1、關于基因工程工具酶第1頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四DNA重組技術的基本工具“分子手術刀”“分子運輸車”“分子縫合針”基因工程的工具酶 限制性內切酶I型限制性內切酶II型限制性內切酶III型限制性內切酶 DNA連接酶E. coli DNA連接酶T4 DNA連接酶 載體克隆載體表達載體第2頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四一、基因工程的工具酶1、工具酶的概念與種類工具酶：凡是基因工程中應用的酶類通稱為基因工程工具酶。修飾切連按用途為三類限制性核酸內切酶DNA連接酶DNA修飾酶第3頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四2、限制性核酸

2、內切酶(restriction enzyme) （1）限制性核酸內切酶的概念核酸酶：切割相鄰的兩個核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，導致核酸分子多核苷酸鏈發生水解斷裂的酶叫做核酸酶。 限制性核酸內切酶：一類能識別雙鏈DNA分子中特異的核苷酸序列（48bp），并由此處切割DNA雙鏈的核酸內切酶。第4頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四（2）限制性核酸內切酶的發現for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular geneticsThe Nobel Prize

3、in Physiology or Medicine 1978Werner Arber Switzerland 1929Daniel Nathans USA 19281999Hamilton O. Smith USA1931第5頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四 20世紀60年代在研究細菌的限制和修飾現象時被Linn和Arber發現。寄主限制與修飾現象(Restriction and modification )在E. coli K上生長的噬體則表示為（K）。實驗表明，用這種（K）噬菌體感染E. coli B，形成噬菌斑的效率就很低因此（K）噬菌體受到了B菌體的限制。 11

4、第6頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四限制性內切酶將侵入細菌體內的外源DNA切成小片段。限制（Restriction）第7頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四細菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護，不能被自身的限制性內切酶識別切割。修飾（Modification） Dam甲基化酶GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二個C上C5位置上引入甲基第8頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四生物體內普遍存在的限制修飾現象。限制是restriction,修飾modification,所以把這一系統

5、叫做：R/M體系。限制與修飾是由兩種酶引起的，一種是甲基轉移酶，一種是核酸內切酶。限制與修飾存在兩方面的作用：一是保護自身的DNA不受限制，即不被切割；二是破壞外源DNA使之迅速降解。第9頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四（3）限制性核酸內切酶的種類第10頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四（4）限制性核酸內切酶的命名屬名 種名 株名Haemophilus influenzae d 嗜血流感桿菌d株Hind III同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內切酶EcoR IEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號 若種名頭2個字母相同則其中一個

6、可用種名的第一和第三個字母。第11頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四（5）限制性核酸內切酶的特征特異的識別序列、嚴格切割位點EcoR I的切割位點EcoR I的識別序列5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5Cleavage sites識別-8個相連的核苷酸 4 個堿基識別位點：Sau3A GATC 5 個堿基識別位點：EcoR CCWGG Nci CCSGG 6 個堿基識別位點：EcoR GAATTC識別序列與DNA的來源無關識別序列越長切割頻率越小識別序列越短切割頻率越大第12頁，共76頁，2022年

7、，5月20日，5點55分，星期四識別序列特點 回文結構(palindrome)EcoR I5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5 5 GG-A-T-C-C 3 3 C-C-T-A-GG 5 BamHI居 然 天 上 客 客上天然居切點大多數在識別序列之內，也有的在序列兩側Sau3A 5 GATC 3EcoR 5 CCWGG 3 Nci 5 CCSGG 3 EcoR 5 GAATTC 3 第13頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四切點大多數在識別序列之內，也有的在序列兩側Sau3A 5 GATC 3EcoR

8、 5 CCWGG 3 Nci 5 CCSGG 3 EcoR 5 GAATTC 3 限制酶切后產生兩個末端末端結構：-和-末端種類：平頭末端和黏性末端 -端突起和-端突起第14頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四PstI等產生的3粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5第15頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四-端突起 Pst I 5-CT

9、GCAG-3 5-CTGCA G-3 3-GACGTC-5 3-G ACGTC-5-端突起 EcoRI 5-GAATTC-3 5-G AATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAA G-5平頭末端（Blunt ends） SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5第16頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四粘性末端的意義ii）同一個DNA分子內連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環形分子。i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補就可以連接。這比連接兩個平齊末端容易的多。連接便利粘性末端標記凸出的5 末端可用D

10、NA多核苷酸激酶進行32P標記。凸出的3端可以通過末端轉移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 補平成平齊末端粘性末端可以用DNA聚合酶補平成平齊末端。第17頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四（6） 同位酶、同尾酶與同裂酶同位酶：具有相同的識別序列，但是酶切位點不同。 SmaI CCCGGG XmaI CCCGGG同尾酶：來源各異，識別序列不同，但切割后產生相同的黏性末端。 Sal I G TCGAC Xho I C TCGAG同裂酶：能識別相同序列，且識別位點與切割位點均相同，但來源不同的兩種或多種限制酶。 SstI CCGC GG Sac

11、I CCGC GG第18頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四（7）大部分II 型核酸內切酶需要的反應條件不同的酶使用不同的類型反應體系Tris-HCl50 mM pH 7.4MgCl210 mMDTT/BSA1 mMVolume20 - 100 lTep. and Time37 , 1 - 1.5 hr1 U 核酸內切酶的酶活性：在最佳反應條件下反應 1 小時，完全水解 1 g 標準DNA所需的酶量第19頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四（8）影響核酸內切限制酶活性的因素 DNA的純度蛋白質、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，

12、1 mg DNA 用 10U 酶加大反應總體積延長反應時間第20頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四DNA樣品的甲基化程度大腸桿菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、 Bgl II、Sau3A I不受影響 大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoR II等哺乳動物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基第21頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四酶切消化反應溫度不同酶之間所需最適反應溫度不同，且彼此間有

13、相當大的變動范圍。大多數酶標準反應溫度都是37。 例外：Sma 25Apa 30Mae 45Taq 65第22頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四DNA的分子結構DNA分子的不同構型對核酸內切限制酶的活性也有很大的影響。某些核酸內切限制酶切割超盤旋的質粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化線性DNA的高出許多倍，最高的可達20倍。此外，還有一些核酸內切限制酶，切割它們自己的處于不同部位的限制位點，其效率亦有明顯的差別。 第23頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四核酸內切限制酶的緩沖液核酸內切酶的標準緩沖液的組份包括：氯化鎂、氯化納或氯化鉀、Tris-

14、HCl，-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常發揮，是絕對地需要二價的陽離子，通常是Mg2+。不正確的NaCl或Mg2+濃度，不僅會降低限制酶的活性，而且還可能導致識別序列特異性的改變。酶切時間 通常酶切時間12小時，但大多數酶的活性可維持很長時間，我們可以酶切過夜。第24頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四 高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等，會使一些核酸內切酶的識別和切割序列發生低特異性，即所謂的星號活性（Star activity）現象，即限制酶在非標準反應條件下，能切割一些與之特異型識別順序類似的序列，降低酶切的特

15、異性，這種現象稱為星號活性。非適宜環境EcoR I在正常條件下識別并切割5GAATTC3序列，但在甘油濃度超過5%（v/v）時，也可切割5PuPuATPyPy3或者5AATT3第25頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四抑制星號活性的方法 1)盡量用較少的酶進行完全消化反應。這樣可以避免 過度消化以及過高的甘油濃度。 2)盡量避免有機溶劑（如制備DNA時引入的乙醇）的污染。3)將離子濃度提高到100-150 mM（若酶活性不受離子 強度影響）。 4)將反應緩沖液的pH值降到7.0。5) 二價離子用Mg2+。 第26頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四不同的

16、酶生產廠家適合各種不同反應的緩沖液TakaraNEBLTI (Gibcol-BRL)PromegaRocheMBI第27頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四3、 DNA連接酶（ligase）（1）DNA連接酶的概念 是指利用ATP分子中的-磷酸基團為能量，通過催化兩條并排DNA鏈的5-磷酸基團和3-羥基之間，形成一個磷酸二酯鍵，而使兩個DNA片段共價連接起來的特異的核酸酶。ATP依賴的DNA連接酶NAD依賴的DNA連接酶大多數原核生物DNA連接酶真核生物和病毒DNA連接酶，如T4DNA連接酶、真核生物DNA連接酶、類 型第28頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分

17、，星期四（2）DNA連接酶的特性DNA連接酶不能連接兩條單鏈DNA分子或環化的單鏈DNA分子，被連接的必須是雙螺旋DNA的一部分。第29頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四DNA連接酶只能連接DNA雙螺旋骨架上的切口，而不能連接缺口。第30頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四T4 DNA連接酶用途： 1）互補粘性末端的連接; 2）平頭末端的相連； 3）一條帶有切口的雙鏈DNA分子； 4） DNA雜合體中鏈上的切口。E.coli DNA連接酶用途：1) 互補粘性末端的連接;2) 一條帶有切口的雙鏈DNA分子。第31頁，共76頁，2022年，5月20日，5點

18、55分，星期四（1）由ATP（或NAD+）提供AMP，形成酶-AMP復合物，同時釋放出PPi或NMN；（3）連接機理（2）激活的AMP結合在DNA鏈5端的磷酸基團上，產生含高能磷酸鍵的焦磷酸酯鍵；（3）與相鄰DNA鏈3羥基相連，形成磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。第32頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四（4）不同末端連接策略單酶切產生的相同黏性末端第33頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四雙酶切產生的黏性末端第34頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四雙酶切產生不同的5突出末端第35頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四

19、雙酶切產生不同的3突出末端第36頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四雙酶切產生的5突出末端和3突出末端第37頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四平切產生的平末端第38頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四平末端DNA片段的連接操作從分子動力學的角度講，由限制性核酸內切酶創造的粘性末端的連接屬于分子內部的連接，而平末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應速度要慢得多提高平末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機會 加入10% PEG8000，促進大分子之間的有效作用加入單

20、價陽離子（NaCl），最終濃度150-200 mM第39頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四常用的平末端DNA片段連接法，主要有同聚物加尾法、銜接物連接法及接頭連接法 同聚物加尾法 第40頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四銜接物連接法 銜接物（linker），是指用化學方法合成的一段由1012個核苷酸組成、具有一個或數個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。 第41頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四DNA接頭，是一類人工合成的一頭具某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。 第42頁，共76頁，2022年，

21、5月20日，5點55分，星期四Tris-HCl50-100 mM pH 7.5MgCl210 mMATP0.5 - 1mMDTT5 mMVolume10 - 20lTep. and Time4-15 , 4 - 16 hr1 U DNA連接酶的酶活性：在最佳反應條件下15 反應 1 小時，完全連接 1 g DNA（Hind III片段）所需的酶量（5） DNA連接酶的反應條件第43頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現象。插入片段與載體的濃度比例 反應溫度插入片段濃度高，至少21。一般1416（6） 影響DNA連接反應的因素

22、平末端DNA分子的連接最適反應的酶量為12個單位， 粘末端的連接，酶量為0.1個單位較好。 DNA連接酶用法與用量第44頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四4、 DNA聚合酶（ligase）（1）DNA聚合酶的概念和類型DNA聚合酶：指在DNA(或RNA)模板指導下，以4種脫氧核糖核苷酸（dNTP）為底物，在引物3 -OH末端聚合DNA鏈的一類酶。DNA聚合酶的類型 根據DNA聚合酶所使用的模板不同，將其分為兩類：（1）依賴于DNA的DNA聚合酶；（2）依賴于RNA的DNA聚合酶。第45頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四大腸桿菌DNA聚合酶 Kleno

23、w fragment (克列諾酶)T7 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶 修飾過的T7 DNA聚合酶 逆轉錄酶（2）常見DNA聚合酶及共有特點第46頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四以脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)為前體催化合成DNA;需要模板和引物的存在;不能起始合成新的DNA鏈;催化dNTP加到生長中的DNA鏈的3-OH末端;催化DNA合成的方向是53。 共同特點主要區別持續合成能力和外切酶活性不同 。 T7 DNA聚合酶可以連續添加數千個dNTPs而不從模板上掉下來。 其它幾種DNA聚合酶只能連續添加10多個dNTPs就會從模板上解離下來。 第47頁，共76頁，202

24、2年，5月20日，5點55分，星期四DNA聚合酶35外切酶活性53外切酶活性聚合速率持續能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenow fragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學修飾T7DNA聚合酶低無快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉錄酶無無低中Taq DNA聚合酶無有快高常用DNA聚合酶的特性比較第48頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四（3） DNA聚合酶I大腸桿菌的DNA聚合酶I是一條約1000個aa 的多肽鏈形成的單亞基蛋白，分子量109Da.三種活性： 聚合酶活性：將4種脫氧核糖核苷酸聚合為新的DNA鏈。 53外切酶活性:

25、位于N端 3 5外切酶活性: 防止錯配。第49頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四 底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） Mg2+ 帶有3OH游離端的引物 DNA模板DNA聚合酶I（Pol I）的聚合活性反應條件-OH5 3 dNTPs第50頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四標記 核酸探針（probe） 能夠同某種被研究的核酸序列特異性結合的，帶有標記的寡聚核酸分子。用DNA聚合酶I 制備探針已知序列的核酸片段顯示位置與互補的待測序列雜交第51頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四標記已知序列的核酸片段 探針的標

26、記方式標記已知序列的核酸片段5 3 標記一端帶有放射性的已知序列的核酸片段全序列標記第52頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四 DNA聚合酶I 對探針序列的標記切口轉移法(nick translation )：放射性同位素標記：DNA聚合酶I 同時具備53外切酶活性和53的聚合酶活性（以及35外切酶活性）。第53頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四53外切酶活性從DNA切口的下一段DNA5端除去一個核苷酸后，聚合酶活性就會在切口的上一段DNA的3一側補上一個新的核苷酸。切口切口5 5 3 3 5 3 5 3 第54頁，共76頁，2022年，5月20日，5

27、點55分，星期四純化的DNA片段DNase I 制造單鏈切口DNA Pol I 進行切口轉移一種-32P-dNTP和dNTPs 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 32P-dNTP32P-dNTP從頭至尾都被標記第55頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四（4） Klenow fragment用枯草桿菌蛋白酶處理Pol I可以切掉N端的53外切酶活性部分。就成為Klenow fragment。323個氨基酸小片段5 核酸外切酶活性大片段/Klenow 片段 605個氨基酸DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性N 端C 端木瓜蛋白酶DNA-pol 第5

28、6頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四 DNA 3末端標記在3隱蔽端加上放射性標記的dNTP。 3端補平5 5 klenow補平限制性內切酶切后形成的3隱蔽端。klenow主要用途第57頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四3隱蔽末端的DNA片段Klenow fragment補平根據末端的順序選擇一種 -32P-dNTPs末端標記的DNA 限制性內切酶切5-G3 3-CTTAA5 5-GAA3 3-CTTAA5 5-GAATT3 3-CTTAA5 5-G3 3-CCTAG5 5-GG3 3-CCTAG5 5-GGATC3 3-CCTAG5 EcoR IBa

29、mH I-32P-dATP-32P-dGTP25oC 1h第58頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四 cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉錄cDNA第二鏈klenow5 3 3 5 5 3 引物第59頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四（5）逆轉錄酶依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導的DNA聚合酶）。a、鳥類骨髓母細胞瘤病毒(AMV)逆轉錄酶b、莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉錄酶主要種類53聚合酶活性53外切酶活性35外切酶活性RNase H活性末端轉移酶活性酶活性第60頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四逆轉錄酶

30、的用途 合成cDNA以oligo dT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補結合）。3AAAAAAAAAAAAAA5mRNA5TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18反轉錄酶Mg2+ dNTP3AAAAAAAAAAAAAA5mRNA5TTTTTTTTTTTTTTTT3cDNA第61頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四 合成cDNA雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈35mRNA RT-PCR用的模板克隆某個基因時，用其mRNA反轉錄出cDNA第一鏈。53cDNA35mRNA53cDNA反轉錄酶53cDNAklenow35mRNA第62頁，共76頁，20

31、22年，5月20日，5點55分，星期四（6）Taq DNA聚合酶1988年Saiki 等從水生嗜熱桿菌中提取到一種耐熱Taq DNA聚合酶Taq DNA聚合酶的應用使得PCR能高效率的進行，PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環儀。該酶基因全長2.49kb，編碼832個氨基酸。該酶雖然在90以上幾乎無DNA合成， 但確有良好的熱穩定性。（天然酶）Taq DNA聚合酶的熱穩定性是該酶用于PCR反應的前提條件，也是PCR反應能迅速發展和廣泛應用的原因。第63頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四酶活性與熱穩定性酶蛋白分子量 94KDa，比活性200 000/mg，Ta

32、q酶的濃度通常為12.5/l，太多浪費并易導致非特異性擴增。熱穩定性好：能耐受DNA變性時的高溫 在92.5、95 、97.5時，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分別經130min、40min、5min后，仍可保持50%的活性。 PCR反應時變性溫度為9520sec，50個循環后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。 第64頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四Taq DNA聚合酶是Mg2+ 依賴性酶，對Mg2+ 濃度非常敏感。Mg2+濃度2.0mmol/L時，能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性。Mg2+ 能與dNTP結合而降低PCR反應液中游離的Mg2+ 濃度，

33、優化濃度一般反應 中Mg2+ 濃度至少應比dNTP總濃度高0.51.0 mmol/L。適當濃度的KCl能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高5060%。離子依賴性第65頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四TaqDNA聚合酶具有53 聚合酶活性和53外切酶活性，而無3 5外切活 性，在PCR反應中如發生某些堿基的錯配，該酶是沒有校正功能。Taq DNA聚合酶的堿基錯配機率為2.110-4。Taq DNA聚合酶還具有逆轉錄酶活性.忠實性Taq酶的最適溫度最適溫度： 72-78 oC 延伸速度： 約1000nt/min酶分子 最長延伸長度：6.7kb第66頁，共76頁，2022年，5月20日，5點55分，星期四5、 DNA修飾酶體內有些酶可在其他酶的作用下，將酶的結構進行共價修飾，使該酶活性發生改變，這種