實(shí)驗(yàn)十五MTT法測(cè)定聚乙烯亞胺(PEI)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)導(dǎo)讀毒性是外來(lái)化合物對(duì)機(jī)體造成損害的能力。外來(lái)化合物是指存在于外界環(huán)境中，可能與機(jī)體接觸并進(jìn)入機(jī)體的一些化學(xué)物質(zhì)。外來(lái)化合物并非機(jī)體的組成成分，也非機(jī)體所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且也不是維持機(jī)體正常生理功能和生命所必需的物質(zhì)，但它們可由外界環(huán)境通過(guò)一定的環(huán)節(jié)和途徑與機(jī)體接觸并進(jìn)入機(jī)體，在機(jī)體內(nèi)呈現(xiàn)一定的生物學(xué)作用。常見(jiàn)的外來(lái)化合物有農(nóng)用化學(xué)品、工業(yè)化學(xué)品、藥物、食物添加劑、日用化學(xué)品、各種環(huán)境污染物及霉菌毒素雀毒性較高的物質(zhì)，只要相對(duì)較小的數(shù)量，就可對(duì)機(jī)體造成一定的損害；而毒性較低的物質(zhì)，則需要較多的數(shù)量，才呈現(xiàn)毒性。物質(zhì)毒性的高低僅具有相對(duì)意義。在一定意義上，只要達(dá)到一定數(shù)量，任何物質(zhì)對(duì)機(jī)體都具有毒性；在一般情況下，如果低于一定數(shù)量，任何物質(zhì)都不具備毒性；關(guān)鍵是此種物質(zhì)與機(jī)體接觸的量。除物質(zhì)與機(jī)體接觸的數(shù)量外，還與物質(zhì)本身的理化性質(zhì)以及其與機(jī)體接觸的途徑有關(guān)。以目前的技術(shù)手段在體外很難全面監(jiān)控化學(xué)物質(zhì)引起的全身效應(yīng)，因此大多數(shù)試驗(yàn)都是測(cè)定細(xì)胞水平的效應(yīng)，即細(xì)胞毒性(cytotoxicity)o這些試驗(yàn)簡(jiǎn)化了化學(xué)物質(zhì)針對(duì)的對(duì)象，體外的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)又缺乏神經(jīng)和體液的調(diào)節(jié)，因此只是一定程度的近似，但是細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)經(jīng)濟(jì)、易于量化而且重現(xiàn)性高，所以被廣泛應(yīng)用。將化學(xué)物質(zhì)加入到處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞中共孵育一段時(shí)間，然后將化學(xué)物質(zhì)換成正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，讓細(xì)胞再增殖2-3個(gè)群體倍增時(shí)間，這樣就可以把能夠增殖的存活細(xì)胞和那些被化學(xué)物質(zhì)毒性損傷后不能增殖的存活細(xì)胞區(qū)別開(kāi)來(lái)，然后用MTT染料還原反應(yīng)測(cè)定存活細(xì)胞的數(shù)目，這樣，就能檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞造成的損傷。聚乙烯亞胺(PEI)是一種聚陽(yáng)離子材料，廣泛應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，其在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率依賴于分子量的大小，一般來(lái)說(shuō)，分子量高于25KD時(shí)，PEI具有很高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，但細(xì)胞毒性也較高，相反，分子量低于2KD時(shí)，PEI幾乎沒(méi)有轉(zhuǎn)染效率，但毒性也比較低。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)兩種不同分子量的PEI(25KD和600)在Cos7細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，以比較兩種材料的細(xì)胞毒性。、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆占?xì)胞毒性測(cè)試的原理熟悉細(xì)胞毒性測(cè)試的方法二、 實(shí)驗(yàn)原理四唑鹽比色試驗(yàn)是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。顯色劑四唑鹽是一種能接受氫原子的染料，化學(xué)名是3—（4,5一二甲基噻唑一2—2,5一二苯基四氮唑嗅鹽，商品名是噻唑籃，簡(jiǎn)稱為MTT。檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物甲臜（formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)，大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選，細(xì)胞毒性試驗(yàn)及腫瘤放射感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速、易自動(dòng)化、無(wú)放射性污染，與其他檢測(cè)細(xì)胞活力的方法（如細(xì)胞計(jì)數(shù)法，軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)和3H-TdR摻入試驗(yàn)等）有良好的相關(guān)性。三、 儀器和試劑儀器：酶標(biāo)儀（BIO-RAD680，配有570nm的濾光片），微量震蕩器（用于震蕩96孔板），細(xì)胞培養(yǎng)用的常規(guī)儀器。試劑：（1） Cos-7細(xì)胞：于實(shí)驗(yàn)前穩(wěn)定培養(yǎng)，確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)良好，并于實(shí)驗(yàn)前一日細(xì)胞瓶中細(xì)胞約長(zhǎng)滿70%—80%左右。（2） MTT溶液：稱取250mgMTT放入小燒杯中，加入50mLPBS（0.01mol/l，PH7.4），攪拌30min，用0.22m濾器除菌，分裝，4°C保存，2周內(nèi)有效（5mg/mL）。（3） DMSO（二甲基亞砜）（4） 聚乙烯亞胺PEI25KDa和PEI600配成1mg/mL和10mg/mL兩種濃度（0.02MPBS作為溶液，PH7.4）。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.細(xì)胞接種，用0.25%胰蛋白酶消化單層Cos-7細(xì)胞，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種到96孔板上，8000細(xì)胞/孔，每孔體積200pLo細(xì)胞培養(yǎng)，將培養(yǎng)板放入CO2孵箱，在37°C、5%CO2及飽和濕度條件下，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁而未進(jìn)入分化階段（一般為＜16h）。吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)液，在細(xì)胞孔中分別加入PEI溶液，讓每孔中PEI的濃度分別為5,10，25,50，75,100，150，200pg/mL，每孔液體的總體積在200PLO（注意每種濃度都為三復(fù)孔，并要有不加任何PEI的對(duì)照孔至少3孔）PEI溶液與細(xì)胞共孵育3h。吸去培養(yǎng)液，每孔加入90皿無(wú)血清培養(yǎng)液和10皿的5mg/mLMTT溶液，37C孵育3h。翻板法棄去液體，每孔加入100皿DMSO，在震蕩器上震蕩10min。在酶標(biāo)儀上570nm波長(zhǎng)測(cè)OD值。細(xì)胞活力的計(jì)算式：細(xì)胞活力=每孔樣品OD值/每孔對(duì)照組OD平均值X100%統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。五、數(shù)據(jù)記錄與處理觀察PEI25KDa和PEI600的細(xì)胞死亡情況。用細(xì)胞活力計(jì)算細(xì)胞活力。以PEI濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活百分率（%）為縱坐標(biāo)進(jìn)行繪圖。注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)該觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度，一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一個(gè)孔內(nèi)貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)約有105個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)選擇的接種濃度能保證MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)為良好的線性關(guān)系，因此，細(xì)胞板的接種與實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的時(shí)間間隔不宜超過(guò)16h，以免細(xì)胞過(guò)早進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。避免血清的干擾。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)一般選擇10%的牛血清培養(yǎng)液進(jìn)行孵育，在加入化學(xué)物質(zhì)前，要盡量吸盡培養(yǎng)孔中殘余的培養(yǎng)液。設(shè)空白對(duì)照，與實(shí)驗(yàn)孔平行設(shè)置不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照組。進(jìn)行比色測(cè)定時(shí)，以空白孔為零值。六、思考題毒性的定義很廣泛，你能舉出身邊遇到的關(guān)于化學(xué)物質(zhì)毒性的例子嗎？如何用細(xì)胞記數(shù)法，計(jì)算細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞的濃度？參考文獻(xiàn)1司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正。細(xì)胞培養(yǎng)。北京：世界圖書(shū)出版公司，2006。2李永明，趙玉琪。實(shí)用分子生物學(xué)方法手冊(cè)。北京：科學(xué)出版社，2000。Cheol-HeeAhn,SuYoungChae,SungWanKimBiodegradablepoly(ethylenimine)forplasmidDNAdelivery.JournalofControlledRelease.2002,(80):273-282W.T.Godbey,KennethK.Wu,AntoniosG.Mikos.Poly(ethylenimine)anditsroleingenedelivery.JournalofControlledRelease.1999,(60):149-160MichaelNeu,DagmarFischer,ThomasKisselRec