遺傳病的實驗室檢查手段進展北大醫院實驗中心戚豫研究員2022/11/11遺傳病的實驗室檢查手段進展北大醫院實驗中心2022/10/22007,Illumina推出Solexa;ABI推出SOLid…均能在3天內完成1人的全基因組測序2022/11/122007,Illumina推出Solexa;ABI推出SO2022/11/1遺傳病和基因的數量？遺傳病總數：14,861種(Online-MendelianInheritanceinMan,OMIM,by2015-3-21)人類基因總數：≥24,000個人類各種結構和功能蛋白：100,000種89種表型和基因全清楚；4,381種表現找到致病突變——意味著可做直接的基因診斷的病種很少！已知序列：10,391個基因——可做間接診斷的很多！32022/10/23遺傳病和基因的數量？遺傳病總數：14,8“遺傳病”概念廣義：所有疾病。因為一切人體正常生理功能和病理狀態都是由基因決定的狹義：因基因突變而引發的疾病如何區分三個概念：

遺傳性疾?。号c環境因素引起的疾病對立

先天性疾?。嚎梢允菄a期感染/藥物所致

家族性疾病：可能隨著成員的遷出而終止2022/11/14“遺傳病”概念廣義：所有疾病。因為一切人體正常生理功能和病發病頻率——總計占我國出生人口5.6%；為全球平均5～7倍每一項只占萬分之幾到千分之幾按系統分類排名前5位：神經系統：智力低下、代謝障礙、癲癇心血管系統：先心病內分泌系統：糖尿病、腎上腺皮質增生生殖系統：不孕不育骨骼系統：多指/趾-并指/趾、軟骨發育不良2022/11/15發病頻率——總計占我國出生人口5.6%；為全球平均5～7倍每2022/11/1先天性疾病的誘發因素遺傳原因后天環境所致，因素：物理：X-ray、微波、超聲波、熱化學：砷、鉛、汞（水俁?。┑葻o機物；橙劑、EB（溴乙啶）等有機物生物（感染）：TORCH、EB、HIV、肝炎病毒等圍產期因素誘變，但不肯定致病圍產期因素只侵犯到個別器官，但注意與嵌合遺傳（mosaic）區分62022/10/23先天性疾病的誘發因素遺傳原因62022/11/1如何檢出？高危人群環境暴露既往病史家族史感染史遷居情況……遺傳DNA/RNA

環境無論外來病原體還是本身異常，遺傳物質的檢測都是有效手段72022/10/23如何檢出？高危人群遺傳2022/11/1實驗室檢測手段,分辨率,

和范圍染色體核型Karyotyping:109bp,2800倍鏡下可見熒光原位雜交FISH:107bp,一個基因的一部分多重探針連接擴增MLPA:105bp,幾十個基因比較基因組雜交CGHArray:105bp,幾個基因間接基因診斷:103~105bp,一個或數個基因直接基因診斷PCR-Sequencing:1bp,一個基因Affymatricchip:1bp,數千個基因,半個基因組Genome-Wide-Sequencing:1bp,全部2.4萬個基因注：bp,basepair,堿基對82022/10/23實驗室檢測手段,分辨率,和范圍染色體2022/11/1從核型;FISH;arrayCGH;MLPA;

到CMA(chromosomalmicroarrayanalysis,染色體微陣列,分子核型)——細胞遺傳學與分子遺傳學相結合的方法臨床細胞遺傳學的歷史是伴隨著一系列識別染色體方法的技術進步發展臨床細胞遺傳學基本工作：核型分析國內主要中期染色體核型，G顯帶在400條國外高分辨染色體核型，G顯帶在1500條條件：細胞培養，光鏡，核型分析系統軟件92022/10/23從核型;FISH;arrayCGH2022/11/11、染色體核型Karyotyping

——基于顯微鏡下濃聚的染色體形態檢查方法：

G帶、R帶、Q帶（550條，7組）高分辨染色體分帶（>1500條）

FISH（熒光原位雜交）：分裂間期染色體畸變種類：數目異常（整倍和非整倍）結構異常:-;+;t;del;ins;inv;dup;invdup;fra(X)(q27.3):脆性X;der:衍生染色體;r(13):13號染色體呈環狀（暗示有缺失）;i(Xq):等臂Xq102022/10/231、染色體核型Karyotyping

2022/11/12、熒光原位雜交技術FISH(fluorescenceinsituhybridization,)可以結合，但不依賴于核型分析單色與多色FISH，如SKY-FISH(光譜式多色染色體)是鑒別基因組發生較大缺失或重復金標準不足：一次雜交識別的范圍有限——需要很好的臨床診斷或其他提示，花費大人力多，設備高級方法：探針標記，細胞或染色體的原位雜交條件：探針(cosmid)、DNA提取、PCR、真空干燥、圖像采集與分析112022/10/232、熒光原位雜交技術FISH(fluo2022/11/1FISH需要條件——熒光顯微鏡+圖像分析系統122022/10/23FISH需要條件——熒光顯微鏡+圖像分析2022/11/13、多重探針連接擴增MLPA(multiplexligation-dependentprobeamplification)

SchoutenJP第一次描述一種基于PCR反應，通過毛細管電泳鑒定擴增產物是一種高分辨的，用于檢測基因組序列拷貝數變異的方法(NucleicAcidsRes.2002Jun15;30(12):e57)

132022/10/233、多重探針連接擴增MLPA(mu2022/11/1

同時檢測40個基因組序列異常，幾乎每個染色體2個近端粒常有微缺失涉及不育、發育、智力，可一次查全僅需要20ng的DNA

能檢測單個外顯子exon的拷貝數,

探針辨認短的基因組序列,部分變性的DNA,如石蠟包埋,甲醛固定的樣本均可使用相對定量40個mRNA,鑒定啟動子的甲基化狀態,檢測已知的突變和SNPS

MLPA方法功能、特點

142022/10/23同時檢測40個基因組序列異常，幾乎每個2022/11/1MLPA反應過程152022/10/23M152022/11/1MLPA結果判定相對峰域與對照相比減少35-50%判定缺失相對峰域與對照相比增加35-50%判定重復突變/多態性位于探針的連接點或與探針的連接點很近也可能導致相對峰域減少單一的外顯子缺失需要其他方法證實結果分析2例162022/10/23MLPA結果判定相對峰域與對照相比減少32022/11/1172022/10/23172022/11/1182022/10/23182022/11/1MLPA

需要條件PCR儀測序儀192022/10/23MLPA

需要條件PCR儀192022/11/14、比較基因組雜交

(Comparativegenomichybridization,CGH)什么是CGH:1992年Kallioniemi創立的基于熒光標記和分子、細胞遺傳學技術鑒定基因組DNA的獲得、丟失和擴增，并且可以把這些遺傳變異定位在正常的中期染色體上的一種技術特點:在一個實驗中，用一張中期染色體涂片分析全基因組的大的DNA序列拷貝數的不平衡改變(獲得和丟失)，即因劑量的變化而不需要分裂的細胞缺點:與測序相比分辨率不高，擴增子約2Mb，檢出的缺失大小5～10Mb——但也是個優點：容易辨識和解釋

1997年Solinas-Toldo建立Microarrary/array-CGH目前最通用的是美國安捷倫公司(Agilent)的平臺，已成為國際上遺傳病診斷、流產組織分析和種植前診斷PGD的第一線手段(first-line)202022/10/234、比較基因組雜交(Comparati2022/11/1MicroarrayBACs/PACsDNA探針固定在玻璃片上ArrayedbyroboticallyprintingDNAontoslidesAgilentscannerOldarray-CGH212022/10/23MicroarrayOldarray-2022/11/1Patient2ThispatientpresentedtotheLaboratoryat12monthsofagewithinfantilespasmsanddevelopmentaldelay.Hisheadcircumferencewasbelowthe2ndcentileandweightwasbetweenthe10to25thcentile.Seizurescontinueddaily.Atareviewat32monthsbrachycephaly,lowanteriorhairline,hypertelorism,andalargeprotrudingtongueweresomeoftheadditionalfeaturesobserved.SubtelomericFISHrevealedadeletionofthedistal9qprobePAC112N13.Array-CGHshowedthepatienthasa1.5-1.8Mbdeletionofdistal9q.FurtherFISHevaluationestablishedthedeletionas1.7MbwithbreakpointsbetweentheBACclonesRP11-83N9andRP11-695L17.222022/10/23Patient2222022/11/111qduplication

10qdeletionPatient5Malepatientwhopresentedat18yearsofagewithintellectualdisability,autismanddysmorphicfeatures.SubtelomereFISHshowedaunbalancedtranslocation,withanadditionalcopyofthe11qprobePAC770G7presentondistal10q.Thedistal10qprobePAC137E24Gwasnotpresent.232022/10/2311qduplication10q2022/11/1Newarray-CGH?用不同的顏色熒光標記等量病人的測試和參照DNA加入HumanCot1DNA在Microarray上進行雜交

雜交后洗去未結合的和錯配的靶DNA高分辨掃描儀芯片242022/10/23Newarray-CGH?用不同的顏色2022/11/1雙色激光掃描紅色CY5綠色CY3F值產生

referenceDNApatient=252022/10/23雙色激光掃描reference=25真實掃描芯片圖(8X60K芯片)分析軟件界面2022/11/126真實掃描芯片圖(8X60K芯片)分析軟件界面2022/10Cytoreport:給出23條染色體圖和分析表格（列出部分）2022/11/127Cytoreport:給出23條染色體圖和分析表格（列2022/11/1什么是基因診斷？狹義：針對致病基因的突變分析——是一種直接的診斷擴展：利用致病基因的多態性(polymorphism)；或利用相鄰的多態性標記(polymorphicmarkers)進行連鎖分析——是一種間接的診斷廣義：通過對疾病發生的基礎，包括復制(DNA)、表達(RNA)和翻譯(蛋白質)加以全過程分析所做出的診斷282022/10/23什么是基因診斷？狹義：針對致病基因的突變2022/11/1基因診斷技術基礎:PCR聚合酶鏈反應

(polymerasechainreaction,PCR):1985年發明,1992諾貝爾獎試管在熱循環儀(PCR儀)中反應幾小時，待測基因片段，專一地擴增上百萬倍PCR過程：加熱變性：分開模DNA雙鏈冷卻復性：使引物與目標序列特異結合保溫延長：使引物按模板序列延長292022/10/23基因診斷技術基礎:PCR聚合酶鏈反應(2022/11/1PCR產物檢測PCR反應場所以及302022/10/23PCR產物檢測PCR反應場所2022/11/1不適合做PCR診斷的病種染色體病大片段基因缺失和重排所致的遺傳?。?/p>

解決辦法：細胞遺傳學，熒光原位雜交FISH、多重探針連接擴增MLPA、比較基因組雜交CGH、基因芯片Affymatricarray和大規模全基因組測序……基因巨大(Megabases)且無熱點突變的遺傳?。篘F1、DMD、BMD、ADPKDetc.

解決辦法：雜交、酶學、代謝產物、功能分析，截短蛋白分析法(ProteinTruncationTest,PTT)、色譜、串聯質譜……312022/10/23不適合做PCR診斷的病種染色體病312022/11/1哪些遺傳病可以做基因診斷?

——需要查閱OMIM遺傳病數據庫()322022/10/23哪些遺傳病可以做基因診斷?

——需2022/11/1哪些遺傳病可以做基因診斷?

——基因診斷適用范圍和必要性有器官組織差異性而不適合做組織活檢的遺傳病：longQT等心臟病、糖原累積癥I型(vonGierke型)、癲癇等腦病……診斷后可以治療或提前預防發病的遺傳?。喝鏟KU、肝豆狀核變性和G6PD缺乏癥……可以進行產前基因診斷的嚴重的先天代謝病，嚴重的精神疾患或惡性早期致死性疾病：如性別畸形和性發育異常而找不到染色體異常?？赏ㄟ^選擇性流產加以預防傳統方法不能診斷、診斷不確切的家族性疾?。憾嘁猿ｏ@、X連鎖和母系方式遺傳?？勺鲞B鎖分析332022/10/23哪些遺傳病可以做基因診斷?

——基因診2022/11/1例如:家族性氨基甙類藥物耳聾對氨基甙類如卡那霉素、丁胺卡那、慶大霉素、新霉素以及鏈霉素等超級敏感條件致病——使用氨基甙類藥物母系遺傳——線粒體DNA上編碼12SrRNA的基因存在致病突變A1555G一旦發現，可對全家進行該突變的篩查發布用藥禁忌342022/10/23例如:家族性氨基甙類藥物耳聾對氨基甙類如2022/11/1Ⅲ-1(先證者)Ⅲ-2Ⅲ-3Ⅲ-4

A>G:＋

＋

－

＋

－＋

＋

＋

＋＋線粒體mtDNA1555A>G基因診斷(＋：有突變)II-1Ⅱ-2Ⅱ-3Ⅱ-4氨基甙類耳毒家系的基因診斷示意圖I-1I-2352022/10/23Ⅲ-1(先證者2022/11/1例2線粒體病的基因診斷mitochondrion線粒體是細胞的能量工廠…362022/10/23例2線粒體病的基因診斷mitochon2022/11/1Leigh病-亞急性壞死性腦脊髓病嚴重性：在我院兒科臨床診斷的35例中，死亡29例（83%）。目前生存僅僅6例。Leigh病是一種線粒體病，但僅僅有20%由mtDNA突變突變所致，80%由核基因突變所導致?；驒z查：mtDNA突變檢出率極低——229臨床診斷病例中僅僅檢出3例：T8993C2例和T8993G1例（死后尸解結果mtDNAMut%：血=85%;肌肉=94%;腦=98%；其母外周血=10%）372022/10/23Leigh病-亞急性壞死性腦脊髓病嚴重2022/11/1病例1、臨床表現男，4月，主因精神發育倒退、驚厥入院第一胎，孕9月疑潛在性缺氧行剖宮產，生后無窒息；2月內發育如常，后出現倒退，表現為頸部發軟、四肢活動差、吸吮能力減弱、低熱、陣發性呼吸暫停（2~8次/日）檢查：間斷抽搐，四肢肌力、肌張力低下，病理征(-)。血乳酸高、代謝性酸中毒。EEG示左側為主的多灶尖波、棘波、多棘波和棘慢波。MRI示缺血改變：雙側殼核、丘腦區異常信號；腦白質發育落后。兩次眼底檢查未見異常呼吸節律不整，死前突然出現嘆氣樣呼吸…父31歲、母30歲，均無遺傳病家族史382022/10/23病例1、臨床表現男，4月，主因精神發育倒2022/11/1392022/10/23392022/11/1402022/10/23402022/11/1方法PCR擴增mtDNA8791-9413片段(622bp)分別用限制性內切酶MspI和SmaI酶解PCR產物2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離酶解片段對EB染色的片段進行密度掃描，突變比例（Mut%）=突變新增片段密度/原有片段殘留密度+突變新增片段密度結果患兒體內存在高比例的8993T>G突變患兒1親屬中母親含較低比例的同樣突變患兒1肌和腦組織病理檢查符合嬰兒型Leigh綜合征診斷患兒1MRI示腦缺氧性改變M

患兒肌肉患兒血母親陰性對412022/10/23方法結果M患兒肌肉患兒血母親2022/11/1患者L1以第1對引物擴增后PCR產物直接測序結果T8993GT8993C患者L2以第1對引物擴增后PCR產物直接測序結果422022/10/23患者L1以第1對引物擴增后PCR產物直接2022/11/1患者CT和死后尸解432022/10/23患者CT和432022/11/1病理改變：灰質為主的海綿樣改變，神經細胞壞死和毛細血管增生。陳舊病變出現膠質細胞增生，新鮮病變存在格子細胞。腦干黑質、舌下神經核、面神經核和前庭神經核在不同病人均受累。其他部位病變可以僅限于腦干，也可以同時累及脊髓灰質、基底節、大腦和小腦皮層以及白質。442022/10/23病理改變：灰質為主的海綿樣改變，神經細胞2022/11/1“間接法”基因診斷——連鎖分析

例：苯酮尿癥(PKU)的診斷致病基因：苯丙氨酸羥化酶PAH方法：細菌抑制實驗(篩查)

苯丙酮酸和PAH定量基因診斷困難

70多種突變基因大，突變很分散檢測突變成本高，周期長直接檢測突變或連鎖分析?452022/10/23“間接法”基因診斷——連鎖分析

2022/11/1連鎖分析方法產前診斷PKU

——選擇幾對染色體標記(marker)

←A

←B

連鎖分析示意圖需要多態性標記（與PAH基因在染色體上的距離越近越好）對先證者(BB)及家系成員(父-AB;母-BC;胎兒-AC)的標記進行分型(genotyping)胎兒-AC：不受累！連鎖診斷準確度：marker與致病基因的連鎖程度——有1%的交換率，理論可信度為99%←C

462022/10/23連鎖分析方法產前診斷PKU

——選擇幾對2022/11/1產前基因診斷對象：胎兒的DNA、代謝產物或酶蛋白取材：絨毛(8周)、羊水(16周)、胎兒靜脈血手段：針對代謝產物：HPLC、GC-MS(有組織特異性)

酶活性：特異性人工底物顯色(有組織特異性)

針對基因：RFLP、PCR等(無組織特異性)要求：雙取樣、雙方法、有資質、有質控準入：目前北京7家，專家委員會審核和年審管理:《北京市產前診斷與產前篩查工作規范》《產前診斷技術管理辦法》472022/10/23產前基因診斷對象：胎兒的DNA、代謝產物體細胞嵌合的遺傳?。ㄉ臣毎逗袭惓１壤^低也不行）組織器官異質性過大（線粒體病）國家法律和行業規定不允許的范圍，如“天才基因”兒的選擇（遺傳不平衡）性別鑒定（除非性連鎖疾?。┏蕯盗窟z傳的多基因病或遺傳相關的復雜遺傳病以及沒有做好準備的家庭……2022/11/1哪些病不適合產前基因診斷48體細胞嵌合的遺傳病（生殖細胞嵌合異常比例過低也不行）2022

非侵入性產前檢查NIPT——血漿游離DNA突變檢測技術

TTTTCTTTTCc.2383C>Tc.2383C>Tc.4005delGc.4005delGG2671**2022/11/149非侵入性產前檢查NIPTTTTTCTTTTCc.2383母體血漿中的胚胎DNALoYMetal.Fetalcf-DNAdetectedviaYchromosome,Lancet1997胎兒游離DNA：cell-freefetalDNA(cffDNA)母體外周血含有cffDNA，幾乎全部來源于胎盤滋養細胞。懷孕4周可檢出，8周后含量上升并穩定存在。（7周建立胎兒胎盤循環）。cffDNA片段比較小，長度在75bp和250bp之間。母體外周血中的cffDNA含量在5%到30%之間。孕周越大外周血中胚胎DNA的含量越高。與母親體重有關。產后2hr之內消失。2022/11/150母體血漿中的胚胎DNALoYMetal.Fetal22條常染色體23條常染色體20%胚胎

DNA380%2胎兒80%母親染色體非整倍體導致劑量變化2022/11/15122條常染色體23條常染色體20%胚胎DNA380%2胎技術和科學的目標

thatgovernmentofthepeople,bythepeople,forthepeople,shallnotperishfromtheearth.————byAbrahamLincoln2022/11/152技術和科學的目標thatgovernmentofth基因診斷的制高點——多基因?。?/p>

能否靠基因芯片或微陣列解決？Randomarrayofclusters100um2022/11/153基因診斷的制高點——多基因?。?/p>

能否靠基因芯片或微2022/11/1劃時代的新技術——大規模二代測序NGS(NextGenerationSequencing)

人類基因組計劃長達10年、耗資千億、6國數萬科學家投入，僅完成4個人的基因

2007年：1人，3天內，3000美元，費用和時間在以每年遞減一半的速度下降——取代所有一切，40種常見病發表。。。多基因病時代來了？SOLEXA_illumina1GGenomeAnalyzer542022/10/23劃時代的新技術——大規模二代測序NGS(2022/11/1InstrumentwithoutCoversFluidics&electronicsFlowcell&detectionLaseroptics552022/10/23InstrumentwithoutC2022/11/1FlowcellinImagingLocation562022/10/23FlowcellinImaging2022/11/1基因診斷和產前基因診斷中的知情同意和倫理學問題實驗室有認證、國家標準和質量控制實驗人員有許可證有標準實驗流程MOPS、質控/質評簽發臨檢報告要慎重、留余地可靠性和及時性兼備572022/10/23基因診斷和產前基因診斷中的知情同意和倫理樣品的采集與保存對象

保存環境

保存期限白細胞/皮膚細胞*低溫≤?20C°1年EBV轉化淋巴細胞系*凍存液氮無限組織冰凍?80C°3年毛發(帶毛囊)低溫≤?20C°1年口腔脫落細胞低溫≤?20C°1年DNA高鹽冷藏4C°10年RNA全血(抗凍劑)低溫?20/?80C°1年/3年蛋白粗提物低溫≤?70C°半年*白細胞可經EBV轉化建立永生細胞株，皮膚成纖維細胞可培養永久保存無限擴增2022/11/158樣品的采集與保存對象還有很重要的，樣本庫2022/11/1完整有用的樣本一定要有專業的數據庫：臨床和背景資料齊全有編號、易檢索（條形碼管理）納入合適的樣本庫保存條件合格無降解無污染數據庫要素：病人一般資料臨床特點家族資料樣品管理家系調查網絡組59還有很重要的，樣本庫2022/10/23完整有用的樣本一定要構成小型樣本庫的硬件和軟件每臺立式冰箱：16～20個耐酸鋁架;20個蠟紙or塑料盒/架;9×9凍存管/盒=25920～32400管標本(3.5ml)條形碼打印機耐低溫標簽掃碼槍2022/11/160構成小型樣本庫的硬件和軟件每臺立式冰箱：16～20個耐酸鋁架大型標本庫的構成與核心區域規劃：緩沖區核心：庫區監控室樣本接收區樣本處理區輔助功能區：用品庫、辦公室、更衣室2022/11/161大型標本庫的構成與核心區域規劃：2022/10/236162是多功能的大型實驗室：研究教學臨床基因診斷標本庫實驗中心大樓位于北大醫院門診南側,7層,面積7000m2CentrallaboratoryResearchTeachingClinicalgeneticdiagnosisBioBank簡介：北京大學第一醫院實驗中心（中心實驗室）2022/11/162是多功能的大型實驗室：簡介：北京大學第一醫院實驗中心2063臨床基因擴增診斷實驗室

StandardPCRLaboratory300m2,strictlymanagedinCAPwayNegative

pressuredoublesystems100,000levelcleanLabStrict

functions

and

workflowtoavoidPCRcontamination:ReagentStore&Prepare→DNAsampling→PCR→PCRproductanalysis→Sequencing→DatamanagingWayInWayOut2022/11/163臨床基因擴增診斷實驗室

StandardPCRLab64臨床基因擴增診斷實驗室

LicencesPCRLaboratory:No.1inBeijingforInheriteddiseasePrenataldiagnosis642022/11/164臨床基因擴增診斷實驗室LicencesPCRLabo65臨床基因擴增診斷實驗室Management

Rules

and

regulationsSOPSamplemanagement:barcodeAdvancedequipment2022/11/165臨床基因擴增診斷實驗室ManagementRules

66臨床基因擴增診斷實驗室

LaboratoryfacultiesResearcher:5perDoctor:2Technician:7Ph.D.:2M.D.:2Master’s:4Bachelor’s:4Others:2AllPCRandprenatalcertificates2022/11/166臨床基因擴增診斷實驗室

Laboratoryfacul產前診斷項目(30%檢出異常)NIPTforDown’s脊肌萎縮征(SMA)杜氏肌營養不良(DMD)肝豆狀核變性(Wilson’s)苯丙酮尿癥(PKU)四氫生物蝶呤缺乏癥(PTPS)Rett綜合征結節性硬化(TSC)常染色體顯性遺傳多囊腎(ADPKD)遺傳性多發梗死癡呆病(CADACIL)X-腎上腺腦白質營養不良(X-ALD)異染性腦白質營養不良(MLD)視網膜母細胞瘤、腎胚瘤(RB)葉酸利用能力(MTHFR)軟骨發育不全(X線和B超提示)耳聾相關基因(芯片法)甲狀腺素抵抗綜合征唇腭裂相關基因(DiGeorge等)流產、畸形等全基因組劑量分析(byarrayCGH智力低下和發育落后(byMLPA)21種微缺失綜合征……線粒體病、視神經病、抗生素所致耳聾8位點檢測，均是國內檢測最全最徹底的672022/11/167產前診斷項目(30%檢出異常)NIPTforDown’s我們對遺傳病的了解以及基因診斷的臨床應用是“冰山一角”還是“盲人摸象”？謝謝！不孕癥病因2022/11/168我們對遺傳病的了解以及基因診斷的臨床應用謝謝！不孕癥病因20遺傳病的實驗室檢查手段進展北大醫院實驗中心戚豫研究員2022/11/169遺傳病的實驗室檢查手段進展北大醫院實驗中心2022/10/22007,Illumina推出Solexa;ABI推出SOLid…均能在3天內完成1人的全基因組測序2022/11/1702007,Illumina推出Solexa;ABI推出SO2022/11/1遺傳病和基因的數量？遺傳病總數：14,861種(Online-MendelianInheritanceinMan,OMIM,by2015-3-21)人類基因總數：≥24,000個人類各種結構和功能蛋白：100,000種89種表型和基因全清楚；4,381種表現找到致病突變——意味著可做直接的基因診斷的病種很少！已知序列：10,391個基因——可做間接診斷的很多！712022/10/23遺傳病和基因的數量？遺傳病總數：14,8“遺傳病”概念廣義：所有疾病。因為一切人體正常生理功能和病理狀態都是由基因決定的狹義：因基因突變而引發的疾病如何區分三個概念：

遺傳性疾?。号c環境因素引起的疾病對立

先天性疾?。嚎梢允菄a期感染/藥物所致

家族性疾病：可能隨著成員的遷出而終止2022/11/172“遺傳病”概念廣義：所有疾病。因為一切人體正常生理功能和病發病頻率——總計占我國出生人口5.6%；為全球平均5～7倍每一項只占萬分之幾到千分之幾按系統分類排名前5位：神經系統：智力低下、代謝障礙、癲癇心血管系統：先心病內分泌系統：糖尿病、腎上腺皮質增生生殖系統：不孕不育骨骼系統：多指/趾-并指/趾、軟骨發育不良2022/11/173發病頻率——總計占我國出生人口5.6%；為全球平均5～7倍每2022/11/1先天性疾病的誘發因素遺傳原因后天環境所致，因素：物理：X-ray、微波、超聲波、熱化學：砷、鉛、汞（水俁?。┑葻o機物；橙劑、EB（溴乙啶）等有機物生物（感染）：TORCH、EB、HIV、肝炎病毒等圍產期因素誘變，但不肯定致病圍產期因素只侵犯到個別器官，但注意與嵌合遺傳（mosaic）區分742022/10/23先天性疾病的誘發因素遺傳原因62022/11/1如何檢出？高危人群環境暴露既往病史家族史感染史遷居情況……遺傳DNA/RNA

環境無論外來病原體還是本身異常，遺傳物質的檢測都是有效手段752022/10/23如何檢出？高危人群遺傳2022/11/1實驗室檢測手段,分辨率,

和范圍染色體核型Karyotyping:109bp,2800倍鏡下可見熒光原位雜交FISH:107bp,一個基因的一部分多重探針連接擴增MLPA:105bp,幾十個基因比較基因組雜交CGHArray:105bp,幾個基因間接基因診斷:103~105bp,一個或數個基因直接基因診斷PCR-Sequencing:1bp,一個基因Affymatricchip:1bp,數千個基因,半個基因組Genome-Wide-Sequencing:1bp,全部2.4萬個基因注：bp,basepair,堿基對762022/10/23實驗室檢測手段,分辨率,和范圍染色體2022/11/1從核型;FISH;arrayCGH;MLPA;

到CMA(chromosomalmicroarrayanalysis,染色體微陣列,分子核型)——細胞遺傳學與分子遺傳學相結合的方法臨床細胞遺傳學的歷史是伴隨著一系列識別染色體方法的技術進步發展臨床細胞遺傳學基本工作：核型分析國內主要中期染色體核型，G顯帶在400條國外高分辨染色體核型，G顯帶在1500條條件：細胞培養，光鏡，核型分析系統軟件772022/10/23從核型;FISH;arrayCGH2022/11/11、染色體核型Karyotyping

——基于顯微鏡下濃聚的染色體形態檢查方法：

G帶、R帶、Q帶（550條，7組）高分辨染色體分帶（>1500條）

FISH（熒光原位雜交）：分裂間期染色體畸變種類：數目異常（整倍和非整倍）結構異常:-;+;t;del;ins;inv;dup;invdup;fra(X)(q27.3):脆性X;der:衍生染色體;r(13):13號染色體呈環狀（暗示有缺失）;i(Xq):等臂Xq782022/10/231、染色體核型Karyotyping

2022/11/12、熒光原位雜交技術FISH(fluorescenceinsituhybridization,)可以結合，但不依賴于核型分析單色與多色FISH，如SKY-FISH(光譜式多色染色體)是鑒別基因組發生較大缺失或重復金標準不足：一次雜交識別的范圍有限——需要很好的臨床診斷或其他提示，花費大人力多，設備高級方法：探針標記，細胞或染色體的原位雜交條件：探針(cosmid)、DNA提取、PCR、真空干燥、圖像采集與分析792022/10/232、熒光原位雜交技術FISH(fluo2022/11/1FISH需要條件——熒光顯微鏡+圖像分析系統802022/10/23FISH需要條件——熒光顯微鏡+圖像分析2022/11/13、多重探針連接擴增MLPA(multiplexligation-dependentprobeamplification)

SchoutenJP第一次描述一種基于PCR反應，通過毛細管電泳鑒定擴增產物是一種高分辨的，用于檢測基因組序列拷貝數變異的方法(NucleicAcidsRes.2002Jun15;30(12):e57)

812022/10/233、多重探針連接擴增MLPA(mu2022/11/1

同時檢測40個基因組序列異常，幾乎每個染色體2個近端粒常有微缺失涉及不育、發育、智力，可一次查全僅需要20ng的DNA

能檢測單個外顯子exon的拷貝數,

探針辨認短的基因組序列,部分變性的DNA,如石蠟包埋,甲醛固定的樣本均可使用相對定量40個mRNA,鑒定啟動子的甲基化狀態,檢測已知的突變和SNPS

MLPA方法功能、特點

822022/10/23同時檢測40個基因組序列異常，幾乎每個2022/11/1MLPA反應過程832022/10/23M152022/11/1MLPA結果判定相對峰域與對照相比減少35-50%判定缺失相對峰域與對照相比增加35-50%判定重復突變/多態性位于探針的連接點或與探針的連接點很近也可能導致相對峰域減少單一的外顯子缺失需要其他方法證實結果分析2例842022/10/23MLPA結果判定相對峰域與對照相比減少32022/11/1852022/10/23172022/11/1862022/10/23182022/11/1MLPA

需要條件PCR儀測序儀872022/10/23MLPA

需要條件PCR儀192022/11/14、比較基因組雜交

(Comparativegenomichybridization,CGH)什么是CGH:1992年Kallioniemi創立的基于熒光標記和分子、細胞遺傳學技術鑒定基因組DNA的獲得、丟失和擴增，并且可以把這些遺傳變異定位在正常的中期染色體上的一種技術特點:在一個實驗中，用一張中期染色體涂片分析全基因組的大的DNA序列拷貝數的不平衡改變(獲得和丟失)，即因劑量的變化而不需要分裂的細胞缺點:與測序相比分辨率不高，擴增子約2Mb，檢出的缺失大小5～10Mb——但也是個優點：容易辨識和解釋

1997年Solinas-Toldo建立Microarrary/array-CGH目前最通用的是美國安捷倫公司(Agilent)的平臺，已成為國際上遺傳病診斷、流產組織分析和種植前診斷PGD的第一線手段(first-line)882022/10/234、比較基因組雜交(Comparati2022/11/1MicroarrayBACs/PACsDNA探針固定在玻璃片上ArrayedbyroboticallyprintingDNAontoslidesAgilentscannerOldarray-CGH892022/10/23MicroarrayOldarray-2022/11/1Patient2ThispatientpresentedtotheLaboratoryat12monthsofagewithinfantilespasmsanddevelopmentaldelay.Hisheadcircumferencewasbelowthe2ndcentileandweightwasbetweenthe10to25thcentile.Seizurescontinueddaily.Atareviewat32monthsbrachycephaly,lowanteriorhairline,hypertelorism,andalargeprotrudingtongueweresomeoftheadditionalfeaturesobserved.SubtelomericFISHrevealedadeletionofthedistal9qprobePAC112N13.Array-CGHshowedthepatienthasa1.5-1.8Mbdeletionofdistal9q.FurtherFISHevaluationestablishedthedeletionas1.7MbwithbreakpointsbetweentheBACclonesRP11-83N9andRP11-695L17.902022/10/23Patient2222022/11/111qduplication

10qdeletionPatient5Malepatientwhopresentedat18yearsofagewithintellectualdisability,autismanddysmorphicfeatures.SubtelomereFISHshowedaunbalancedtranslocation,withanadditionalcopyofthe11qprobePAC770G7presentondistal10q.Thedistal10qprobePAC137E24Gwasnotpresent.912022/10/2311qduplication10q2022/11/1Newarray-CGH?用不同的顏色熒光標記等量病人的測試和參照DNA加入HumanCot1DNA在Microarray上進行雜交

雜交后洗去未結合的和錯配的靶DNA高分辨掃描儀芯片922022/10/23Newarray-CGH?用不同的顏色2022/11/1雙色激光掃描紅色CY5綠色CY3F值產生

referenceDNApatient=932022/10/23雙色激光掃描reference=25真實掃描芯片圖(8X60K芯片)分析軟件界面2022/11/194真實掃描芯片圖(8X60K芯片)分析軟件界面2022/10Cytoreport:給出23條染色體圖和分析表格（列出部分）2022/11/195Cytoreport:給出23條染色體圖和分析表格（列2022/11/1什么是基因診斷？狹義：針對致病基因的突變分析——是一種直接的診斷擴展：利用致病基因的多態性(polymorphism)；或利用相鄰的多態性標記(polymorphicmarkers)進行連鎖分析——是一種間接的診斷廣義：通過對疾病發生的基礎，包括復制(DNA)、表達(RNA)和翻譯(蛋白質)加以全過程分析所做出的診斷962022/10/23什么是基因診斷？狹義：針對致病基因的突變2022/11/1基因診斷技術基礎:PCR聚合酶鏈反應

(polymerasechainreaction,PCR):1985年發明,1992諾貝爾獎試管在熱循環儀(PCR儀)中反應幾小時，待測基因片段，專一地擴增上百萬倍PCR過程：加熱變性：分開模DNA雙鏈冷卻復性：使引物與目標序列特異結合保溫延長：使引物按模板序列延長972022/10/23基因診斷技術基礎:PCR聚合酶鏈反應(2022/11/1PCR產物檢測PCR反應場所以及982022/10/23PCR產物檢測PCR反應場所2022/11/1不適合做PCR診斷的病種染色體病大片段基因缺失和重排所致的遺傳?。?/p>

解決辦法：細胞遺傳學，熒光原位雜交FISH、多重探針連接擴增MLPA、比較基因組雜交CGH、基因芯片Affymatricarray和大規模全基因組測序……基因巨大(Megabases)且無熱點突變的遺傳病：NF1、DMD、BMD、ADPKDetc.

解決辦法：雜交、酶學、代謝產物、功能分析，截短蛋白分析法(ProteinTruncationTest,PTT)、色譜、串聯質譜……992022/10/23不適合做PCR診斷的病種染色體病312022/11/1哪些遺傳病可以做基因診斷?

——需要查閱OMIM遺傳病數據庫()1002022/10/23哪些遺傳病可以做基因診斷?

——需2022/11/1哪些遺傳病可以做基因診斷?

——基因診斷適用范圍和必要性有器官組織差異性而不適合做組織活檢的遺傳?。簂ongQT等心臟病、糖原累積癥I型(vonGierke型)、癲癇等腦病……診斷后可以治療或提前預防發病的遺傳?。喝鏟KU、肝豆狀核變性和G6PD缺乏癥……可以進行產前基因診斷的嚴重的先天代謝病，嚴重的精神疾患或惡性早期致死性疾?。喝缧詣e畸形和性發育異常而找不到染色體異常?？赏ㄟ^選擇性流產加以預防傳統方法不能診斷、診斷不確切的家族性疾病：多以常顯、X連鎖和母系方式遺傳?？勺鲞B鎖分析1012022/10/23哪些遺傳病可以做基因診斷?

——基因診2022/11/1例如:家族性氨基甙類藥物耳聾對氨基甙類如卡那霉素、丁胺卡那、慶大霉素、新霉素以及鏈霉素等超級敏感條件致病——使用氨基甙類藥物母系遺傳——線粒體DNA上編碼12SrRNA的基因存在致病突變A1555G一旦發現，可對全家進行該突變的篩查發布用藥禁忌1022022/10/23例如:家族性氨基甙類藥物耳聾對氨基甙類如2022/11/1Ⅲ-1(先證者)Ⅲ-2Ⅲ-3Ⅲ-4

A>G:＋

＋

－

＋

－＋

＋

＋

＋＋線粒體mtDNA1555A>G基因診斷(＋：有突變)II-1Ⅱ-2Ⅱ-3Ⅱ-4氨基甙類耳毒家系的基因診斷示意圖I-1I-21032022/10/23Ⅲ-1(先證者2022/11/1例2線粒體病的基因診斷mitochondrion線粒體是細胞的能量工廠…1042022/10/23例2線粒體病的基因診斷mitochon2022/11/1Leigh病-亞急性壞死性腦脊髓病嚴重性：在我院兒科臨床診斷的35例中，死亡29例（83%）。目前生存僅僅6例。Leigh病是一種線粒體病，但僅僅有20%由mtDNA突變突變所致，80%由核基因突變所導致?；驒z查：mtDNA突變檢出率極低——229臨床診斷病例中僅僅檢出3例：T8993C2例和T8993G1例（死后尸解結果mtDNAMut%：血=85%;肌肉=94%;腦=98%；其母外周血=10%）1052022/10/23Leigh病-亞急性壞死性腦脊髓病嚴重2022/11/1病例1、臨床表現男，4月，主因精神發育倒退、驚厥入院第一胎，孕9月疑潛在性缺氧行剖宮產，生后無窒息；2月內發育如常，后出現倒退，表現為頸部發軟、四肢活動差、吸吮能力減弱、低熱、陣發性呼吸暫停（2~8次/日）檢查：間斷抽搐，四肢肌力、肌張力低下，病理征(-)。血乳酸高、代謝性酸中毒。EEG示左側為主的多灶尖波、棘波、多棘波和棘慢波。MRI示缺血改變：雙側殼核、丘腦區異常信號；腦白質發育落后。兩次眼底檢查未見異常呼吸節律不整，死前突然出現嘆氣樣呼吸…父31歲、母30歲，均無遺傳病家族史1062022/10/23病例1、臨床表現男，4月，主因精神發育倒2022/11/11072022/10/23392022/11/11082022/10/23402022/11/1方法PCR擴增mtDNA8791-9413片段(622bp)分別用限制性內切酶MspI和SmaI酶解PCR產物2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離酶解片段對EB染色的片段進行密度掃描，突變比例（Mut%）=突變新增片段密度/原有片段殘留密度+突變新增片段密度結果患兒體內存在高比例的8993T>G突變患兒1親屬中母親含較低比例的同樣突變患兒1肌和腦組織病理檢查符合嬰兒型Leigh綜合征診斷患兒1MRI示腦缺氧性改變M

患兒肌肉患兒血母親陰性對1092022/10/23方法結果M患兒肌肉患兒血母親2022/11/1患者L1以第1對引物擴增后PCR產物直接測序結果T8993GT8993C患者L2以第1對引物擴增后PCR產物直接測序結果1102022/10/23患者L1以第1對引物擴增后PCR產物直接2022/11/1患者CT和死后尸解1112022/10/23患者CT和432022/11/1病理改變：灰質為主的海綿樣改變，神經細胞壞死和毛細血管增生。陳舊病變出現膠質細胞增生，新鮮病變存在格子細胞。腦干黑質、舌下神經核、面神經核和前庭神經核在不同病人均受累。其他部位病變可以僅限于腦干，也可以同時累及脊髓灰質、基底節、大腦和小腦皮層以及白質。1122022/10/23病理改變：灰質為主的海綿樣改變，神經細胞2022/11/1“間接法”基因診斷——連鎖分析

例：苯酮尿癥(PKU)的診斷致病基因：苯丙氨酸羥化酶PAH方法：細菌抑制實驗(篩查)

苯丙酮酸和PAH定量基因診斷困難

70多種突變基因大，突變很分散檢測突變成本高，周期長直接檢測突變或連鎖分析?1132022/10/23“間接法”基因診斷——連鎖分析

2022/11/1連鎖分析方法產前診斷PKU

——選擇幾對染色體標記(marker)

←A

←B

連鎖分析示意圖需要多態性標記（與PAH基因在染色體上的距離越近越好）對先證者(BB)及家系成員(父-AB;母-BC;胎兒-AC)的標記進行分型(genotyping)胎兒-AC：不受累！連鎖診斷準確度：marker與致病基因的連鎖程度——有1%的交換率，理論可信度為99%←C

1142022/10/23連鎖分析方法產前診斷PKU

——選擇幾對2022/11/1產前基因診斷對象：胎兒的DNA、代謝產物或酶蛋白取材：絨毛(8周)、羊水(16周)、胎兒靜脈血手段：針對代謝產物：HPLC、GC-MS(有組織特異性)

酶活性：特異性人工底物顯色(有組織特異性)

針對基因：RFLP、PCR等(無組織特異性)要求：雙取樣、雙方法、有資質、有質控準入：目前北京7家，專家委員會審核和年審管理:《北京市產前診斷與產前篩查工作規范》《產前診斷技術管理辦法》1152022/10/23產前基因診斷對象：胎兒的DNA、代謝產物體細胞嵌合的遺傳?。ㄉ臣毎逗袭惓１壤^低也不行）組織器官異質性過大（線粒體病）國家法律和行業規定不允許的范圍，如“天才基因”兒的選擇（遺傳不平衡）性別鑒定（除非性連鎖疾?。┏蕯盗窟z傳的多基因病或遺傳相關的復雜遺傳病以及沒有做好準備的家庭……2022/11/1哪些病不適合產前基因診斷116體細胞嵌合的遺傳?。ㄉ臣毎逗袭惓１壤^低也不行）2022

非侵入性產前檢查NIPT——血漿游離DNA突變檢測技術

TTTTCTTTTCc.2383C>Tc.2383C>Tc.4005delGc.4005delGG2671**2022/11/1117非侵入性產前檢查NIPTTTTTCTTTTCc.2383母體血漿中的胚胎DNALoYMetal.Fetalcf-DNAdetectedviaYchromosome,Lancet1997胎兒游離DNA：cell-freefetalDNA(cffDNA)母體外周血含有cffDNA，幾乎全部來源于胎盤滋養細胞。懷孕4周可檢出，8周后含量上升并穩定存在。（7周建立胎兒胎盤循環）。cffDNA片段比較小，長度在75bp和250bp之間。母體外周血中的cffDNA含量在5%到30%之間。孕周越大外周血中胚胎DNA的含量越高。與母親體重有關。產后2hr之內消失。2022/11/1118母體血漿中的胚胎DNALoYMetal.Fetal22條常染色體23條常染色體20%胚胎

DNA380%2胎兒80%母親染色體非整倍體導致劑量變化2022/11/111922條常染色體23條常染色體20%胚胎DNA380%2胎技術和科學的目標

thatgovernmentofthepeople,bythepeople,forthepeople,shallnotperishfromtheearth.————byAbrahamLincoln2022/11/1120技術和科學的目標thatgovernmentofth基因診斷的制高點——多基因病：

能否靠基因芯片或微陣列解決？Randomarrayofclusters100um2022/11/1121基因診斷的制高點——多基因?。?/p>

能否靠基因芯片或微2022/11/1劃時代的新技術——大規模二代測序NGS(NextGenerationSequencing)

人類基因組計劃長達10年、耗資千億、6國數萬科學家投入，僅完成4個人的基因

2007年：1人，3天內，3000美元，費用和時間在以每年遞減一半的速度下降——取代所有一切，40種常見病發表。。。多基因病時代來了？SOLEXA_illumina1GGenomeAnalyzer1222022/10/23劃時代的新技術——大規模二代測序NGS(2022/11/1InstrumentwithoutCoversFluidics&electronicsFlowcell&detectionLaseroptics1232022/10/23InstrumentwithoutC2022/11/