1、. z.廣 州 大 學綜合設計性實驗報告學 院 生 命 科 學 學 院 課 程 細 胞 生 物 學 實 驗 實驗工程 實驗六 細胞培養 實驗題目 小白鼠肝細胞的原代培養專 業 生物技術年級、班別 14級姓 名 陳子禧 學 號 1414300004 任課教師 陳 鯤完成日期 2016 年 5 月 23 日 摘要 目的掌握小鼠肝細胞、表皮細胞的體外培養方法。采用脫臼法處死小鼠，用植塊培養法用眼科剪把肝組織剪成小于1mm大小的植塊，接種于培養瓶中進展體外培養；并用單細胞培養法酶解法進展肝細胞以及表皮細胞的培養。通過光鏡觀察細胞形態結果成功地培養出肝細胞、表皮細胞。肝細胞植塊組在體外培養一個星期仍能夠

2、保持良好的生長狀態。結論本實驗成功地實現了肝細胞的體外培養方法，尤其在植塊培養組中效果更為明顯。關鍵詞 原代培養 小白鼠 植塊培養 酶解法 肝細胞 表皮細胞 目錄1前言2實驗原理3實驗用品3.1試劑3.1.1 培養液 3.1.2 Hank液3.2 儀器3.3 材料 4 實驗方法4.1前期消毒滅菌4.2 實驗步驟5 實驗結果 5.1.圖片展示5.2.結果分析5.3結果匯總6 結果分析與討論7 參考文獻8 致謝1前 言目的 了解肝細胞、表皮細胞原代細胞培養的根本方法及操作過程。學習植塊培養法、單細胞培養法酶解法、營養液的配制及酸堿度的調節。初步掌握無菌操作方法。意義：細胞培養是當前細胞生物學乃至整

3、個生命科學研究與生物工程中最根本的實驗技術。當前，細胞培養技術廣泛應用于分子生物學、遺傳學、免疫學、腫瘤學、細胞工程等領域，已開展成為一種重要的生物技術。1方法 ：采用肝組織塊外植培養法通過無菌造作培養新生小鼠細胞。 結果 ：運用這種方法成功地培養出原代肝細胞 。結論 ：這種方法為廣泛開展肝細胞原代培養奠定了根底。2實驗原理原代細胞培養是指直接從動物體內獲取的細胞、組織或器官，經體外培養后，直到第一次傳代為止。這種培養，首先用無菌操作的方法，從動物體內取出所需的組織或器官，用植塊培養法，在人工培養下，使其不斷地生長及繁殖。細胞培養是一種操作繁瑣而又要求十分嚴謹的實驗技術。在準備過程中我們要是細

4、胞能在體外長期生長，必須滿足兩個根本要求：一.是供應細胞存活所必須的條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環境酸堿度與滲透壓的調節。二.嚴格控制無菌條件。3實驗用品3.1器材眼科剪尖頭、彎頭各一把、眼科鑷尖頭一把、培養皿一個、試管一支、直、彎吸管各一支、刻度吸管一支、吸管膠頭三個、小燒杯一個、培養瓶一個等。上述器材均須徹底清洗、烤干、包裝好，9.910 4Pa 15磅滅菌30min，備用。此外，還有顯微鏡、酒精燈、酒精棉球、碘酒棉球、試管架、標記筆、恒溫箱。3.2試劑培養液 RPMI-1640 (2-3ml/培養瓶,根底培養基 80-90%

5、、胎牛血清 10-20%、雙抗 1-2% ,主要提供生長因子和細胞因子。抗菌素：1萬單位青、鏈霉素占1%。 組織清洗液hanks液、PBSPhosphate-Buffered Sallines3.3 材料小白鼠幼體2只4實驗方法4.1前期準備工作4.1.1 對玻璃儀器進展清洗1浸泡：清水浸泡12小時2刷洗：清潔劑、毛刷刷洗，清潔劑清洗2次，自來水沖洗5次，烘箱50烘干 3然后再浸入 5 稀鹽酸中 12 小時以除去臟物、鉛、砷等物。4刷洗、烘干：12 小時后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。5泡酸、清洗：用清潔液重鉻酸鉀 120g ：濃硫酸 200ml ：蒸餾水 100

6、0ml 浸泡 12 小時，然后從酸缸內撈出器皿用自來水沖洗 15 次，最后蒸餾水沖洗 3-5 次和用雙蒸水過 3 次。6烘干、包裝：洗干凈后先烘干，加脫脂棉，然后用紙包裝。7 高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋滅菌8烘干：50烘箱進展烘干。對器械和無菌操作臺進展消毒滅菌物理消毒滅菌法紫外線：進展30min照射，用于空氣，操作臺外表和不能使用其它法進展消毒的培養器皿；高壓蒸氣滅菌法：121，20min；干烤：160, 2 小時；化學消毒滅菌法75%酒精：主要用于操作者的皮膚，操作臺外表及無菌室內的壁面處理；1%新潔爾滅：主要用于器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒；抗生素：用于培養液滅菌或預防培

7、養物污染，如青霉素、慶大霉素等。4.2 實驗步驟6 細胞原代培養(1)用洗滌劑刷洗雙手自來水沖凈新潔爾滅浸泡進入無菌操作室。(2)操作前放入所需器具并進展30minUV滅菌，操作者于超凈臺內用酒精棉消毒雙手切記：嚴禁將培養液含有血清、蛋白等在UV下進展滅菌。(3)翻開試管、吸管膠頭包裝，將試管插盡量斜插入試管架.(4)取出需用的吸管直、彎吸管各一支，刻度吸管一支套上膠頭，將試管插入相應的試管中。(5)翻開培養皿以及解剖工具手持端的包裝。(6)在小組其他成員已翻開腹腔的根底上切取小鼠肝臟組織塊,并迅速取出肝臟并將其放入Hanks 液中進展漂洗2次.移入小燒杯中。并同時剪取表皮組織進展Hanks液

8、漂洗2次。注意:整個取材過程中,都要保持肝臟的濕潤,隨時給肝臟塊滴加一些培養液或者平衡鹽溶液，防止細胞脫水死亡 (7)接種與培養過程植塊培養A 將擬培養的肝組織用眼科剪剪成約1mm大小的植塊，用hanks液適當漂洗，棄hanks液，加少量培養液；將表皮組織稍微剪碎后放置胰蛋白酶中酶解3至5min，吸去上清液并立即參加培養液3至4ml，并輕柔吹打得上清液。B取2培養瓶，在培養瓶的上面做好標志在瓶側注明班、組別、*、材料名稱等信息。C 用培養液濕潤的吸管小心吸取肝臟植塊,輕輕吹出到培養瓶的培養瓶面內,按照一定的間隔和形式用彎吸管將植塊排列好。D 翻轉肝植塊組培養瓶培養面在上方，參加4ml的培養液；

9、直接將表皮細胞組的上清液吸至培養瓶中。E 將培養皿加蓋封口,送入37度恒溫箱內,靜置參加的培養液不浸泡植塊，不從瓶口流出。F 假設干小時后長短視各人操作而異，待植塊充分貼壁后，翻轉培養瓶使植塊浸于培養液中且不漂浮。G 觀察 至于37度培養的細胞，需逐日進展觀察，主要觀察：1培養長與培養液顏色的變化，如培養液變為紫紅色，一般細胞生長不好。可能是瓶塞未蓋緊或營養液pH過高。3培養液假設變為桔紅色，一般表示細胞生長良好。 經過12天培養后，假設細胞生長情況較差或培養液變紅了，則可換一次營養液。換液時也要注意無菌操作假設經過12天培養后,假設細胞生長情況較差或培養液變紅,則需換液。酶解法與植塊法有所區

10、別，植塊組：從37攝氏度培養箱中取出培養瓶，于超凈工作臺內吸去全部舊培養液用平衡鹽溶液輕緩漂洗培養物12次,棄平衡鹽溶液，參加與換液前一樣的量的培養液，放回原來的培養箱繼續培養酶解法：將舊的培養液吸出約1/2再重新參加等量培養液。每日觀察結果用文字記錄，換液也需記錄，在整個培養過程的不同階段最少在前、中、后階段置倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況并拍照記錄。 *備注：每次取培養瓶時用酒精噴灑手掌及手臂，另外旋緊瓶口取出，再噴灑酒精，由于我們操作嚴謹，所以直至換液后正常生長期內未出現嚴重污染。中期換液一次5實驗結果5.2.結果分析形態學觀察結果4.11日別離的肝細胞，在培養3h后即能夠充分貼壁生長并在

11、第三天已經開場觀察到新生組織。用酶解法處理的表皮細胞，前期生長不夠理想但到第10天開場觀察到新生細胞。階段一：肝細胞在生長期2448h，直至第三天4.13日，間隔接近48小時，細胞狀態較好如圖一所示，且生長的細胞越來越多，細胞開場在植塊的邊緣生長，形成一圈透明狀的新生細胞；表皮細胞可能由于我們經歷缺乏，酶解時間稍長，需要更多時間進展細胞分裂增殖，故第二天僅能觀察到碎屑，如圖二所示，但在第三天開場觀察到局部細胞集團，未能肯定地確定是增殖細胞。如圖三所示【此觀察時期為第一周，第2-3天】階段二：肝細胞生長第七天，已能在超過組織植塊的*圍下觀察到單層生長的肝細胞，且較為明顯(如圖四所示)；另外表皮細

12、胞能觀察到較多碎屑，且夾雜著局部圓形小型影像，推測可能為新生表皮細胞如圖五所示【此觀察時期為第一周，第7天】。階段三：表皮細胞生長的第十一天圖六，表皮細胞已經較為明顯，盡管夾雜在細胞碎屑之中但明顯能分辨出閃亮、形體較小、而且呈圓形的新生表皮細胞；肝細胞生長第十一天圖七，圖七植塊周圍有少量的細胞貼壁生長，其中有些透明狀的是氣泡,但明顯觀察到大量圓形閃亮黃色透明狀細胞，中間帶有細胞集團，但體積較小，推測可能為碎屑【此觀察時期為第二周，第11天】階段四：終止實驗停頓培養，細胞生長第14天，肝臟植塊組周圍有雪花狀微生物生長，另外表皮細胞組也已經無明顯增殖細胞，較多不透光的細胞碎屑出現，故停頓實驗如圖八

13、所示。【此觀察時期為第三周，第14天】5.3結果匯總：本次實驗結果較為成功。肝細胞在培養第11天觀察培養效果最正確，而表皮細胞同樣在11天觀察到增殖效果。但植塊法在培養時長上比酶解法占優勢，增殖速率較快且結果明顯便于觀察。其中我們實驗共分為三個階段階段一：第一周，第2-3天其中進展過一次換液本階段肝細胞已能觀察到增殖效果，而表皮細胞仍然停留于原始狀態。階段二：第一周，第7天本階段肝細胞的增殖效果已經十清楚顯，能觀察到單層的新生細胞。而表皮細胞的效果并不明顯。階段三：第二周，第十一天肝細胞以及表皮細胞的增殖效果都到達最正確，最易于觀察。階段四：肝細胞植塊組已經出現微生物污染，表皮細胞有死亡跡象，

14、終止實驗。5.1.圖片展示圖一:第三天48h小白鼠肝組織的生長情況圖二:第二天小白鼠表皮細胞的生長情況圖解： 圖解比照第一天接入后觀察的植塊，植塊邊緣透光度提高第二天的效果與第一天移入細胞液的效果相似，在縮小放大倍數和增大光圈后可以觀察得更為明顯。 無明顯細胞分裂增殖效果，移入培養箱繼續觀察。所以根本上可以確認有新生肝細胞生成。 拍攝時間：2016/4/1316:30)(拍攝時間：2016/4/12 10:50)圖三：第三天小白鼠表皮細胞生長情況 圖四：第七天小白鼠肝細胞生長情況圖解： 圖解：出現局部集團狀的表皮細胞，如圖D1、D2、D3區域。肝細胞已經較為明顯，可以觀察到白色圈包括著新生呈閃

15、亮狀態的肝細胞。 拍攝時間：2016/4/13 (拍攝時間：2016/4.17)圖五.第七天小白鼠表皮細胞生長情況 圖六.第十一天小白鼠表皮細胞生長情況圖解： 圖解：較多碎屑夾雜著局部圓形小型影像，推測為新生表皮細胞 表皮細胞已經較為明顯，盡管夾雜在細胞碎屑之中但明顯能分辨出閃亮、形體較小、而且呈圓形的新生表皮細胞。拍攝時間：2016/4/17 (拍攝時間：2016/4/21)圖七. 第十一天小白鼠肝細胞生長情況 圖八.第十四天小白鼠表皮細胞生長情況金黃色透亮的圓形新生肝細胞，為總培養時期中最正確的狀態 已經生成局部細胞廢物，且含大量不透明死亡細胞碎屑。由此可以判斷植塊法培養肝臟細胞根本成功。

16、拍攝時間：2016/4/21(拍攝時間：2016/4/25)6 結果分析與討論本實驗用肝組織塊外植培養法成功地培養出肝細胞，并利用單細胞培養法酶解法成功培養出表皮細胞。肝細胞植塊培養法操作簡單、肝組織易于貼壁、生長力好。這種方法也不需要摸索條件，容易成功且效率高易于觀察。但通過本次實驗我們探索到使用這種方法時要注意子組織塊應盡量剪切均勻，約1mm左右。組織塊過大，組織塊中央的細胞不能得到充足的營養，不能完全游離出來。組織塊相互距離以0.5cm為宜，在組織塊植入的最初12天內，需保持絕對靜置培養，以利于肝細胞貼壁，防止組織塊漂浮。 而酶解法的技術含量和要求較高，盡管實驗結果未如理想但仍為成功。酶解法要求酶解時間和取液量多少的把握程度較高，我們小組未有經歷但經過學習和重復操作，通過學習，我們感覺在酶解法中取得的收益更多。細胞培養是現代生物科學中開展十分迅速的一種實驗技術，它為細胞學、遺傳學、病毒學、免疫學的研究和應用做出了重要奉獻。細胞培養是指從體內組織取出細胞摹擬體內出現環境，在無菌、適當溫度及酸堿度和一定營養條件下，生長繁殖，并維持其構造和功能的一種培養技術。細胞培養的培養物為單個細胞或細胞群。2所以我們通過本次實驗過程能