RS/TN/ZL-004分光光度法測定纖維素酶酶活/RS/TN/ZL-004分光光度法測定纖維素酶酶活/A/0共4頁第PAGE4頁分光光度法測定纖維素酶酶活適用范圍本方法適用于纖維素酶酶活的測定。測定原理纖維素酶在一定溫度與pH3-氨基-5-硝基水楊酶活單位的定義：每1mL粗酶液，在一定溫度和pH值條件下，1min水解纖維素產生1μg還原糖為一個酶活力單位，以（u/mL）表示。儀器和設備0.0001g。紫外分光光度計。PH0.01PH試劑和溶液除非另有說明，在分析中僅使用分析純試劑和蒸餾水。檸檬酸緩沖液（pH=5.0）磷酸氫二鈉溶液（0.2mol/L：稱取7.16g磷酸氫二鈉溶解于蒸餾水中，定容至100ml檸檬酸溶液0.1mol/：稱取2.1g檸檬酸溶解于蒸餾水中，定容至100m。取上述配制的磷酸氫二鈉溶液24.3ml、檸檬酸溶液25.7ml混勻即為檸檬酸緩沖液，其pH值為5.0。羧甲基纖維素溶液）2.0g200ml20ml40ml4℃條件下備用。3,5-二硝基水楊酸顯色液）3,56.3g600ml20.8g50℃的水182g，苯酚5g5g澄清后，冷卻至室溫，用水定容至1000ml，過濾。濾液儲存于棕色瓶中暗處放置7天后使用。標準葡萄糖溶液準確稱取105℃烘干至恒重的無水葡萄糖250.000毫克，溶于蒸餾水中，定溶至250ml。分析步驟標準曲線的繪制1編表1編葡萄糖標準溶液的濃度取1mg/mL葡萄糖標取水的體積吸光值號（mg/mL） 準溶液的體積mL mL Abs.0002.510.042020.084030.126040.168050.20100分別吸取1mg/ml4.06.050ml再分別吸取上述溶液各10.0mlDNS試劑10m5mi（另作一個對照，取10.0ml蒸餾水加10mlDNS試劑，同樣煮5mi，冷卻后，用分光光度計于530nm波長處測吸光值（比色皿10mm*10m，以吸光度為縱坐標，對應標準葡萄糖溶液含糖的毫克數為橫坐標，繪制標準曲線。樣品測定待測酶液的制備液體酶樣：準確吸取樣品10.0ml于100ml容量瓶中，用適宜溶劑（蒸餾水或者緩沖溶液）定容至刻度。控制稀釋樣品酶活力在100u/ml—1000u/ml范圍內。固體酶樣：準確稱取樣品4.0g，精確至0.0002g。用適量適宜溶劑（蒸餾水或者緩沖溶液）溶解后，定容至100ml。再將定容溶液用定性濾紙過濾后，準確吸取10.0ml，用相應溶劑定容至100ml。控制稀釋樣品酶活力在100u/ml—1000u/ml范圍內。測定按下列程序操作：試管A（空白） 試管B（酶試樣，需作三個平行試樣）加CMC溶液8.00mL 加CMC溶液8.00mL↓ ↓50±0.2℃保溫，3min 保溫，3min↓ ↓加DNS試劑10.00搖勻） 加酶液2.00mL（搖勻）↓ ↓50±0.2℃保溫，30min（精確計時） 保溫，30min（精確計時）↓ ↓加酶液2.00mL（搖勻） 加DNS試劑10.00搖勻）↓ ↓沸水煮沸，10min 沸水煮沸，10min↓ ↓冷卻至常溫 冷卻于530nm波長，測定樣品葡萄糖濃度結果計算液體樣品酶活力的計算從標準曲線上讀出樣品最終稀釋液的酶活力，單位為u/ml。樣品的酶活力按式（1）計算：XC20n1000 （1）60式中：X—樣品的酶活力C—由標準曲線讀出的還原糖的濃度n—所測樣品稀釋倍數20—檢測試樣體積1000—將還原糖單位mg換算為μg60—將酶液體積換算為1ml，水解時間換算為1min。所得結果表示至整數。固體樣品酶活力的計算固體樣品的酶活力換算按式（2）計算：X'

XVm

（2）式中：X'—固體樣品的酶活力，(u/g)；X—固體樣品溶解定容后的酶活力，(u/mL)；V'—樣品定容體積，ml；m—稱取樣品的質量，g；所得結果表示至整數。檢驗注意事項緩沖溶液配制注意事項緩沖溶液配制完成后，用PH計測定其PH值，若PH值不在規定范圍內，需用相應的試劑調PH值至規定要求。多個樣品同時檢驗注意事項如果有多個樣品進行檢測，樣品處理過程：預熱→加酶液→保溫→加DNS