培養(yǎng)、大鼠心肌梗死的模型的建立和細胞移植治療等方法,為本課題的完成奠定了良好的基礎。工作條件：本實驗室已具備血細胞培養(yǎng)、動物模型制作、免疫細胞和組織化學染色、半定量RT-PCR及實驗動物心功能測定等基本技術和條件。實驗室相關儀器有外科手術顯微鏡、電子天平〔0.001mg級、各類CO2孵箱、多譜勒超聲儀、各類電泳儀、純水系統(tǒng)及各種冰箱等。本實驗室與XX大學醫(yī)學院生理教研室有長期的科研合作,部分工作能在XX大學完成。6、預期研究結果及其利用研究結果的計劃和今后發(fā)展的思路預期試驗結果：〔1明確心臟是否存在內源性的EPO/EPO受體保護系統(tǒng)。〔2明確心肌缺血損傷時心肌組織表達EPO受體的分布和時間特征,以及EPO治療對于EPO受體表達的影響,為EPO治療尋找合適的時間窗。〔3在國內外專業(yè)雜志上發(fā)表4~6篇研究論著。今后發(fā)展思路：在明確EPO/EPO受體對抗心肌缺血再灌注的保護作用基礎上,進一步深入探討EPO引起EPO受體表達改變的具體分子機制,探討其可能涉及的信號通路。

7、參考文獻[1]EeftingaF,RensingaB,WigmanJ,al.Roleofapoptosisinreperfusioninjury.CardiovascularResearch.2004;61<3>:414-426[2]KitsisaRN,MannDL.Apotosisandtheheart:adecdeofprogress.JournalofMolecularandCellularCardiology.2005;38<1>:1-2[3]FisherJW.Erythropoietin:physiologyandpharmacologyupdate.Erythropoietin.JAMA.2005;293:90-95[4]MaieseK,LiF,ChongZZ.NewAvenuesofExplorationforErythropoietin.JAMA.2005;293-90-95[5]MaieseK,LiF,ChongZZ.Erythropoietininthebrain:canthepromisetoprotectbefulfilled?TrendsinPharmacologicalSciences.2004;25<11>:577-583[6]EhrenreichH,HasselblattM,DembowskiC,etal.ErythorpoietinTherapyforAcuteStrokeIsBothSafeandBeneficial.MolecularMedicine.2002;8<8>:495-505[7]BogoyevitchMA.Anupdateonthecardiaceffectsoferythropoietincardioprotctionbyerythropoietinandthelessonslearntfromstudiesinneuroprotection.CardiovascularResearch.2004;63<2>:208-216[8]LipsicE,MeerP,HenningRH.TimingofErythroietinTreatmentforCardioprotctioninIschemia/Reperfusion.JCardiovascPharmacol.2004;44<4>