1、H松巨盹臼了 1幷干是為I魁怪合話前舟恥啟虐，E垛凰【話的盤格自I SD5-FAGE &TWSIU 下層肢h不同遙盧的d$_pge狩窗胺的曇桂好曲范因=5口占GE分蛋底般度50 150KD嚥底30-QtOkD20-BOO訛腹T2-60k315%藪注！如舷制菲匪性險 彗都肉菽宵彷，刃蔑肢申不加10%SDSPr可配融用冼怪FAftFfo.SDS勒膠的有效分離范闔丙烯聯胺濃度L512.5107.55,01乩上業ThZOkDaLfi-lcDa30-J20kDa60-212 kDa1.配膠緩沖液系統對電泳的影響？在SDS- PAG環連續電泳中，制膠緩沖液使用的是 Tris HCL緩沖系統，濃縮膠是，分離

2、膠； 而電泳緩沖液使用的 Tris -甘氨酸緩沖系統。在濃縮膠中，其pH環境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導電性較低的區帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。 由于導電性與電場強度成反比， 這一區帶便形成 了較高的電壓剃度， 壓著蛋白質分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區帶。 當樣品進入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后， 同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據其固有的帶電性和分子大小進行分離。所以，pH對整個反應體系的影響是至關重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解 決

3、問題的情況，應首要考慮該因素。2樣品如何處理？工根據樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原 SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。1）還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和 DTT （或 Beta巰基乙醇）后，蛋白質構象被解離，電荷被中和，形成 SDS與蛋白相結合的分子，在電泳中，只根據分子量來分離。一 般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min,再離心加樣。2）帶有烷基化作用的還原 SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經久牢固的保護SH基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的 DTT,而防止銀染時的紋

4、理現象。100ul 樣品緩沖液中10ul 20 %的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。3） 非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1 %SDS沸水中煮3min,未 加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。SDS電泳凝膠中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質電泳提供載體，其凝固的好壞直接關系到電泳成功與否，與促凝劑及環境密切相關；制膠緩沖液：濃縮膠選擇，分離膠選擇，選擇tris HCL系統，TEMED與 AP AP提供自由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的聚合反應進行；十二烷基硫酸鈉（SDS :陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質電荷、解離蛋

5、白質之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、 去多肽折疊。提高SDS電泳分辨率的途徑？聚丙烯酰胺的充分聚合， 可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導致凝固不充分，后者可導致SDS結晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的蛋白質電泳技術手冊P82-103。5“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現于較厚的凝膠中。 處理辦法：待其充分凝固再作后續實驗?！鞍櫭迹▋蛇呄蛳轮?/p>

6、間鼓起）形帶原因？ 主要出現在蛋白質垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。 處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。為什么帶出現拖尾現象？主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。處理辦法：加樣前離心；選擇適當的樣品緩沖液， 加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長， 重新配制；降低凝膠濃度。為什么帶出現紋理現象？ _ 主要是樣品不溶性顆粒引起的。處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。什么是“鬼帶”，如何處理？“鬼帶”就是在跑大分子構象復雜的蛋白質分子時，常會出現在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失

7、去活性，致使原來被解離的蛋白質分子重新折疊結合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻于目標條帶有相同的免疫學活性，在WB反應中可見其能與目標條帶對應的抗體作用。處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。為什么溴酚藍不能起到指示作用？ 2我們在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出板底，但蛋白質卻還未跑下來的現象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關。處理辦法：更換正確 pH值的Buffer ;降低分離膠的濃度。為什么電泳的條帶很粗？電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。處理辦法：適當

8、增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確（）；適當降低電壓；為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？這種現象一般初學者易出現。 比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽 沒有正確裝配，電流未形成通路。包括： a.內外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕 緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。處理辦法：電泳槽正確裝配即可。濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎？這主要出現在初學者中， 一般對電泳不會有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進入引起的。凝膠時間不對，或慢或快，怎么回事？通常膠在30MIN-1H內凝。如果凝的太慢，可能是 TEMED APS劑量不夠或者失效。APS應該 現配現用，T