1、時間分辨熒光免疫分析時間分辨熒光免疫分析時間分辨熒光免疫分析開展歷程1979年，可標記抗體的Eu3+-二酮體-EDTA1983年，建立時間分辨熒光免疫技術，用于測定HCG和磷酸酯酶A“鑭系元素時間分辨熒光分析技術及儀器的配套研究獲2003年度國家科技進步二等獎22021/1/12時間分辨熒光免疫分析時間分辨熒光免疫分析時間分辨熒光免疫分析開展歷程1979年，可標記抗體的Eu3+-二酮體-EDTA1983年，建立時間分辨熒光免疫技術，用于測定HCG和磷酸酯酶A“鑭系元素時間分辨熒光分析技術及儀器的配套研究獲2003年度國家科技進步二等獎2021/1/122開展歷程1979年，可標記抗體的Eu3+

2、-二酮體-EDT一、時間分辨熒光免疫分析特點2021/1/123一、時間分辨熒光免疫分析特點2021/1/1231.熒光衰減時間長鑭系元素熒光衰變時間2021/1/1241.熒光衰減時間長鑭系元素熒光衰變時間2021/1/124常見熒光物質熒光壽命熒光物質熒光壽命Eu3+714 s非特異性熒光背景1-10 ns人血清白蛋白4.1 ns人球蛋白、血紅蛋白3.0 ns細胞色素C3.5 nsFITC4.5 ns丹磺酰氯14 ns苯胺萘磺酸16 ns稀土螯合物104 -106 ns2021/1/125常見熒光物質熒光壽命熒光物質熒光壽命Eu3+714 s非特2. Stokes位移大 熒光物質激發波長發

3、射波長Stokes位移Eu-(-NTA)3340 nm613 nm273 nmSm-(-NTA)3340 nm600 nm260 nmTb-(PTA)3295 nm490/543 nm195/248 nmDy-(PTA)3295 nm573 nm278 nm2021/1/1262. Stokes位移大 熒光物質激發波長發射波長Stoke鑭系元素發射峰窄2021/1/127鑭系元素發射峰窄2021/1/127優點靈敏度高10-18mol/孔原子標記多標記技術2021/1/128優點2021/1/128二、時間分辨熒光免疫分析體系非均相時間分辨熒光免疫分析均相時間分辨熒光免疫分析2021/1/12

4、9二、時間分辨熒光免疫分析體系2021/1/129一非均相時間分辨熒光免疫分析時間分辨固相免疫分析解離增強熒光免疫分析酶放大免疫分析2021/1/1210一非均相時間分辨熒光免疫分析2021/1/12101.時間分辨固相免疫分析靈敏度一般不高2021/1/12111.時間分辨固相免疫分析靈敏度一般不高2021/1/1211實例加拿大Cyber Fluor的FIAgen系統Eu3+-BCPDA為標記物2021/1/1212實例2021/1/12122.解離增強分析原理示意圖2021/1/12132.解離增強分析原理示意圖2021/1/12131雙功能螯合劑EDTA衍生物、DTTA衍生物、DTPA

5、衍生物一端與鑭系離子螯合，一端與抗原/抗體連接近中性時，螯合物足夠穩定酸性條件下，鑭系離子迅速、徹底釋放Eu-DTTA應用最廣泛2021/1/12141雙功能螯合劑EDTA衍生物、DTTA衍生物、DTPA衍2增強液增強原理圖一般增強百萬倍2021/1/12152增強液增強原理圖2021/1/1215-NTA：Eu(-NTA)3(TOPO)2復合物TOPO：熒光增強協同劑Triton X-100：外表活性劑，形成膠束醋酸：酸性介質2021/1/1216-NTA：Eu(-NTA)3(TOPO)2復合物20213酶放大酶催化底物，生成的產物與溶液中鑭系離子、螯合劑生成熒光強、壽命長的三元復合物ALP

6、2021/1/12173酶放大酶催化底物，生成的產物與溶液中鑭系離子、螯合劑生酶放大免疫分析示意圖2021/1/1218酶放大免疫分析示意圖2021/1/1218雙標記測定AFP和-hCG-NTA作為螯合劑340 nm 激發，Eu:615 nm, 820 s；Sm:643 nm, 88 s2021/1/1219雙標記測定AFP和-hCG-NTA作為螯合劑2021/1二均相免疫分析基于時間分辨熒光共振能量轉移無需洗滌、別離、加增強液2021/1/1220二均相免疫分析2021/1/1220TBP-Eu：Eu3+-二吡啶二胺，最大發射615nm，供體APC：別藻藍蛋白，最大發射665nm，受體能量

7、轉移效率最高的供體/受體對2021/1/12212021/1/1221時間分辨熒光共振能量轉移免疫分析示意圖2021/1/1222時間分辨熒光共振能量轉移免疫分析示意圖2021/1/1222三、時間分辨免疫分析方法夾心法競爭法間接法捕獲法生物素-親和素放大法2021/1/1223三、時間分辨免疫分析方法夾心法2021/1/12231. 夾心法雙抗體夾心法2021/1/12241. 夾心法雙抗體夾心法2021/1/1224雙抗原夾心法2021/1/1225雙抗原夾心法2021/1/12252. 競爭法2021/1/12262. 競爭法2021/1/12263. 間接法間接法測定HCV抗體2021

8、/1/12273. 間接法間接法測定HCV抗體2021/1/12274. 捕獲法捕獲法測定抗-CMV IgM2021/1/12284. 捕獲法捕獲法測定抗-CMV IgM2021/1/125. 生物素-親和素法生物素-親和素檢測PAPP-A2021/1/12295. 生物素-親和素法生物素-親和素檢測PAPP-A2021四、應用1. 腫瘤標志物檢測2. 傳染病檢測3. 糖尿病檢測4. 激素檢測5. 細胞活性檢測2021/1/1230四、應用2021/1/12301.腫瘤標志物AFP測定：雙抗體夾心法固相包被抗體參加樣品或標準品參加Eu標記抗體參加增強液測定熒光靈敏度：0.17 U/ml2021

9、/1/12311.腫瘤標志物AFP測定：雙抗體夾心法2021/1/12312. 傳染病檢測梅毒螺旋體抗體檢測：雙抗原夾心法強陽性血清和正常人血清分別作為陰陽對照陰性對照、陽性對照和樣品參加板上，孵育參加銪標記抗原，孵育參加增強液，檢測熒光符合中國藥品生物制品鑒定所結果2021/1/12322. 傳染病檢測梅毒螺旋體抗體檢測：雙抗原夾心法2021/13.糖尿病檢測C-肽檢測：雙抗體夾心法抗體包被微孔板參加標準品或樣品參加銪標記抗體增強液，檢測熒光靈敏度：2021/1/12333.糖尿病檢測C-肽檢測：雙抗體夾心法2021/1/12334.激素檢測三碘甲狀腺原氨酸T3：競爭法微孔板中參加抗體標準品

10、或樣品、銪標記T3參加增強液，測定熒光靈敏度：2021/1/12344.激素檢測三碘甲狀腺原氨酸T3：競爭法2021/1/15.細胞活性檢測測定細胞活性原理圖T：靶細胞E：效應細胞2021/1/12355.細胞活性檢測測定細胞活性原理圖T：靶細胞2021/1/1NK細胞活性靶細胞：K562細胞參加EuCl3, DTPA, 硫酸葡聚糖，4C孵育 向靶細胞中參加效應細胞NK細胞，孵育，離心，測上清熒光計算比釋放率%2021/1/1236NK細胞活性靶細胞：K562細胞2021/1/1236謝謝謝謝內容總結時間分辨熒光免疫分析。1983年，建立時間分辨熒光免疫技術，用于測定HCG和磷酸酯酶A。“鑭系元素時間分辨熒光分析技術及儀器的配套研究獲2003