1、rimer5Oligo的引物設計、使用方法吳乃虎的基因工程原理一、引物設計 step by step1NCBI CDS 選項中，找到編碼區所在位置，在origin 該編碼序列作為軟件查詢序列的候選對象。2、用 Primer Premier5 搜索引物打開 Primer Premier5，點擊 File-New-DNA sequence, 出現輸入序列窗口，Copy 目的序列在輸入框內（選擇 As），此窗口內，序列也可以直接翻譯成蛋白。點擊 Primer，進入引物窗口。此窗口可以鏈接到“引物搜索”、“”以及“”Search按鈕，進入引物搜索框，選擇“PCR primers”，“Pairs”Sea

2、rchParameters 200bp的產物電泳跑得較散，所以可以選擇 點擊 OK，軟件即開始自動搜索引物，搜索完成后，會自動跳出結果窗口，搜索結果默認按照評分（Rating）“引物窗口”引物和下游引物的序列和位置，引物的各種信息等。對于引物的序列，可以簡單查看一下，避免出現下列情況： 3不要出現連續的 3 個堿基相連的情況，比如GGG CCC5570 度之間，GC應該在 4555間，上游引物和下游引物的 Tm值最好不要相差太多，大概在 2 度以下較好。該若按鈕顯示為紅色，表示存在該二級結構，點擊該紅色按鈕，即可看到相應二級結構位置圖示。最理想的 “None”為好。但有時很難找到各個條件都滿足

3、的引物，所以要求可以適當放寬，比如引物存在錯配的話，可以就具體情況考察該錯配的效率如何，是否 Oligo自身雖然帶有引物搜索功能， Primer5.Primer5 窗口中，若覺得某一對引物合適，可以在搜索結果窗口中，點擊該引物，然后在菜單File-Print-Current pairPDF Pdf 文檔，里面有該引物的詳細信息。3、用 Oligo 驗證評估引物Oligo 軟件界面，File OpencDNA 序列（primer 中，該序列已Seq 文件），Internal Stability（Delta Tm窗口。Tm 窗口中，點擊最左下角的按鈕，會出來引物定位對話框，輸入候選的上游引物序列位

4、置（Primer5 已經給出）Changeoligo length T m Upper Lower 按鈕，確定下游引物。Analyze 菜單中各種強大的引物分析功能了。Analyze 中，第一項為Key info，點擊Selected primers，會給出兩條引物的概括性信息，其中包括引物的 Tm 值，此值 Oligo 是采用 nearest neighbor method 計算，會比 Primer5 中引物的 TmDelta G 3Delta Delta G DNA 9。Analyze 中第二項為 Duplex Formation，即二聚體形成分析，可以選擇上游引物或下游引物，分Upper

5、/Lower ，即上下游引物之PCRDelta G4.5kcal3 Oligo 3D elta G 值。Analyze Hairpin G 3 個。Analyze 中第四項為Composition and Tm，會給出上游引物、下游引物和產物的各個堿基的組成比例Tm值。上下游引物的GC4060GCTm3nearest neighbor methodGC method和2(A，最后一種應該是Primer5所采用的方法，Tm5070度之間。False Priming SitesPrimer5 False priming 分析，但不oligo oligo 100 以下， 000 幅度若不大的話，也可

6、以接受。e “PCRPCRaryRDelta G值偏大的話，Oligo在最后的評價中會注明，若沒有注明此項，表明二級結構能值較小，基本可以接受。FilePrint，打印為PDF Oligo 軟件中已經打開的窗口所包括的信息，多達數頁。因此，打印前最好關掉TmDelta G 窗口，可以保留引物信息窗口、二級結構分析窗口（若存在可疑的異常的話）PCR 窗口。4、引物確定后，對于上游和下游引物分別進行Blast 分析，一般來說，多少都會找到一些其他基因的同源序列，此時，可以對上游引物和下游引物的 blast 結果進行對比分析，只要沒有交叉的其他基因的同源序列就可以。二、引物設計過程中的心得1、Pri

7、mer 5.0 搜索引物Primer Length 我常設置在 1830bp,短了特異性不好，長了沒有必要。當然有特殊要求的除外， 如加個酶切位點什么的。PCR Product size 最好是100100bp PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳出來， 條帶很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。Search parameters Manual 吧，Search stringency High，GC 4060。其它參數默認就可以了。Rating Oligo 軟件里評估。當然，搜索出的引物，其擴增產物3 端2 A T,G C 3 端2 G 或C，這樣的引物應作為次選，沒得選了就選它。對于這樣的引物，如

8、果其它各項指標還可以，我喜歡在引物末端去掉一個不滿意的或加上一個堿基，看看引物的評估參數有沒有變好點。2、Oligo 6.0 評估引物在 analyze 里，Duplex Formation 不管是上游引物、下游引物還是上下游引物之間，The most stable 3-Dimer 4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall 絕對值一般應小kcal/mol PCR PCR 65的時候，The most st able Dimer overall 6.7kcal/mol 沒有問題。Hairpin Formation 根據黃金法則False priming sites: Primer priming efficiency 4 好。PCR optimal annealing temperature P CR 2 的范圍就可以了。Internal stability 很重要：我們希望引物的內部穩定性是中間高、兩邊低的弧形，最起碼保證3 3 解：把一滴水放到大海里，這滴水就會不停的擴散分布，擴散的越厲害越穩定，所以G 絕對值越大結構越穩定。3、其他oligo 出來的引物，一般按效率排oligo oligo 里，退火溫度也不一樣。350的退火溫度肯定和65對二聚體的影響不一樣了，一般來講盡量控制在4.5kcal/mol以下（丁香園戰