第35講

基因工程轉魚抗寒基因的番茄轉基因鮭魚人類按照自己的愿望，進行嚴格的設計，通過體外DNA重組和轉基因技術，賦予生物新的遺傳特征。抗蟲害的玉米第一章：基因工程一、概念：基因工程又叫做基因拼接技術或DNA重組技術。這種技術是在生物體外，通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導入受體細胞內進行無性繁殖，使重組基因在受體細胞內表達，產生出人類所需要的基因產物。

基因工程的別名基因拼接技術或DNA重組技術操作環境生物體外操作對象基因操作水平DNA分子水平基本過程剪切→拼接→導入→表達結果人類需要的基因產物實質：基因重組限制酶的識別序列限制酶所識別的序列的特點是：呈現堿基互補對稱，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的，稱為回文序列

黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。平末端平末端SmaI限制酶的切割當限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。二、操作的工具2、基因的針線——DNA連接酶

（1）作用：將互補配對的DNA片段連接起來，使之成為一個完整的DNA分子。（2）作用部位：形成磷酸二酯鍵（3）常見DNA連接酶①EcoliDNA連接酶(來自大腸桿菌)-----只作用于黏性末端。②T4噬菌體連接酶-----既連接黏性末端又作用于平末端，但連接平末端的效率較低。兩DNA片段要具有互補的黏性末端才能拼起來DNA連接酶的縫合作用可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，DNA連接酶DNA聚合酶相同點作用實質化學本質不同點模板作用對象作用結果 用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質

不需要需要形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復制（4）DNA連接酶與DNA聚合酶的比較只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵載體的作用載體的必要條件載體的種類3、基因的運輸工具--載體1）能夠在宿主細胞中復制并穩定地保存。2）具多個限制酶切點，以便與外源基因連接。3）具有某些標記基因，便于進行鑒定和選擇。4）必須是安全的，對受體細胞無害。5）載體DNA分子應大小適中，以便于提取和操作1）作為運載工具，將目的基因導入受體細胞中2）在受體細胞內對目的基因進行大量復制①細菌的質粒②病毒：噬菌體、動植物病毒等。

有標記基因的存在，可用含青霉素的培養基鑒別。有切割位點能復制并帶著插入的目的基因一起復制質粒——裸露的、結構簡單的、獨立于細菌染色體（即擬核DNA）之外，并具有自我復制能力的很小的雙鏈環狀DNA分子。最常用運載體——質粒

實際上在基因工程操作中，真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的。1.2基因工程的基本操作程序提取目的基因的方法用限制酶切斷成許多片段⑴直接分離基因——鳥槍法將供體生物的DNA用限制酶切割為許多片段，再用運載體將這些片段都運載到受體生物的不同細胞中去。只要有一個細胞獲得了需要的目的基因并得以表達，基因工程就算成功了。

該法最大的缺點是帶有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能將真核生物的基因轉移到原核生物中去。⑵人工合成基因法DNA合成儀有兩種方法：

①逆轉錄法：以信使RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下將脫氧核苷酸合成合成DNA(基因)。

②直接合成法：根據蛋白質的氨基酸順序推算出信使RNA核苷酸順序，再據此推算出基因DNA的脫氧核苷酸順序。用游離脫氧核苷酸直接合成相應的基因。（4）聚合酶鏈反應（PCR）擴增

概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術

聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段原理：DNA復制四種脫氧核苷酸(dNTP)等

模板DNA(需含有目的基因)

條件：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物前提：TaqDNA聚合酶等

PCR儀2、構建表達載體用與提取目的基因相同的限制酶切割質粒使之出現一個切口，將目的基因插入切口處，在連拉酶的作用下連接形成重組DNA分子。一個完整的表達載體包括：目的基因，標記基因，啟動子，終止子。知識點一：1.原核細胞的基因結構非編碼區非編碼區編碼區編碼區上游編碼區下游與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉錄終止。RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結合位點并與其結合的一種蛋白質.(以模板轉錄然后脫落)①不能轉錄為信使RNA，不能編碼蛋白質。：能轉錄相應的信使RNA，能編碼蛋白質編碼區非編碼區原核細胞的基因結構②有調控遺傳信息表達的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區上游的RNA聚合酶結合位點。非編碼區非編碼區編碼區編碼區上游編碼區下游啟動子終止子真核細胞的基因結構編碼區非編碼區外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列：有調控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區上游的RNA

聚合酶結合位點等。非編碼序列：包括非編碼區和內含子原核細胞真核細胞不同點編碼區是_____的編碼區是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質的______和具有調控作用的______區組成的原核細胞與真核細胞的基因結構比較思考編碼相同數目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？連續不連續編碼區非編碼3、將目的基因導入受體細胞（轉化）導入擴增要讓目的基因表達，必須將它導入受體細胞并進行擴增。為使重組的DNA分子更容易進入受體細胞，通常還要用一些物質對受體細胞進行處理，使受體細胞具有更大的通透性。（一）轉化：（二）方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態細胞目的基因進入_________內，并且在受體細胞內維持_____和_____的過程受體細胞穩定表達【將目的基因導入植物細胞的方法】（1）農桿菌轉化法

①農桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染能力【將目的基因導入動物細胞】

方法：顯微注射法

程序：目的基因表達載體提純取卵（受精卵）顯微注射受精卵新性狀動物【將目的基因導入微生物細胞】

原核生物特點：繁殖快、單細胞、

遺傳物質少

方法：

用Ca2+處理細胞感受態細胞表達載體與感受態細胞混合感受態細胞吸收DNA分子檢測—鑒定—①檢測轉基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交基因探針與mRNA雜交抗原抗體雜交4、目的基因的檢測和表達基因探針

基因探針就是一段與目的基因或DNA互補的特異核苷酸序列。它包括整個基因，或基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉錄而來的RNA。歸納步驟【檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因】①首先取出轉基因生物的基因組DNA；②用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針；③使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中。（1）方法:DNA分子雜交（2）過程:【檢測目的基因是否轉錄出了mRNA】【檢測目的基因是否翻譯成蛋白質】①方法:基因探針與mRNA雜交方法：抗原抗體雜交②過程:

用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現雜交帶,表明目的基因轉錄出了mRNA抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等鑒定（個體生物學水平）基因操作的基本步驟（四）基因工程的成果與發展前景1、基因工程與醫藥衛生2、基因工程與農牧業、食品工業3、基因工程與環境保護1、基因工程與醫藥衛生我國生產的部分基因

工程疫苗和藥物（1）基因工程藥品的生產微生物生長迅速，容易控制，適于大規模工業化生產。如利用大腸桿菌生產胰島素、干擾素、白細胞介素—2等。既增加產量，又降低成本。胰島素是治療糖尿病的特效藥。一般臨床上使用的胰島素主要從豬、牛等家畜的胰腺中提取，每100kg胰腺只能提取4~5g胰島素。用該方法生產的胰島素產量低，價格昂貴，遠不能滿足社會需要。1979年，科學家將動物體內的胰島素基因與大腸桿菌DNA分子重組，并在大腸桿菌內實現了表達。1982年，美國一家基因公司用基因工程方法生產的胰島素投入市場，售價降低了30%~50%。基因工程藥品——胰島素治療侏儒癥的唯一方法，是向人體注射生長激素。而生長激素的獲得很困難。以前，要獲得生長激素，需解剖尸體，從大腦的底部摘取垂體，并從中提取生長激素。現可利用基因工程方法，將人的生長激素基因導入大腸桿菌中，使其生產生長激素。人們從450L大腸桿菌培養液中提取的生長激素，相當于6萬具尸體的全部產量。基因工程藥品——生長激素（2）基因診斷基因診斷是用放射性同位素(如32P)、熒光分子等標記的DNA分子做探針，利用DNA分子雜交原理，鑒定被檢測標本上的遺傳信息，達到檢測疾病的目的。1）β—珠蛋白的DNA探針→鐮刀狀細胞貧血癥2）苯丙氨酸羧化酶基因探針→苯丙酮尿癥3）白血病患者細胞中分離出的癌基因制備的DNA探針→白血病（3）基因治療基因治療是把健康的外源基因導入有基因缺陷的細胞中，達到治療疾病的目的。取患者骨髓分離干細胞病毒正常基因并入正常基因的干細胞注入患者體內（1）農業上：獲得高產、穩產和具優良品質的農作物

用基因工程的方法可以改善糧食作物的蛋白質含量。如“向日葵豆”植株。培育具抗逆性的作物新品種

將細菌的抗蟲、抗病毒、抗除草劑、抗鹽堿、抗干旱、抗高溫等抗性基因轉移到作物體內，將從根本上改變作物的特性。如轉基因抗蟲棉。2、基因工程與農牧業、食品工業繁殖具有抗病能力、高產仔率、高產奶率和高質量的皮毛等優良品質的轉基因動物。該過程的重要步驟是通過感染或顯微注射技術將重組DNA轉移到動物受精卵中。（2）畜牧養殖業上將人的生長激素基因和牛的生長素基因分別注射到小白鼠受精卵中，得到的“超級小鼠”。

基因工程為人類開辟新的食物來源。

1）雞蛋白基因在大腸桿菌和酵母菌中表達獲得成功。這表明，未來能用發酵罐培養的大腸桿菌或酵母菌來生產人類所需要的卵清蛋白。

2）用基因工程的方法從微生物中獲得人們所需要的糖類、脂肪和維生素等產品。（3）食品工業中：轉黃瓜抗青枯病基因的甜椒轉魚抗寒基因的番茄3、基因工程與環境保護（1）環境監測

基因工程做成的DNA探針能夠十分靈敏地檢測環境中的病毒、細菌等污染。利用基因工程培育的“指示生物”能十分靈敏地反映環境污染的情況，卻不易因環境污染而大量死亡，甚至還可以吸收和轉化污染物。（2）環境污染治理

基因工程做成的“超級細菌”能吞食和分解多種污染環境的物質。1、有些轉基因食物含的一些物質，可能會影響人體健康。2、大量的轉基因生物進入自然界后很可能會與野生物種進行雜交，產生一些超級生物，從而造成基因污染。3、如有些作物插入抗蟲基因，殺死環境中有益的生物。基因工程的弊端蛋白質工程一、蛋白質工程崛起的緣由1、基因工程的應用（1）基因工程的實質：將一種生物的

轉移到另一種生物體內，使后者產生本不能產生的

，進而表現出新的

。（2）基因工程的不足：在原則上只能生產自然界已存在的

。2、天然蛋白質的不足天然蛋白質是生物在長期

過程中形成的，它們的

符合特定物種

的需要，卻不一定完全符合人類生產和生活的需要。3、蛋白質工程的目的生產符合人類生產和生活的需要的

。基因蛋白質性狀蛋白質進化結構和功能生存蛋白質1、蛋白質工程的概念基礎:蛋白質工程的實質：途徑:目標:蛋白質的結構和功能基因修飾或基因合成改造或制造新的蛋白質，滿足人類的生產或生活的需要是對編碼蛋白質的基因進行改造二、蛋白質工程的概念和原理對天然蛋白質進行改造，你認為直接對蛋白質分子進行操作，還是通過對基因的操作來實現？蛋白質工程的流程基因DNA氨基酸序列多肽鏈蛋白質三維結構預期功能生物功能mRNA轉錄翻譯折疊DNA合成分子設計2、蛋白質工程原理天然蛋白質的合成途徑：基因表達（轉錄和翻譯）形成氨基酸序列的多肽鏈形成具有高級結構的蛋白質行使生物功能預期的蛋白質功能出發設計預期的蛋白質結構推測應有的氨基酸序列找到相應的脫氧核苷酸序列酸蛋白質工程的途徑：對蛋白質進行改造大改中改小改設計、制造出自然界不存在的全新蛋白質替代某一個肽段或一個特定的結構域改造某個活性單位的一個或幾個氨基酸殘基（定點誘變技術）核心技術

蛋白質的分子設計與改造蛋白質工程首先是以蛋白質的結構為基礎，通過蛋白質的一級結構、晶體結構和溶液構象的研究，積累了成千上萬蛋白質一級結構和高級結構的數據資料，并編制成系統的數據庫，得以從中找出蛋白質分子間的進化關系、一級結構和高級結構的關系、結構與功能的關系方面的規律。基因定點誘變技術的示意圖異亮氨酸蘇氨酸天門冬酰胺天門冬酰胺酵母菌丙糖磷酸異構酶熱穩定性提高50％工業生產上三、蛋白質工程的應用1、改造酶結構，提高酶的熱穩定性和催