九、微生物與工程（2）克隆及表達宿主的策2、

工程包括哪幾個大的方向？4、工程菌種是怎樣選取的？（選擇略及理由）6、要對

微小的微生物動“手術”需要哪些特殊的工具？這些工具是人造的還是自然就有的？8、很多微生物都只有一個細胞，而動植物有數以億計的細胞，并且細胞各有分工，因此微生物用一個細胞完成很多細胞的功能，在

表達過程中是否會出現

？2014年下半年微生物學授課安排：一、緒論（4）二、純培養和顯微技術（3）三、微生物類群與形態（10）四、微生物的營養（3）五、微生物的代謝（4）六、微生物的生長繁殖及其控制（4）七、

（4）八、微生物遺傳（8）九、微生物與

工程（2）微生物的進化、系統發育與分類鑒定微生物的生態與免疫√工程（genetic

engineering）或重組DNA技術(binant

DNA

technology)對遺傳信息的分子操作和施工：對分離到的或

的

經過改造，

載體中，導入宿主細胞內，使其擴增和表達，從而獲得大量

產物，或者令生物

新的性狀。（P264第一段）二十世紀生物科學具有劃時代意義的巨大事件，推動了生物科學的迅猛發展，并帶動了生物技術產業的興起。（參見P264）微生物在

工程的興起和發展過程中起著不可替代的作用！（參見P267）“微生物與工程”第一節微生物與克隆載體第二節

工程的常用技術和方法第9章微生物與

工程克隆載體的特點與應用PCR技術的原理與方法其他需要自己看書掌握的內容見本思考的題目√（1）獨立的子－能夠進行獨立自主的（5）載體DNA須易于分離和實驗操作克隆載體的特點與應用克隆載體（cloning

vector）作為克隆載體的基本要求（P274第一段）：（參見p274）√（2）具有若干限制酶的單一切割位點，便于外源DNA的√（3）具有可供選擇的遺傳標記－便于對陽性克隆的篩選和鑒定（4）具有一定的安全性－胞內不重組和轉移；胞外不擴散質粒載體√λ噬菌體載體√質粒載體M13噬菌體載體噬菌粒載體真核細胞的克隆載體人工a）低分子量有利于DNA的分離和操作；特點：b）具有較高拷貝數；c）易于導入細胞；d）具有安全性；質粒載體克隆外源DN段的大小一般不超過15Kb（參見P274

~

275）參見p274

圖10-6參見p274

圖10-6EcoO

109

2674Sspl2501AatII

26,1"7

I

NdeI

1

3Nar.I

235Xmnl2294Scal2177pUC192686bpP1aco

r

i

{

)396EcoRISac'IKpnISmalXmaIBamHIXbaIHineIIPstlSphIHindIII447Gsu11784Cfr10I1779

IPpa11766400

4204'40

460AGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCA

TEcoRI

SacI

K

p

n

I B

a

m

H

IXbalSmaIXmalHincUAce

ISaflPstl

SphI

HindI111lacZ'一飛rlleMetThr(Met)?J

All

treated

bacteria

are

spread

on

a

nutrientagar

plate

containing

ampicillin

and-galactosidase

substrate,

and

incubated8

White

colonies

that

appear

must

containforeign

DNA.

Blue

colonies

must

notcontain

foreign

DNAv/3-galactosidase

gene

(/acZ)cillin-(amp芍RestrictionSItePolylinkerForeign

ONARestrictionsites恁binantplasmidBacteriumF

ig

u

r

e

9

.

9

O

n

e

m

e

t

h

o

d

of

selectingbinant

bacteria.W

hy

are

some

c

olon

沁b

lu

e

andotherswhite?具有細菌啟動子功能的嗜鹽古菌DN段的克隆嗜鹽古菌總DNA隨機酶降解片段質粒載體(pKK232-8)篩選氯霉素抗性轉化子穿梭載體（Shuttle

vector）起始區自我

能力pBE2：大腸桿菌－枯草胞桿菌穿梭載體將野生型λ噬菌體DNA進行改造后建成，主要是去掉噬菌體DNA上過多的常用限制酶的酶切位點，及對非必要

區域進行改造。（P275第2大段）特點：1）分子遺傳學背景清楚；2）容量較大（能容納大約23kb的外源DN

段）；3）

效率高。其

宿主細胞的效率幾乎可達100％，

而質粒DNA的轉化率卻只有0.1％。4）具有更為狹窄的寄主范圍，更加安全。（參見P275）粘性末端5'-

pGGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGA5'-

p(a)l環化作用COS多、．－－－....

/，Z＇，沁少開環結構(b)與溶原性相關的

可以被外源DNA取代而不影響λ噬菌體的、

和裂解宿主細胞的能力。型載體（insert

vector）取代型載體（replacement

vector）生重組噬菌體DNA也可不經過體外包裝而直接通過轉染（轉化）方式進入宿主細胞；生

經過體外

操作和包裝后形成重組噬菌體，可以通過正常的途徑進入宿主細胞；質粒和噬菌體載體都可用于構建

文庫；但后者更有優勢：容納的外源DN

段較大；以途徑進入宿主細胞的效率比轉化高；以探針雜交－技－術－對－重－組－噬有菌關體技進術行在篩第選10章介紹1．原理特點：在體外模擬細胞內進行的DNA過程（參見P270）PCR技術的原理與方法parenmolecule3

}HelicaseFree

3'-0Hgle-stranded

binding

proteinDNA

polymeraseFigure

6.17

Events

at

the

DNA

replic

at

i

o

n

f

ork.LaggingstrandSemiconservative『eplicationnewstranddaughter

moleculedaughter

moleculeThe

Nobel

Prize

in

Chemistry

1993"for

contributions

to

the

developments

of

methodswithin

DNA-based

chemistry""for

his

invention

of

the

polymerase

chain

reaction

(PCR)

method"Kary

B.

MullisLa

Jolla,

CA,

USAB:1944*One

Friday

night

I

was

driving,…….

My

girlfriend,Jennifer

Barnett,

was

asleep.I

was

thinking.

…….*However,

shocking

to

me,

not

one

of

my

friends

or

colleagues

would

get

excitedover

the

potential

for

such

a

process.*In

September

I

did

my experiment.

I

like

to

try

the

easiest

possibilities

.So

one

night

I

puthuman

DNAand

the

nerve

growth

factor

primers

in

alittlescrew-cap

tube

with

an

O-ring

and

a

purple

top.I

boiled

for

a

few

minutes,

cooled,added

about

10

units

of

DNA

polymerase,

closed

the

tube

and

left

it

at

37°.

Itwasexactly

midnight

on

the

ninth

of

September.*The successful

experiment

happened

on

December

16th.

I

remember

thedate.

It

was

the

birthday

of

Cynthia,

my

former

wife

from

Kansas

City,

who

hadencouraged

me

to

write

fiction

and

bore

us

two

fine

sons.

I

had

strayed

fromCynthia

eventually

tospend

two

tumultuous

years

with

Jennifer.Kary

B.

Mullis基本原理：模板

引物

DNA聚合酶4種dNTP（參見P270～271）1.2Single

strands1.1Eu

0

9

0

eouEq

Jos

qe

a>l-e

-e

a1.00.90.8Melting—Doublestrand6?·2＿9TmII

I

I

I

l＼80

85

90

95

100ocHelicaseFree

3'-0H今Slow

coolingC

A

C

T

C

G

A

T＇，3

5LaggingstrandSingle-stranded

binding

proteinDNA

polymeraseDouble

stranreformedFigure

6.1vnt

a

t

t

h

DNA

re

p

l

ica

t

io

n o

r

k

.Heated