1、11 重組DNA技術11.1 重組DNA技術是基因工程的核心技術11.2 獲得需要的目的基因（外源基因）11.3 構建重組質粒和基因克隆11.4 轉化受體細胞和轉化子的篩選11.5 轉化子的分析Southern雜交11 重組DNA技術11.1 重組DNA技術是基因工重組DNA技術的重大突破帶動了現代生物技術的興起，并很快產生了許多生命科學的高技術產業。重組DNA技術，又稱為基因或分子克隆技術，是基因工程的核心技術。該技術包括了一系列的分子生物學操作步驟。所謂基因工程(genetic engineering)就是有意識地把一個生物體中有用的目的基因轉入另一個生物體中，使后者獲得新的遺傳性狀或表達

2、所需要的產物。11.1 重組DNA技術是基因工程的核心技術重組DNA技術的重大突破帶動了現代生物技術的興起，并很快產生重組DNA操作一般步驟：（1）獲得目的基因；（2）與克隆載體連接，形成新的重組DNA分子；（3）用重組DNA分子轉化受體細胞，并能在受體細胞中復制和遺傳；（4）對轉化子篩選和鑒定；（5）對獲得外源基因的細胞或生物體通過培養，獲得所需的遺傳性狀或表達出所需要的產物。重組DNA操作一般步驟：（1）獲得目的基因；獲得需要的目的基因常用的方法：（1）直接從生物體中提取總DNA，構建基因文庫(gene library)，從中調用目的基因；（2）以mRNA為模板，反轉錄合成互補的DNA片段

3、；（3）利用聚合酶鏈式反應（PCR）特異性地擴增所需要的目的基因片段，等等。11.2 獲得需要的目的基因（外源基因）獲得需要的目的基因常用的方法：11.2 獲得需要的目的基因（ 細胞內總DNA的提取分離與基因文庫的構建 細胞內總DNA的提取分離程序 細胞內總DNA的提取分離與基因文庫的構建 細胞內總DN 紫外分光光度計測定DNA溶液的純度和濃度。 紫外分光光度計測定DNA溶液的純度和濃度。 基因文庫的構建將總DNA包含的基因組各片段分別克隆在質粒或噬菌體載體上，便構成了該生物的基因文庫。 基因文庫的構建 反轉錄人工合成互補DNA構建基因文庫獲取目的基因存在的問題費時費事內含子序列反轉錄人工合成

4、互補DNA方法的優勢獲取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因 反轉錄人工合成互補DNA構建基因文庫獲取目的基因存在的問 聚合酶鏈式反應（PCR）PCR技術就是在體外中通過酶促反應有選擇地大量擴增（包括分離）一段目的基因的技術。加入4種物質： （1）作為模板的DNA序列；（2）與被分離的目的基因兩條鏈 各自5端序列相互補的DNA引物（20個左右堿基的短DNA單鏈）；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。 聚合酶鏈式反應（PCR）PCR技術就是在體外中通過酶促反 聚合酶鏈式反應（PCR）變性、退火、延伸三步曲變性：雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退

5、火：部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結合延伸：以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈 聚合酶鏈式反應（PCR）變性、退火、延伸三步曲變性：雙鏈 聚合酶鏈式反應（PCR）每一輪聚合酶鏈式反應可使目的基因片段增加一倍30輪循環可獲得 230（1.07109)個基因片段 聚合酶鏈式反應（PCR）每一輪聚合酶鏈式反應可使目的基因 PCR技術的發明PCR的發明是DNA操作技術的革命美國Mullis教授 開汽車時的聯想 逶迤崎嶇的山路DNA雙螺旋 行駛的汽車一小段DNA引物 1988年發明了PCR技術 1993年獲得諾貝爾獎 PCR技術的發明PCR的發明是DNA操作技術的革命 逶迤基因重組

6、和克隆操作最重要的工具是限制性內切酶、載體和宿主菌。微量的目的基因必須經過基因克隆獲得大量的拷貝后，才能實現進一步的重組、轉化和表達等操作。11.3 構建重組質粒和基因克隆 限制性內切酶限制性內切酶是從細菌中分離提純的核酸內切酶，可以識別并切開核酸序列特定位點分子手術刀Arber、Smith和Nathans因為在發現限制性內切酶方面開創性工作而共同獲得了1978年的諾貝爾獎。基因重組和克隆操作最重要的工具是限制性內切酶、載體和宿主菌。 限制性內切酶已經發現和鑒定了200多種EcoRI特異識別GAATTC及其互補堿基組成的雙鏈片段粘性末端T4連接酶 限制性內切酶已經發現和鑒定了200多種EcoR

7、I特異識別 載體載體是運送目的基因片段進入宿主細胞的工具，目前最常用的載體包括細菌質粒、l噬菌體、cosmid質粒等。質粒是細菌細胞中自然存在于染色體外可以自主復制的一段環狀DNA分子。進入到宿主細胞中的一個質粒可以大量增加其拷貝數。 載體載體是運送目的基因片段進入宿主細胞的工具，目前最常用1該質粒比較小，可以插入一段較長的DNA片段。2進入宿主細菌細胞后，pUC18在每個細胞中可復制形成大約500個拷貝。3在pUC18中有一小段人為設計和插入的具有多種限制性酶切位點的序列，即多克隆位點 細菌質粒pUC181該質粒比較小，可以插入一段較長的DNA片段。 細菌質粒p pUC118質粒的多克隆位點

8、整合在lacZ基因中，該位點如果沒有插入外源目的基因，lacZ基因便可表達出半乳糖苷酶，如果平板培養基中含有IPTG和X-gal，X-gal便會被半乳糖苷酶水解成蘭色，大腸桿菌形成藍色克隆。 在多克隆位點插入外源目的基因，破壞了lacZ基因的結構，大腸桿菌形成白色的克隆4利用lacZ基因的插入失活篩選重組質粒5pUC18還攜帶了氨卞青霉素抗性基因，可篩選重組質粒。 pUC118質粒的多克隆位點整合在lacZ 以大腸桿菌為宿主菌進行基因的克隆將目的基因克隆到大腸桿菌細胞中的操作步驟：1獲得目的基因和質粒載體；2形成重組質粒；3制備感受態細胞，用重組質粒轉化大腸桿菌細胞；4培養大腸桿菌，讓重組質粒

9、及外源目的基因形成大量拷貝；5篩選含重組質粒的大腸桿菌細胞，進行檢查或鑒定。 以大腸桿菌為宿主菌進行基因的克隆將目的基因克隆到大腸桿 一般克隆基因的檢查和鑒定方法瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定大小不等的酶解片段：磷酸基團帶負電荷酶解片段向陽極移動電場驅動力和凝膠阻力 不同遷移率分子量標準參照物 酶切和電泳方法 一般克隆基因的檢查和鑒定方法瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定大小32P標記的DNA分子探針雜交放射自顯影法 DNA雜交直接鑒定32P標記的DNA分子探針 DNA雜交直接鑒定基因克隆獲得大量目的基因后，就要使其在合適的宿主細胞中表達，產生需要的基因表達產物或使宿主生物具備所需的性狀，同時目的基因還能在宿主細

10、胞中穩定遺傳。這一過程就是遺傳轉化。若需要讓克隆的基因表達和產生大量編碼蛋白，可對轉化的大腸桿菌進行培養使目的基因大量表達和積累。對表達產物分離純化便可獲得想要的產品。通過DNA體外重組技術構建的重組質粒還可以直接用以轉化藍藻等原核生物或其他一些原生生物11.4 轉化受體細胞和轉化子的篩選基因克隆獲得大量目的基因后，就要使其在合適的宿主細胞中表達，構建缺失chlL基因的藍細菌突變株構建缺失chlL基因的藍細菌突變株遺傳轉化常用的方法載體法轉化農桿菌介導法基因的直接轉移（1）高壓電脈沖電激穿孔（2）基因槍法（3）微注射法遺傳轉化常用的方法載體法轉化農桿菌介導法紀念發明者Edward Southe

11、rn（1）提取總DNA（2）酶解（3）電泳（4）轉移到濾膜（5）變性解鏈（6）DNA探針及雜交（7）洗脫（8）放射自顯影（9）比較分析11.5 轉化子的分析Southern雜交紀念發明者Edward Southern11.5 轉化子的分Southern雜交分析示例 A. DNA體外重組實驗 B. 抗生素篩選轉化子細胞 C. 培養突變株細胞 D. Southern雜交實驗結果顯示，外源目的基因已經轉入突變株細胞中1973年，由美國斯坦福大學教授Cohn和美國加州大學教授Boyer帶領各自的研究組幾乎同時分別完成了DNA體外重組，一舉打開了基因工程學大門。Southern雜交分析示例 A. DNA體外重組實驗197重組DNA技術的一般操作步驟有：(1)獲得目的基因；(2)構建重組質粒；(3)轉化受體細胞；(4)篩選和鑒定轉化子；(5)培養轉化細胞獲得所需性狀或所需產物。 獲得目的基因的方法有：提取總DNA構建基因文庫并從中調用；以mRNA為模板合成互補DNA片段；利用PCR特異性擴增所需目的基因片段等。用紫外分光光度計測定DNA溶液的純度和濃度。 用限制性內切酶識別并切開核酸序列特定位點，將外源基因插入到載體中，用重組載體轉化宿主細胞，外源基因將隨宿主的繁殖而復制，這種過程稱為基因的克隆。 凝膠電