1、會計學1制備液相色譜技術會計學1制備液相色譜技術高效制備液相色譜的原理： 色譜分離原理無論是分析型色譜還是制備型色譜都是相同的，那就是色譜理論。 但是在理論的遵循上，制備型有時需打折扣。 這是由于兩種類型的色譜最終的目的是不同的。分析型色譜：分離度高，靈敏度高，以含量測定為目的。制備型色譜：要求純度、產量和收益。第1頁/共68頁高效制備液相色譜的原理： 色譜分離原理無論是分 經典的制備色譜方法與高效制備液相色譜的異同及優缺點：相同：目的相同；某些方法原理也相同。不同：自動化程度不同，效率不同，分離復雜化合物的能力不同。經典制備色譜方法：柱色譜、薄層色譜 第2頁/共68頁 經典的制備色譜方法與高

2、效制備液相色譜的異同及第3頁/共68頁第3頁/共68頁第4頁/共68頁第4頁/共68頁第5頁/共68頁第5頁/共68頁高效制備液相色譜優點：效率高，收率相對較高，特別適合復雜樣品、性質接近化合物的純化。純化效果理想。缺點：設備復雜昂貴，投資大，運行費用較高。經典制備色譜方法優點： 設備簡單，投資小，見效快。能滿足一般樣品的 純化要求。缺點： 效率低下，收率低，對于過于復雜的化合物，純化效果不理想。第6頁/共68頁高效制備液相色譜經典制備色譜方法第6頁/共68頁 制備液相色譜又稱純化系統，是目前高效率制備純化合物最有力的方法，廣泛應用于： 1.天然產物的分離與純化 2.合成藥物的純化 3.合成反

3、應中間產物或副產物的制備 4.手性藥物的分離與純化 5.藥物雜質的分離制備 . . . . . .第7頁/共68頁 制備液相色譜又稱純化系統，是目前高效率制備純第8頁/共68頁第8頁/共68頁重復性第9頁/共68頁重復性第9頁/共68頁選擇性要求第10頁/共68頁選擇性要求第10頁/共68頁色譜柱吸附等溫線正常載荷(loading)：第11頁/共68頁色譜柱吸附等溫線正常載荷(loading)：第11頁/共68色譜柱吸附等溫線超載(overloading)：第12頁/共68頁色譜柱吸附等溫線超載(overloading)：第12頁/共純度（purity)、產量（throughput）和收益（y

4、ield）（PTY）三者的關系第13頁/共68頁純度（purity)、產量（throughput）第13頁/濃度過載和體積過載濃度過載體積過載決定于流動相中的溶解度；位于吸附等溫線的“制備”區域；產量由選擇性決定；固定相顆粒大小影響較低。決定于進樣體積；位于吸附等溫線的“分析”區域；產量由柱子的直徑決定；固定相顆粒需要小一些。 通常濃度過載和體積過載結合著使用。而由于產量較高的緣故，因而更喜歡使用濃度過載。第14頁/共68頁濃度過載和體積過載濃度過載體積過載決定于流動相中的溶解度；決濃度過載和體積過載色譜示意圖第15頁/共68頁濃度過載和體積過載色譜示意圖第15頁/共68頁什么時候使用濃度過載

5、?什么時候使用體積過載? 一般情況下，由于需要有較大的throughput，所以濃度過載使用較多，但當樣品濃度過稀，又沒有合適的方法濃縮時或流動相溶解樣品的能力較弱時，這時就應當使用體積過載。第16頁/共68頁什么時候使用濃度過載? 一般情況下，由于需要有較由分析型色譜如何擴展到制備型色譜？擴展計算第17頁/共68頁由分析型色譜如何擴展到制備型色譜？擴展計算第17頁/共68頁擴展計算第18頁/共68頁擴展計算第18頁/共68頁擴展計算舉例r1=1.5mm, r2=10.6mm, V1=0.6mL/min V2=? 計算結果：30mL/min第19頁/共68頁擴展計算舉例r1=1.5mm, r2

6、=10.6mm, V1=30ml/min擴展計算舉例?計算結果25mg第20頁/共68頁=30ml/min擴展計算舉例?計算結果25mg第20頁/共0.35mL/min流速下的色譜圖（分析型）第21頁/共68頁0.35mL/min流速下的色譜圖（分析型）第21頁/共68經擴展計算，采用不同的柱徑、進樣量和流速樣品的色譜圖第22頁/共68頁經擴展計算，采用不同的柱徑、進樣量和流速樣品的色譜圖第22頁上述五種色譜狀態的參數：第23頁/共68頁上述五種色譜狀態的參數：第23頁/共68頁在分析型色譜柱上，不同進樣量的色譜圖第24頁/共68頁在分析型色譜柱上，不同進樣量的色譜圖第24頁/共68頁在制備型

7、色譜柱上的色譜圖第25頁/共68頁在制備型色譜柱上的色譜圖第25頁/共68頁制備液相餾分收集的三種方式1. 基于時間（Time-based）2. 基于峰（peak-based）3. 基于質量（Mass-based）第26頁/共68頁制備液相餾分收集的三種方式1. 基于時間（Time-base基于時間（Time-based） 根據餾分的保留時間及其色譜峰寬，以時間作為餾分收集器動作的指令參數。特點： 參數設置方便，樣品收益高、損失少。 色譜保留時間的不穩定會影響到餾分的純度和收益。第27頁/共68頁基于時間（Time-based） 根據餾分的保Time-based用峰的時間分割，按峰收集餾分 色

8、譜峰重疊嚴重，重疊面積很大，收集到的兩個餾分將明顯不純。這時應考慮使用Time-based。第28頁/共68頁Time-based用峰的時間分割，按峰收集餾分 Time-based第29頁/共68頁Time-based第29頁/共68頁基于峰（Peak-based） 根據色譜峰的正負斜率，觸發餾分收集器，以色譜峰正負斜率作為餾分收集器動作的指令參數。特點： 餾分純度高。 餾分保留時間的不穩定不會影響到餾分的純度。 參數設置不方便（斜率參數需計算）；受色譜峰峰形改變的影響較大。 樣品收益低。第30頁/共68頁基于峰（Peak-based） 根據色譜峰的正 利用正、負斜率按峰進行餾分收集。Peak

9、-based 正、負斜率和閾值可預先設置。 當色譜信號都超出預先設置的正斜率和閾值兩個參數時，將觸發峰的收集信號； 當色譜信號低于閾值或低于預先設置的負斜率時，將觸發停止收集信號。 設置閾值的目的是為了消除噪聲的影響。第31頁/共68頁 利用正、負斜率按峰進行餾分收集。Peak-based第32頁/共68頁第32頁/共68頁Peak-based實例（只收集后面這一組分）第33頁/共68頁Peak-based實例（只收集后面這一組分）第33頁/共6基于質量（Mass-based） 根據餾分的質量作為指令參數，觸發餾分收集器。特點： 餾分純度高、且收益高； 餾分保留時間以及色譜峰峰形改變都不會影響

10、到餾分的純度； 參數設置方便； 需配備MS檢測器，設備費用投入較大。第34頁/共68頁基于質量（Mass-based） 根據餾分的質Mass-based 當使用按質量進行餾分收集時，只有當MSD檢測到色譜峰含有目標質量數，且該目標質量數的強度超出特定的閾值時，餾分收集才被觸發。這就確保了在每次進樣中只收集含目標化合物的餾分。大部分情況下只有一個餾分。 不足之處是注入的其他樣品組分不能回收。第35頁/共68頁Mass-based 當使用按質量進行餾分收集按質量數進行餾分收集的結果第36頁/共68頁按質量數進行餾分收集的結果第36頁/共68頁三種餾分收集方式的比較X-Based餾分純度餾分收益Ti

11、me不高高Peak高不高Mass高高第37頁/共68頁三種餾分收集方式的比較X-Based餾分純度餾分收益Time它們與純度、產量和收益（PTY）的關系怎樣？結合實際需求合理選擇。三種餾分收集方式如何選擇？第38頁/共68頁它們與純度、產量和收益（PTY）的關系怎樣？結合實際需求合理第39頁/共68頁第39頁/共68頁第40頁/共68頁第40頁/共68頁第41頁/共68頁第41頁/共68頁第42頁/共68頁第42頁/共68頁第43頁/共68頁第43頁/共68頁高效制備液相色譜流路示意圖第44頁/共68頁高效制備液相色譜流路示意圖第44頁/共68頁1、延遲體積校正2、擴散影響兩個問題：第45頁/

12、共68頁1、延遲體積校正2、擴散影響兩個問題：第45頁/共68頁什么是延遲體積？ 理想情況下，當檢測器檢測到組分信號時，同一時刻，組分也被餾分收集器收集到。 實際情況下，這是做不到的，因為存在一個延遲體積。 延遲體積：檢測池到餾分收集器之間管路的體積。第46頁/共68頁什么是延遲體積？ 理想情況下，當檢測器檢測到高效制備液相色譜流路示意圖第47頁/共68頁高效制備液相色譜流路示意圖第47頁/共68頁延遲體積校正 后運行時間：是指分析物組分從檢測池到餾分收集器所用的時間。 為了準確地觸發餾分收集器的啟動和停止，必須測定后運行時間。后運行時間可以轉換成與流速無關的延遲體積。 后運行時間測定方法之一

13、： 通過在流路內注射一種染料，當餾分收集器針尖出現該染料時記錄時間。 后運行時間t餾分收集器- t檢測器第48頁/共68頁延遲體積校正 后運行時間：是指分析物組分從檢測 后運行時間測定方法之二： 在餾分收集器內裝入一個檢測器，該檢測器稱為延遲傳感器。將延遲校正物注入流路，兩個檢測器都記錄信號。兩個檢測器之間的時間差就是后運行時間。 根據校正時所用的流速，系統將自動計算出準確的延遲體積，并保存，同時也能計算出每個流速下的后運行時間，當流速改變時，不需要再校正后運行時間。第49頁/共68頁 后運行時間測定方法之二：第49頁/共68頁擴散 擴散使峰（譜帶）變寬 ，嚴重削弱了色譜的分辨（分離）能力。 譜帶變寬與流速成反比，與管線長度和管線內徑成正比。第50頁/共68頁擴散 擴散使峰（譜帶）變寬 ，嚴重削弱了色譜的三種不同管徑的擴散影響 所以，制備液相色譜中更應注意縮短管路的長度，減少不必要的死體積。第51頁/共68頁三種不同管徑的擴散影響 所以，制備液相色譜中更各種類型的制備液相展示第52頁/共68頁各種類型的制備液相展示第52頁/共68頁第53頁/共68頁第53頁/共68頁第54頁/共68頁第54頁/共68頁第55頁/共68頁第55頁/共68頁第56頁/共68頁第56頁/共68頁第57頁/共68頁第57頁/共68頁應用實例：第58頁