1、從基礎到最新應用先端科學事業推進部 技術中心北京經濟技術開發區景園北街2號BDA國際企業大道31號(100176)TEL： FAX：資色譜知識講座1新的通用型檢測器是什么檢測器（Nano Quantity Analyte Detector）納克級（水凝粒子）激光計數檢測器一般來說，選澤性和靈敏度是檢測器最重要的兩個要素。NQAD是通用型、高靈敏度檢測器，適用于幾乎所有物質（揮發性物質除外）的檢測。 FL ECDUV (PDA)MS適用于：1) 沒有紫外吸收的物質2) 離子化比較難的物質3) 沒有電化學活性的物質4) 性質不明的物質等能夠檢測所有不揮發性及半揮發性物質ng級的高靈敏度從ng到g，

2、寬的動態響應范圍使用干燥空氣，更加環保操作簡便、外觀設計更加緊湊2的檢測原理検出凝縮噴霧汽化使用空氣（或氮氣）通過霧化器進行噴霧。流動相和其他揮發性成分在蒸發器中汽化剩下的不揮發、難揮發物質顆粒進入到WCPC。在水蒸氣飽和環境下，以該顆粒為核，水分凝聚體生成，并長大到微米水平。激光計數器計數水分凝聚體。核物質的性質對靈敏度影響不大，信號響應基本只與質量濃度相關。（Water-based Condensation Particle Counter）（水凝聚粒子計數器）3摩爾濃度 0.05 mmol/mL質量濃度 10 mg/mL甘氨酸精氨酸甘氨酸精氨酸 甘氨酸 （分子量 76） 精氨酸 （分子量

3、 175）摩爾濃度0.05 mmol/L質量濃度10 mg/mLMinutes2.02.53.03.54.0mVolts0204060Minutes2.02.53.03.54.00204060摩爾濃度0.05 mmol/L質量濃度10 mg/mL峰面積隨分子量增加而增大與分子量無關，峰面積幾乎不變峰面積與濃度的關系4檢測凝結噴霧汽化檢測荷電噴霧汽化檢測噴霧汽化激光電散射與同類（氣溶膠型）檢測器的比較-原理直接計數粒子CAD檢測粒子的電荷量（電霧式檢測器）ELSD檢測粒子造成的光散射量（蒸發光散射檢測器）5與同類檢測器的性能比較 NQAD v.s. ELSD1 = Lauric Acid, (月

4、桂酸)2 = Palmitic Acid （棕櫚酸）3 = Stearic Acid （硬脂酸）4 = Arachidic Acid （花生四烯酸）靈敏度：NQAD的靈敏度較ELSD高12個數量級 線性 ：NQAD基本可達線性響應(y=kx+b)；ELSD對數線性響應(y=klgx+b)重現（穩定）性：NQAD的粒子擴大效應帶來重現性和穩定性的大幅提高6與同類檢測器的性能比較 NQAD v.s. CADVS7Application 堿性化合物、酸性化合物 高分子（多糖：分子量103106） 蛋白多肽（分子量103105） 糖蛋白 生物樣品 親水性化合物（單糖，二糖，糖醇） 和LC-MS/MS的

5、比較8堿性化合物【min】HPLC ConditionsColumn: CAPCELL AK C18 MGIII S5 ; 4.6 mm i.d. x 150 mmM.Phase: 20 mmol/L HCOONH4，0.1vol% HCOOH / CH3OH = 50 / 50 Flow rate: 1.0 mL/minTemp.: 40 Detector: NQAD 5600 (Evap. 35，Neb. 30）Inj.vol.: 10 mLSample: 100 ng each.普魯卡因奎寧地芬尼多維拉帕米地布卡因1. 普魯卡因2. 奎寧3. 地芬尼多4. 維拉帕米5. 地布卡因 約CV

6、15%峰面積的響應檢出下限 （LOD）： 1.55 ng標準曲線的相關系數 （） ： 0.9900.999 (0.15 mg)0123456789101112131415161718192012345通過比較峰面積，可看出響應幾乎一定9酸性化合物低級脂肪酸HPLC ConditionsColumn: CAPCELL AK C18 MGIII S5 ; 4.6 mm i.d. x 150 mm M.Phase: 0.1vol% HCOOH / CH3OH = 90 / 10 Flow rate: 1.0 mL/minTemp.: 40 Detector: NQAD 5600 (Evap.35，N

7、eb.30）Inj.vol.: 10 mLSample: 500 ng each.500 ng each on column對小分子化合物展示了與UV相同的檢測能力。對于衣康酸，和UV相比，NQAD的靈敏度更高。1. 富馬酸2. 沒食子酸3. 衣康酸4. 對羥基苯甲酸5. 香草酸12345PDA(Max plot)衣康酸10對于GPC用標準物質（pullulan）的響應 (M.W.5800853000）高分子多糖分子量85萬以上時，響應有減少的趨勢111. 核糖核酸酶A(13.7 kDa)2. 細胞色素C(12.4 kDa)3. 溶菌酶(14.3 kDa)4. 牛血清白蛋白 (69.0 kDa

8、)5. 肌紅蛋白 (17.0 kDa)6. 卵清蛋白 (45.0 kDa)標準蛋白 （分子量萬）min024681012141618202224mV-50050100150200250300350400450Minutes024681012141618202224mAU-600-400-20002004006008001000HPLC ConditionsColumn: Proteonavi ; 4.6 mm i.d. x 150 mmM.Phase: A) 0.1 vol% TFA , B) CH3CN B 20% (0 min) 70% (25 min) 20% (25.1 min) 20

9、% (40 min) Flow rate: 1.0 mL/minTemp.: 40 Detector: NQAD5600, UV220nm Inj.vol.: 10 mLSample: 10 mg123456裝置構成：NQAD，PDA分別檢測PDA理論塔板數理論塔板數理論塔板數約2倍因為沒有樣品池容積這一概念使用NQAD，揮發性雜質消失檢測限約500 ng12多肽標準品PDAHPLC ConditionsColumn: Proteonavi ; 4.6 mm i.d. x 150 mmM.Phase: A) 0.1 vol% TFA , B) CH3CN B 15% (0 min) 30% (

10、20 min) 15% (20.1 min) 15% (35 min) Flow rate: 1.0 mL/minTemp.: 40 Detector: NQAD5600, UV220nm Inj.vol.: 10 mLSample: 100 ng each.裝置構成：NQAD+PDA串聯1234561. 蛋氨酸腦啡肽 (M.W.574)2. 緩激肽 (M.W.1064)3. 亮氨酸腦啡肽 (M.W.556)4. 血管緊縮素II (M.W.1046)5. 神經緊張素 (M.W.1673)6. 血管緊縮素I (M.W.1296)基線漂移的影響減少與PDA靈敏度相當100 ng each on c

11、olumnPDA漂移13多肽翻譯后修飾的識別 根據S/ N，統一了縱軸Minutes051015202530354045505560mV0500100015002000HPLC ConditionsColumn: Proteonavi ; 4.6 mm i.d. x 150 mmM.Phase: A) 0.1 vol% TFA , B) CH3CN B 10% (0 min) 50% (70 min) 10% (70.1 min) 10% (85 min) Flow rate: 1.0 mL/minTemp.: 40 Detector: NQAD5600, PDA 214nm Inj.vol.

12、: 10 mLSample: Fetuin Minutes051015202530354045505560mAU0500100015002000PDA糖蛋白的糖鏈部分UV吸收弱，使用NQAD比PDA靈敏度高 NQAD更容易識別糖蛋白裝置構成：NQAD+PDA串聯靈敏度改善胎球蛋白 （糖蛋白）的胰蛋白酶分解產物的PDA比較14HPLC ConditionsColumn: CAPCELL PAK MF Ph ; 4.6 mm i.d. x 100 mmM.Phase: 100 mmol/L HCOONH4 / CH3CN = 80 / 20Flow rate: 1.0 mL/minTemp.: 5

13、0 Detector: NQAD 5600 (Evap.50，Neb.30） Inj.vol.: 10 mLSample: Std. 50 mg/mL, (Carbamazepin, Fenitoin)生物樣品（血清）MF色譜柱在血清樣品中添加卡馬西平和苯妥英后直接進樣分析Minutes在流動相中添加高濃度鹽并使用MF色譜柱的分析條件下，也可以檢出Std. 500 ng each.血清Std.500 ng each.S/N 16S/N 1102468101214蛋白卡馬西平苯妥英15親水性化合物單糖二糖HPLC ConditionsColumn: Asahipak NH2P-40 3E 4 m

14、m ; 3.0 mm i.d. x 250 mm (Shodex）M.Phase: 2O / CH3CN = 20 / 80 Flow rate: 500 mL/minTemp.: 30 Detector: NQAD 5600 (Evap.35，Neb.30）Inj.vol.: 5 mLSample: 50 ng each.1. 鼠李糖2. 果糖3. 葡萄糖4. 蔗糖5. 麥芽糖一水化合物50 ng each on column檢出下限（LOD）： 2030 ng12345Glucose16Column： CAPCELL CORE AQ S2.7 ; 4.6 mm i.d. x 100 mmM

15、.phase： H2O / CH3CN = 85 / 15Flow rate： 1 mL/minTemp.： 40 Detector： NQAD 5600 (Evapo.45，Neb.30Filter 1.3s) Inj.vol.： 10 mLSample： H2ORI10 ng on column（S/N = 5）NQAD靈敏度約是RI的100倍SucraloseM.W. 397.63111000 ng on column（S/N = 5）三氯蔗糖（二糖）與RI的比較17HPLC ConditionsColumn: Asahipak NH2P-40 3E 4mm; 3.0 mm i.d. x

16、 250 mm (Shodex）M.Phase: 2O / CH3CN = 15 / 85 Flow rate: 500 mL/minTemp.: 30 Detector: NQAD 5600 (Evap.35，Neb.30）Inj.vol.: 5 mLSample: 50 ng each.123412.5 mg5 mg0.5 mg1. 赤蘚糖醇2. 木糖醇3. 山梨醇4. 甘露醇123450 ng each親水性化合物糖醇 檢出下限 510ng標準曲線的相關系數（） 0.9900.999 18Fig. 1 LC-MS/MS of pretreated serum samplespiked w

17、ith reserpine at 500 ng/mLLC-MS/MSFig. 2 Signal response observed with NQADfor the same sample as that of Fig.1預計在日本質量分析綜合討論會發表可以作為LC-MS的輔助檢測器利血平 609195通過MSNQAD的并聯，容易把握基質和共存物質的影響利血平檢測出基質及共存物質19總結NQAD可以適用于幾乎所有不揮發及半揮發物質的檢測NQAD對揮發性物質無響應這一性質可以加以利用（蛋白、多肽的梯度分析）NQAD可以分析幾個ng的糖在把握樣品質量組成信息方面，和質譜儀可以相互補充。20P-1P

18、-2【HPLC條件】Column： CAPCELL PAK C18 MGIII S3 ; 2.0 mm i.d. 50 mmM.Phase： A) 0.1 vol% HCOOH, B) CH3CN B% 10%(0min)70%（3min)70%（4min)10%（4.1min）Flow rate： 0.4 mL/min Temp.： 50 Detector： NQAD 5600 (Evap.35 ，Neb.30 ，Filter OFF)Inj.Vol： 3 mL參考：梯度條件6種磺胺類B 10%B 70%Gradient curve梯度條件下，增加有機溶劑量，峰強和峰面積有增大的趨勢1.Sulfadiazine2.Sulf