1、載體的選擇與構建第1頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三主要內容1.細菌質粒載體2.噬菌體載體3.酵母細胞載體及大容量載體4.動、植物載體第2頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三基因工程載體： 攜帶外源目的基因或DNA片段進入宿主細胞進行復制和表達的工具。載體的一般特性：在宿主中能自我復制或借助宿主染色體進行復制容易從宿主細胞中分離純化具有容納外源DNA分子的能力有限制性內切酶位點，便于基因組裝有對載體進行篩選的標記或報告基因第3頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三1.1 質粒的定義質粒是染雜色體外能進行自主復制的遺傳單位，由J

2、.萊德伯格在1952年提出。共生生物、真核生物的細胞器DNA和細菌染色體以外的單純的DNA分子某些既能獨立地存在于細胞質中又能整合在染色體上的質粒稱為附加體。酵母的殺傷質粒(killerplasmid)已知是RNA分子。 1. 質粒載體1.2 質粒的分類1.2.1 按照復制性質： 嚴緊型質粒:帶有與分配有關的基因，由DNA聚合酶復制，當細胞染色體復制一次時，質粒也復制一次，12個/細胞； 松弛型質粒:由DNA聚合酶復制，當染色體復制停止后仍然能繼續復制，數十數百個/細胞一般分子量較大的質粒屬嚴緊型。分子量較小的質粒屬松弛型。質粒的復制有時和它們的宿主細胞有關，例如某些質粒在大腸桿菌內的復制屬嚴

3、緊型，而在變形桿菌內則屬松弛型。第4頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三1.2.2 按照構型： 環形雙鏈DNA分子 共價閉合環狀：兩條鏈都保持完整的環狀結構，通常呈超螺旋構型 開環DNA：一條保持完整的環狀結構，另一條單鏈上有一到幾個切口 線狀DNA：這種質粒的雙鏈斷裂，由環狀變為呈線狀這三種構型的同一種質粒在瓊脂糖凝膠中電泳時，出現不同的遷移速率，超螺旋構型最快，其次是線性構型，開環構型最慢。 線性質粒 發卡線性質粒：在兩端均有反向重復序列，形成共價閉合的發卡環 多肽結合質粒：5端與多肽連接，同時兩末端還具有反向重復序列，多為放線菌質粒這些結構可以防止質粒被降解1.2.

4、3 按照接合能力: 接合型質粒（F質粒） 非接合型質粒 第5頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三1.2.4 按照宿主范圍: 廣宿主質粒（以及穿梭質粒） 單一宿主質粒 1.2.5 按照宿主中的存在形式: 游離型質粒 整合型質粒（復制子不能被宿主識別，帶有同源片段） 1.2.6 按照功能： 基因克隆質粒（篩選系統，MCS） 基因表達質粒(篩選系統，MCS，啟動子，RBS，融合tag） 基因敲除質粒（篩選系統，目的基因的同源片段） 輔助性質粒（例如提供位點特異性重組酶） 第6頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三1.3 質粒的復制1.3.1 復制子(repl

5、icon)包括復制起點(ori)、復制控制元件、復制蛋白編碼基因的遺傳單元 質粒一般只帶有少量復制需要的基因，其它由宿主提供。 廣宿主質粒一般攜帶復制所需的所有或大部分基因，而且啟動子、RBS位點都可以被多種宿主識別。 質粒中除了復制子之外的序列都不是必須序列，可以用其它序列替換來進行基因克隆或表達。pMB1, colE1 replicon 拷貝數1520 宿主范圍?。耗c細菌修飾的pMB1 replicon 拷貝數500700 宿主范圍小：腸細菌（pUC系列)pSC101 replicon 拷貝數5 宿主范圍廣 多種革蘭氏陰性菌pUB110 50 廣 多種革蘭氏陽性菌pE194 5 廣 多種革

6、蘭氏陽性菌第7頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三1.3.2 拷貝數控制機理反義RNA對拷貝數的調控colE1 repliconRNAII被RNaseH切割后充當復制引物鏈（前導鏈的引物），而RNAI與其結合后阻止RNaseH的切割質粒編碼的Rop蛋白二聚體可提高兩種RNA結合復合物的穩定性質?？截悢翟礁?， Rop、 RNAI濃度越大，最終終止復制細胞分裂后，Rop及RNAI濃度變小，開始進行復制第8頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三RepA 調控Iterons are directly repeated sequences（1722bp) whi

7、ch play an important role in regulation of plasmid copy number in bacterial cells （重復子）Ori附近的repA基因編碼RepA蛋白，其對自身的表達具有負調節作用RepA蛋白可以和Iterons結合，促進復制復合物的形成，從而開始質粒的復制質粒拷貝數高時， RepA蛋白濃度高，形成二聚體，兩個質粒聚集連在一起，復制停止。細胞分裂后重新復制pSC101 replicon第9頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三1.4 質粒的不穩定性 分離不穩定性：在細胞分裂過程中，有一個子細胞沒有獲得質粒 DN

8、拷貝，并最終增殖成為無質粒的優勢群體； 結構不穩定性：由轉位作用和重組作用所引起的質粒DNA的重排與缺失 質粒的分配方式：主動分配 平均分配:每個子細胞剛好獲得一半數目的質粒拷貝 配對位點分配:只有一對質粒呈主動分配，其余的是隨機分配。 主動分配存在著有效的質粒拷貝數控制系統，從而保證了質粒的高度穩定性隨機分配 分配不穩定，部分子細胞沒有質粒，并在生長過程中具有優勢而逐漸使含質粒細胞比例越來越少 第10頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三第11頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三質粒上的par區段編碼分配蛋白，質粒上還有par蛋白的結合序列（inc區

9、）負超螺旋密度的增加可以使質粒分配更穩定，par 區可以增加負超螺旋密度，DNA促旋酶則降低分配穩定性。(partition region）第12頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三質粒多聚體也導致分配不穩定： 質粒多聚體含有多個復制起點，其復制速度是單體的數倍，將導致大量細胞只含有多聚體質粒而影響分配穩定性有的質粒具有宿主致死功能，殺死丟失質粒的細胞，如F質粒的ccdA(編碼解毒劑）,ccdB（編碼毒性蛋白）第13頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三 用同一復制系統的兩種質粒會在復制和隨后向子細胞的分配過程中彼此竟爭，這樣的質粒在同一個細胞中不能和

10、平共處。這種現象稱之為不相容性1.5 質粒的不相容性若兩種質?？截悢挡灰粯?，分配有利于高拷貝數質粒不相容群指那些具有不相容性的質粒組成的一個群體，一般具有相同的復制子 第14頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三 細菌種類 質粒不相容群 代表性質粒 革蘭氏陰性細菌IncFF, R386, R455, ColVIncFR1, R100IncFCol1B-K98IncFR124IncARA1IncCR40a, R55IncHR27, R726IncIColIb-P9, R144, R483, R64, R621aIncMR69, R466bIncNR46, R15, N3, p

11、KM101IncOR16, R723IncPRP1, RP4, R68, R751, R690, RK2IncQRSF1010, pKT212, pKT230, pGSSIncWR7K, R388, pSA747IncXR6K 革蘭氏陽性細菌pT181pT181, pC221, pS194, pC223, pUB112, pE194pUB110pBC110, pBC16pSN2pSN2, pE12, pIM13第15頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三（1）型復制 單向復制 雙向復制革蘭氏陰性細菌中多數質粒是以型方式復制，R1，R100等是單向復制，F，R6k等是雙向復制

12、類型。1.6 質粒的復制方式第16頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三在革蘭氏陽性細菌中大多數質粒是以滾環方式復制，如pC194, pE194等，這種方式會造成質粒結構的不穩定，存在大量的單鏈質粒DNA（2）滾環復制 第17頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三質粒轉移性：是指質粒能自動地從一個細胞轉移到另一個細胞，甚至還能帶動供體細胞的染色體DNA向受體細胞轉移。質粒在細菌間的轉移，需要供體和受體細胞間的直接接觸才能進行，即接合作用(conjugation)，這類質粒被稱為自主轉移質粒(self-transmissible plasmid)或接合質粒

13、(conjugative plasmid)。有些質粒雖然不能自主轉移，但能被其他一些自主轉移質粒所轉移，這類質粒又被叫做可移動質粒(mobilizable plasmid)，可以借助這種方式將重組質粒導入難于轉化的宿主中。1.7 質粒的轉移性第18頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三質粒拷貝數轉移性質?？截悢缔D移性ColE110-18不能R6k1-2能ColE210-18不能RP44-7能ColE310-18不能pBR322約20不能F 因子1-2能pBR325約20不能R1001-2能E.coli 質粒的轉移性第19頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星

14、期三 G-菌中質粒分子量較大，而G+菌中質粒較?。?已知大腸桿菌的F質粒、R1、R100、ColV、Collb-P9、 R6k、RP4等均屬于自主轉移質粒，它們是低拷貝的大質粒，其中較小的R6k質粒也有38kb。 G+細菌如鏈霉菌中的自主轉移質粒，除SCPl是巨大質粒外，很多都是10kb左右的小質粒，而與轉移有關的區域只有2kb左右。 自主轉移質粒的大小差異可能是因為它們的轉移機制不同，G+細菌中質粒的轉移不需要性菌毛，因此質粒分子量較小。（1）自主轉移質粒的特點第20頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三大多數自主轉移質粒都有tra基因和oriT位點，它們在質粒自主轉移過

15、程中起著重要作用。 自主轉移質粒能誘導含有與自己相同或相似的oriT位點的非自主轉移質粒進行轉移，如將自主轉移質粒整合到染色體上后，帶動染色體轉移也是從質粒的oriT位點開始的。 tra基因：大多數tra基因的產物與性菌毛的形成(F、RP4和pKMl01都編碼一根性菌毛)、雜交對的形成有關；有些tra基因編碼作用于oriT位點的內切酶，使質粒中的一條DNA鏈產生切口，從而開始轉移；有些tra基因則與質粒轉移調控等有關。 oriT位點：oriT位點不僅是質粒轉移的起始位點，也是質粒轉移后DNA末端再環化的位點，因此質粒必須具有oriT位點才能進行自主轉移。第21頁，共134頁，2022年，5月2

16、0日，18點5分，星期三（2） 可移動質粒的特點 不能在菌株間形成接合通道：G-細菌中可移動質粒缺少與性菌毛合成有關的基因(約10個左右) 。因此，在進行轉移時，必須利用位于同一細胞內的自主轉移質粒編碼合成的性菌毛才能進行。具有特殊的轉移起始位點和切割功能基因：如ColEl具有獨特的bom位點和負責DNA轉移的mob基因。ColEl的bom位點類似于F質粒的oriT。mob基因的功能類似于tra基因，mob基因也能編碼特異的核酸內切酶，在bom位點進行切割，但沒有編碼性菌毛的tra基因，所以它不能自主轉移。第22頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三F質粒誘動ColEl轉移

17、的模型圖 mob產物bomF- mobF+ mob bomF+ mob-F+ mob+ bom-不能轉移性菌毛轉移不能轉移不能轉移F質粒第23頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三1.8 報告基因抗生素抗性基因： kan, cat, bla, spc, em, tet 等組織化學顯色基因： E. coli lacZ ， -galactosidase（半乳糖苷酶） E. coli gusA（uidA) ， -glucuronidase (GUS，葡萄糖苷醛酸酶）熒光蛋白基因： rfp，gfp，.熒光素酶基因：luc 熒光素酶在氧化底物熒光素（luciferin）的過程中，會發

18、出生物熒光，可以通過熒光測定儀或液閃儀測定熒光強度?？梢詷O其靈敏、高效地檢測基因的表達。是檢測轉錄因子與目的基因啟動子區DNA相互作用的一種檢測方法。 報告基因：是為基因表達強度、蛋白定位等提供可測信號的一類基因。標記基因：為重組提供篩選標記的一類基因第24頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三藍白斑篩選(互補篩選）原理 載體攜帶大腸桿菌-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸（ N端，稱為肽）的編碼信息。宿主菌缺失lacZ基因的起始氨基酸（met), 導致翻譯在后續met處開始，其產物為-半乳糖苷酶的C端，稱為肽） 肽段無催化能力，但可使肽段正確折疊并形成

19、穩定的四聚體；肽段單獨無法正確折疊，因此兩個肽段在一起才具有催化活性，這稱為互補。 載體的肽編碼序列中還插入一個不破壞閱讀框的多克隆位點（MCS）， 由MCS編碼的少數十幾個氨基酸插入到肽的氨基端不會影響其功能，然而，當外源DNA插入MCS后，幾乎不可避免地導致其功能喪失。空載體進入宿主后在IPTG誘導下實現互補， -半乳糖苷酶分解X-Gal產生藍色物質，菌落為藍色；連接有插入片段的載體在IPTG誘導下無互補作用， X-Gal不被分解，菌落為白色X-Gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷IPTG: 異丙基-D-硫代半乳糖苷 X-Gluc ： 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡萄糖苷MC

20、SPlac第25頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三X-galBlueX-galNo insertInsertX-galBlueX-galNo colorNo insertInsert第26頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三1.9 質粒的提?。?） CsCl-EtBr密度梯度離心(Radloff,1967)溴化乙錠摻入DNA導致密度降低線性DNA和閉環DNA結合的溴化乙錠的量有差異，前者摻入的更多質粒純度非常高，但耗時、儀器藥品昂貴 36萬g :6h 18萬g:48h 溫和裂解細胞，釋放出質粒，而染色體、蛋白及細胞殘余通過離心除去第27頁，共134

21、頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三（2） 堿裂解法（Birnboim and Doly，1979）線性DNA在pH1212.6易變性，變性后不易復性而環狀DNA不易變性，即使有部分發生變性也容易復性溶液I: 50 mM葡萄糖（使菌體均勻懸浮，不易沉積結塊） 25 mM Tris-Cl，pH 8.0； （緩沖作用） 10 mM EDTA （螯合Mg2+等金屬離子，失活DNase)25：24：1 酚/氯仿/異戊醇：（變性蛋白質）溶液II: 0.2 N NaOH (裂解細胞、線性DNA變性) 1% SDS(與蛋白質結合）溶液III: 3 M 醋酸鉀( 置換SDS的鈉離子，形成沉淀，并與基

22、因組DNA 共沉淀） 2 M 醋酸（中和堿性pH，防止DNA斷裂）無水乙醇：沉淀質粒DNA第28頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三堿裂解法流程圖對數期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀質粒DNA溶液第29頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三染色體DNA比質粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質粒DNA為共價閉合環狀分子；當加熱處理DNA溶液時（40-50s)，線狀染色體DNA容易發生變性，共價閉環的質粒DNA在冷卻時即恢復其天然構象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質和細胞碎片結合形成沉淀，

23、而復性的超螺旋質粒DNA分子則以溶解狀態存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。（3）煮沸法原理第30頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三1.10 質粒的改造對天然質粒的改造，原則上僅需要保留其復制子的必需序列和標記基因。盡可能減少分子量，小質粒在提取純化時不易破壞，可容納更大的外源DNA。加入多克隆位點（MCS),便于在此處插入各種片段有1-2個可在宿主中表達的標記基因若改造成表達質粒，還需要加入啟動子、RBS等元件。多克隆位點：人工合成的，密集排列的，可被多種限制酶識別切割的DNA序列第31頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三克隆片段一般插入Ap或

24、Tc中，破壞一個抗性基因正選擇方法：分別在含有Ap或Tc的平板上對應點接培養菌株負選擇方法：對于Ap, 選擇培養基中含有淀粉，長出大菌落后倒入含有青霉素和碘的指示劑， Ap抗性菌株將青霉素轉化為青霉酮酸，后者和碘結合，四周不會變藍，而Ap敏感株為藍色。對于Tc，采用環絲氨酸富集法?？剐灾昴芎铣傻鞍踪|，死亡；敏感株不能合成，生長受到抑制pBR322分子量小，合適的標記，拷貝數較多blatet克隆載體和表達載體示例第32頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三pUCFrom pMB1分子量小合適的標記拷貝數多第33頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三第34頁

25、，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三主要內容1.細菌質粒載體 定義，分類，復制機理與方式，不穩定性與不相容性，可移動性 報告基因，質粒提取方法與原理2.噬菌體載體3.酵母細胞載體及大容量載體4.動、植物載體第35頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三2. 噬菌體和噬菌體載體 1951年，J. Lederberg的妻子Esther Lederberg證明了J. Lederberg和Tatum用來雜交的K12中有原噬菌體，并命名為，經過約10年的研究搞清了溶源化的實質。 噬菌體是感染大腸桿菌的溶源性噬菌體，在感染宿主后可進入溶源狀態，也可進入裂解循環。 噬菌

26、體基因組為長度約為 50kb 的雙鏈 DNA 分子，實際大小為 48502bp。其兩端的 5 末端帶有 12 個堿基的互補單鏈（粘性末端），稱為 COS 位點；2.1 噬菌體及其生活周期Cohesive end site第36頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三 噬菌體由頭和尾構成，其基因組組裝在頭部蛋白質外殼內部，其序列已被全部測出。用感染大腸桿菌的噬菌體改造成的載體是應用最為廣泛的病毒載體。T偶系列烈性噬菌體 溫和噬菌體（ ）第37頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三晚期基因第38頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三噬菌體生

27、活周期可選擇進入裂解生長狀態（lytic growth），大量復制并組裝成子代 噬菌體顆粒，導致宿主細胞裂解。經過 4045min 的生長循環，釋放出約 100 個感染性噬菌體顆粒（每個細胞）；或者進入溶源狀態（lysogenic state），將噬菌體基因組 DNA 通過位點專一性重組整合到宿主的染色體 DNA 中，并隨宿主的繁殖傳給子代細胞。 第39頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三當噬菌體侵入新的宿主細胞時，裂解和溶原途徑以同樣的方式開始。二者都需要前早期和后早期基因的表達。但是以后它們就分道揚鑣了：如果晚期基因表達了，隨之而來的是裂解發育；如果建立起阻遏蛋白cI

28、的大量合成，接著發生的則是溶原化N 基因：編碼一個抗終止(Antitermination)因子，該因子作用在nut位點，允許轉錄繼續進入后早期基因。cro 基因：有雙重功能a.阻止阻遏蛋白CI的合成(如果裂解周期繼續進行，這種作用是必須的)；b.關閉前早期基因的表達(在裂解周期后期是不需要的)。（1）前早期基因表達第40頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三后早期基因包括阻遏蛋白基因cI,兩個復制基因(裂解侵染所必須)，和7 個重組基因(某些與裂解侵染時的重組有關，有兩個是溶源時將DNA 整合到細菌染色體中所必需)，還有3 個編碼調控產物的基因，其調控產物有相反的功能： c

29、和c這對調控產物是啟動阻遏蛋白CI合成所必需的。（有利溶源） 調控蛋白Q 是一個使宿主RNA 聚合酶繼續進入晚期基因的抗終止因子(有利裂解）（2）后早期基因表達（3）晚期基因表達晚期基因是作為單獨的轉錄單位表達的，它從位于Q 與S 之間的啟動子PR處起始。 PR 是組成型的, 在缺乏基因Q 產物時，轉錄終止在tR3部位。產生的轉錄物稱為6S RNA，長194 個堿基;當存在可利用的pQ 時，pQ 抑制在tR3處的終止作用，使6S RNA 延伸，其結果使晚期基因全部表達。第41頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三（4）cI在溶原化中的作用 c基因是從啟動子PRM處轉錄，轉錄

30、在該基因的左方停止。由于轉錄本缺少常見的核糖體結合位點，所以轉譯效率較差，只產生低含量的阻遏蛋白，此時以單體形式存在。 c濃度高時形成二聚體，可獨立地與兩個操縱基因OL和OR結合： 1區比2、3區與c的親和力高約10倍，c總是先與1區結合。1區被二聚體結合后增加第二個二聚體與2區的親和力。當1 與2區 都被結合時，這種相互作用不再擴大到3區在1、2區的結合阻止啟動子PR、PL的啟動,同時激活細菌RNA聚合酶在PRM的轉錄，建立了一個正的自調控回路。阻遏蛋白的濃度變得過大時將占有OR3區， PRM的啟動被阻止， c的轉錄終止，從而降低阻遏蛋白濃度。自體正負調控系統第42頁，共134頁，2022年

31、，5月20日，18點5分，星期三只要阻遏蛋白c的含量充分，c基因就持續表達。結果是OL和OR無限期被占用，于是就阻遏了裂解周期，使原噬菌體維持其惰性形式。阻遏蛋白的存在解釋了超感染免疫性現象。如果有第二個噬菌體DNA 進入溶原細胞，由原噬菌體基因合成的c將立即與新噬菌體的OL和OR結合，阻止第二個噬菌體進入裂解周期。cI基因區段也稱為免疫區，表示為imm。cI在溶原化中的作用人工改造的溫敏性啟動子系統：cITS857+(PL或PR), 42時阻遏蛋白失活，啟動轉錄；反之31 時無法轉錄第43頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三（5） CII和Cro的作用當DNA 進入新的

32、宿主細胞時，細菌的RNA 聚合酶不能轉錄c，基因N和cro首先被轉錄。接著，pN使c、 c、Q和其它后早期基因轉錄。C蛋白激活PRE （在cro和c之間）、PI(插入基因int的啟動子）及Panti-Q(位于Q基因內)的轉錄：Cro 蛋白（二聚體）通過與PRM 作用直接阻止阻遏蛋白的合成，并可關閉早期基因的表達，間接阻止阻遏蛋白的合成。PRE的啟動產生了cro反義轉錄本及cI轉錄本，導致前者表達終止和最初CI蛋白的合成， CI蛋白啟動正自調控系統并終止早期基因轉錄。此后胞內已合成的CII及CIII迅速被降解（C在體內極端不穩定，因為有一種HflA 的宿主蛋白質使它降解。C的作用是保護C抗拒這種

33、降解）。Int基因產物使DNA 整合到宿主染色體上而溶原化Panti-Q的啟動產生了Q反義轉錄本，終止了裂解所需晚期基因的表達Cro 對OR 3 的親和力比對OR 2和OR 1的親和力更強，它首先與3區結合。這個結合抑制了RNA 聚合酶與PRM的結合，破壞了溶原維持的正負自調控系統Cro結合在1區或2區（約比CI與該區親和力低8倍）降低PL和PR的轉錄水平，降低早期基因(包括Cro 自身)的表達水平Hfl：高頻溶源化， high frequency of lysogenization 第44頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三它們之間的區別可歸結為：究竟是阻遏蛋白CI還是

34、Cro 將獲得兩個操縱基因的占用權。（6） 溶原化還是裂解？建立溶原的起始活動是CI 在OL1 和OR1處的結合。第一個位點的結合將使另一個阻遏蛋白二聚體在OL2 和OR2 處的協同結合快速成功。這終止了Cro的表達及Cro與3區的結合機會，并開始經由PRM進行阻遏蛋白的合成。進入裂解周期的起始活動是Cro在OR3處結合，阻止了溶原維持回路在PRM處的開始。接著，Cro必須與OR 2或OR 1，以及OL 2 或OL 1 結合，以降低早期基因的表達來停止合成C和C，已合成的 C和C被降解，導致CI無法繼續合成。最初被合成的Q蛋白導致晚期基因表達（噬菌體外殼）細菌生長在豐富的培養基時蛋白酶活性強，

35、 C和C不能穩定存在，所以噬菌體傾向于裂解；當細胞饑餓時，它更傾向于進入溶原(C和C較穩定)。當溶源菌受紫外線或絲裂霉素C處理后，會發生SOS反應，激活RecA蛋白，使C蛋白分解，可以進入裂解期第45頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三第46頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三int：整合酶基因， 識別宿主細胞染色體DNA和噬菌體DNA上的att位點（PP與BB) ，并能催化二者的斷裂和再連接。att：附著位點，在宿主細胞DNA上稱為attB，在噬菌體DNA上稱為attP，兩者含有一段15bp的同源序列，重組酶可識別該序列而使噬菌體基因組插入到宿主的

36、染色體DNA上。xis：切除酶基因。 int和xis基因產物共同作用，能使att位點發生重組（PB與BP)，并將原噬菌體基因組DNA從宿主染色體中切割下來，使噬菌體進入裂解過程。整合和切割都需要來自宿主的一種整合因子Hif協助（7） 噬菌體的整合與割離第47頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三Holliday連接結構第48頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三2.2 噬菌體載體有長度限制:(75%-105%)48kb才能被有效包裝入蛋白外殼并形成清晰的噬菌斑，必需區長28Kb有相當長的感染非必需序列，這些序列可以刪除，或用填補序列取代（保證總長75%）

37、，75%長度的限制也提供了一種正篩選方法）限制性酶切位點過多可插入的長片段DNA（長至20kb以上），且包裝的噬菌體感染大腸桿菌比質粒轉化細菌的效率高得多，凍藏后存活率高，非常適合于構建cDNA文庫或基因組文庫?？寺〔僮饕荣|粒載體復雜 2.2.1 野生型 噬菌體載體的一般特點2.2.2 噬菌體載體的改造刪除多余限制性內切酶位點中段非必需區被替換為某些報告基因或其它正篩選系統，以及和多克隆位點等 第49頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三2.2.3 噬菌體載體的類型插入型載體（如gt10等 )替換型載體（如EMBL3等）插入型載體只能承受較小分子量（一般10kb）的外源D

38、NA片段的插入，廣泛應用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替換型載體則可承受較大分子量的外源DNA片段的插入，所以適用于克隆高等真核生物的染色體DNA空載體形成藍色噬菌斑，插入片段載體形成無色噬菌斑空載體形成渾濁的噬菌斑，插入片段載體形成清晰的噬菌斑Charon vector 卡隆載體 第50頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三Spi 篩選 gam篩選 2.2.4 其他篩選系統 野生型 噬菌體在帶有 P2 原噬菌體的溶源性 E.coli 中 的生長會受到限制的表型，稱作 Spi+ （sensitive to P2 interference）。 如果 噬菌體缺少兩個參與重組

39、的基因 red 和 gam ，則可以在 P2 溶源性 E.coli 中生長良好，并形成微小的噬菌斑，即Spi- 。 通過對噬菌體載體 DNA 上的 red 和 gam 基因的缺失或替換，可 在P2 噬菌體溶源性細菌中鑒別重組和非重組噬菌體。 只有晚期的滾環復制所形成的線性多聚體DNA能被有效包裝，gam基因是控制噬菌體從早期的雙向復制模式向晚期的滾環復制模式進行轉換的開關，因此gam-則不能大量形成線性多聚體DNA，只能靠red或宿主的rec重組系統將環狀DNA重組成多聚體（需要chi位點才能高效重組），然后包裝成噬菌體顆粒，形成微小的噬菌斑（沒有chi位點, crossover hot-sp

40、ot instigator交換熱點激活區， 只能形成極其微小的噬菌斑）. gam+的噬菌體可以形成清晰的大斑。第51頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三2.2.5 噬菌體載體克隆一般過程第52頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三2.2.6 噬菌體載體的體外包裝如果用DNA直接轉染感受態細胞，效率較低:105個噬菌斑/g DNA用載體與外源片段連接后的產物轉染：104103個噬菌斑/g DNA如果包裝成噬菌體顆粒感染感受態細胞，則效率很高：高達107 /g DNA，每個顆粒轉導效率幾乎為100%第53頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，

41、星期三1.帶有互補的缺陷基因，誘導后不能裂解細胞（S基因缺陷），cI857。2.避免內源噬菌體被包裝 采用刪除原噬菌體b2區而使att位點缺損,這樣原噬菌體不能從染色體上割離 內源噬菌體采用imm434 ，包裝采用，感染imm434溶源菌，可阻止內源噬菌體形成噬菌斑，而帶有外源片段的噬菌體可以成斑 重組缺陷以避免內源噬菌體與重組噬菌體之間發生重組對產生外殼蛋白大腸桿菌的要求：E-、S-D- ,S- gene對兩種產生外殼蛋白內源噬菌體的要求：434 ： 噬菌體的近親434第54頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三2.3 單鏈噬菌體載體及噬菌粒載體M13，f1,fd為大腸桿

42、菌絲狀噬菌體，基因組為單鏈環狀DNA，長6.4Kb。M13噬菌體只感染帶有F性須大腸桿菌，但其DNA可轉染無性須的大腸桿菌2.3.1 M13噬菌體載體第55頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三(1) M13的生活周期噬菌體顆粒中的DNA為+鏈，通過性須進入細胞以+鏈為模板合成-鏈，形成RF DNA（復制形式DNA).RF DNA進行數輪復制， +鏈被切開，以-鏈為模板進行滾環復制新的+鏈，并在復制一圈后切割下來、成環。新的+鏈環繼續變為RF DNA，其數目達到200個拷貝，基因V蛋白同+鏈結合，使-鏈無法合成，此時只能產生大量+鏈環狀DNA單鏈鏈環狀DNA被包裝成新噬菌體

43、并擠壓出細胞膜。宿主細胞不被裂解，只是生長速度變慢 Replication Form DNA第56頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三第57頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三(2) M13載體特點無包裝限制制備及克隆操作方便可用于制備單鏈DNA 一般插入了MCS，及標記基因 雖然只有500bp非必需區段（基因II和IV之間），但包裝限制方面優于噬菌體，包裝長度可達基因組數倍。包裝長度越長越不穩定，因此插入片段的長度有限，一般小于1.5Kb 細胞內有大量RF DNA, 可以用提取質粒的方法大量純化，進行酶切、連接等操作。重組好的DNA又能高效轉染宿主

44、。 帶有外源片段的M13載體，在宿主中復制后形成的子代噬菌體包裝單鏈DNA,因此可以制備大量單鏈DNA，用于Sanger測序或制備探針。（兩條鏈都能方便的制備單鏈） 如lacZ的 Hind II片段（類似于 肽），宿主必須為lacZ M15突變株（缺第11-41個氨基酸殘基，無法形成四聚體），便于篩選重組DNA。（外源片段插入Hind II片段中造成肽失活）.如果宿主為lacIq突變，則可表達超量阻遏蛋白，可以用IPTG進行誘導表達。（質粒表達載體一般攜帶lacI基因來解決該問題）第58頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三lacZ Hind II 片段M13載體示例第59

45、頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三 為了克服M13噬菌體的缺點，開發了一類同時含有質粒復制子和絲狀噬菌體復制起點的載體系列，稱為噬菌粒（phagemid） 兼有絲狀噬菌體和質粒的特點：存在輔助噬菌體時：滾環復制產生單鏈DNA、包裝成噬菌體顆粒無輔助噬菌體時：質粒復制子控制復制，可制備大量雙鏈DNA.分子量小，可穩定容納長達10Kb外源片段，得到長的單鏈DNA,可省去外源片段從噬菌體載體轉移到質粒上的亞克隆過程。克隆過程：載體、DNA片段的體外酶切、連接轉化入宿主細胞（藍白篩選）用輔助噬菌體感染含有重組噬菌粒的細胞收集噬菌體顆粒、制備單鏈DNA用于測序等后續研究2.3.2

46、 噬菌粒載體第60頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三pBluescript噬菌粒載體藍白篩選bla基因體外轉錄功能第61頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三第62頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三2.3.3 M13 展示載體噬菌體表面展示技術：在噬菌體顆粒表面表達多肽或蛋白質技術。第63頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三主要內容1.細菌質粒載體 定義，分類，復制機理與方式，不穩定性與不相容性，可移動性 報告基因，質粒提取方法與原理2.噬菌體載體 噬菌體生活周期，主要調控蛋白的作用，載體特點及類型，克隆

47、過程，體外包裝過程及注意事項 M13生活周期，載體特點，噬菌粒 3.酵母細胞載體及大容量載體4.動、植物載體第64頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三3. 酵母載體及大容量載體 3.1 酵母載體 3.2 柯斯質粒 3.3 人工染色體第65頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三3.1 常用酵母載體酵母是研究真核生物DNA復制、重組、基因表達和調控的理想受體細胞，也是一種重要的工業微生物，因此需要開發適用于酵母的載體。酵母載體主要是質粒載體： 整合型載體（yeast integerative plasmid, YIp) 復制性載體 （yeast repli

48、cating plasmid, YRp) 著絲粒載體（yeast centromere-containing plasmid, YCp) 附加型載體（yeast episomal plasmid, YEp)特點：具有被E.coli識別的復制子和相應的標記基因，可在其中復制并大量制備。含有在酵母中使用的標記基因（與營養缺陷型宿主基因型互補）具有合適的限制性內切酶位點，方便外源基因的插入。第66頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三（1）整合型質粒 YIp 該類質粒不能在酵母中自主復制，含有與酵母染色體同源的DNA區段，通過同源重組整合在酵母染色體上。轉化效率低：約10個/gD

49、NA，轉化子非常穩定，常用于遺傳分析。第67頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三（2）復制性載體 YRp與著絲粒質粒YCp酵母染色體總長為15,000 kb,根據電鏡觀察結果預計有400個自主復制序列（ARS, autonomously replicating sequence)，該序列可用于構建自主復制型質粒。 轉化效率較高， 104個/gDNA 拷貝數高（120），不易分配給子代細胞，質粒分散不均勻 轉化子不穩定，質粒容易丟失 可整合到染色體中，與YIp整合過程相同若在YRp質粒上加入酵母染色體的著絲粒序列（CEN)，則可增加質粒的穩定性（但拷貝數降低為1），這類質粒

50、為YCp，其行為類似染色體，在有絲分裂與減數分裂中可穩定分配到子細胞。第68頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三（3) 附加型載體 YEp多數酵母品系中含有一種隱蔽性質粒，稱為2m質粒。該質粒的復制系統可以用于構建自主復制性的酵母質粒。 轉化效率較高， 105個/gDNA 拷貝數高(25200)，轉化子比較穩定 易于同內源性2m質粒重組第69頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三載體類型 存在方式 所需DNA序列 標記基因 轉化頻率 穩定性 （菌落/gDNA）無絲分裂 有絲分裂 整合型 整合 與染色體DNA Apr Tcr 10 +a +a (YIp5

51、) 1-幾個拷貝 同源 URA3 附加體型 自主復制 2質粒 Apr Tcr 103-105 -b - (YEp13) 多拷貝 LEU2 復制型 自主復制 ARS Apr Tcr 103-104 -b - (YRp7) 多拷貝 TRP1 著絲粒型 染色體狀 ARS,CEN Apr 103-104 +c +c (YCp19) 通常單拷貝 TRP1,URA3 線型 染色體狀 ARS，CEN TRP1，HIS3 103-104 + + (YLp21) 通常單拷貝 TEL a. 每次細胞分裂仍有約1%的載體DNA從染色體上脫落下來b. 在選擇培養基中15-20代后，10-30%的轉化子丟失載體DNAc

52、. 無絲分裂時有3-14%轉化體丟失質粒，有絲分裂時有3%轉化體質粒不發生分離在選擇培養基上丟失質粒的轉化體低于1% 酵母質粒的特征第70頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三在染色體遺傳作圖、DNA文庫制備、大片段基因克隆等方面需要應用比噬菌體容量更大的載體1978年由J.Collins和B.Bohn發展的柯斯質粒載體可滿足上述需求噬菌體載體最大容量約23kb,實際一般15kb3.2. 柯斯質粒載體柯斯質粒，cosmid, cos site-carrying plasmid, 是一類人工構建的含有噬菌體cos位點和質粒復制子的特殊類型質粒。第71頁，共134頁，2022年

53、，5月20日，18點5分，星期三柯斯質粒pHC79：由質粒pBR322和噬菌體的cos位點的一段DNA構成，全長4.3kb第72頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三具有噬菌體的特性 可在體外包裝成噬菌體顆粒，轉導細胞后利用cos位點環化，采用質粒復制子復制，無法在胞內被包裝。具有質粒載體的特性 質粒復制子和抗生素抗性基因高容量 對于5kb大的柯斯質粒，容量為3045kb,適合于克隆大片段DNA分子具有與同源序列質粒進行重組的能力 如果胞內還存在含有柯斯質粒同源片段的質粒，很容易形成兩種質粒的共合體（1）柯斯質粒的特點第73頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分

54、，星期三（2）柯斯質?？寺∵^程限制酶切割載體和外源片段兩種片段混合連接體外包裝感染宿主質粒環化、復制第74頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三大容量、低本底有效連接產物所占比例較少，使克隆效率較低切割后的片段可能含有多個柯斯載體而造成不穩定可能在染色體作圖中給出錯誤結果優缺點同噬菌體包裝原理：含有多個cos位點的多連體被末端酶割，只在兩個距離合適的cos位點處切割，相距過近（52kb)不切割。第75頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三（3）改良的柯斯克隆過程Ish-Horowicz 和Burke方案H兩份等量柯斯載體分別單酶切（H/S)后去磷酸化,再

55、單酶切（B）切膠分離純化左cos片段及右cos片段基因組DNA酶切處理、去磷酸化。左右cos片段和基因組片段混合連接體外包裝感染宿主細胞由于大大提高了有效連接產物的比例，克隆效率較高（105/gDNA)左右cos片段收率低，操作程序繁瑣優缺點第76頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三Bates 和 Swift方案雙cos位點的柯斯載體雙酶切（B&S)基因組DNA酶切處理、去磷酸化。載體酶切產物與基因組片段混合連接體外包裝感染宿主細胞第77頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三克隆位點兩端相向插入不同啟動子，可體外轉錄產生插入片段的兩條鏈的轉錄本穿梭柯斯

56、載體的構建插入片段易于從載體上切割分離（） 柯斯載體的其它改良第78頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三3.3 人工染色體載體根據染色體來源分為： 細菌人工染色體（BACs） P1派生人工染色體（PACs） 酵母人工染色體（YACs） 哺乳動物人工染色體（MACs） 人類游離人工染色體（HAECs）人工染色體為基因組圖譜制作、基因分離以及基因組序列分析提供了有用的工具 人工染色體：artificial chromosome,指人工構建的含有天然染色體基本功能單位(包括復制起始點replication origin、著絲粒centromere和端粒telomere)的載體系

57、統。第79頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三（1） 細菌人工染色體和P1派生人工染色體（ BACs and PACs)BAC和PAC是用于原核生物大腸桿菌內的人工染色體。BAC是以F因子為基礎構建的環形質粒，容量為300kbPAC則以P1噬菌體(P1 phage)為基礎構建的環形質粒，容量為130-150kb。它們不是嚴格意義上的人工染色體，因為它們不含著絲粒和端粒。 第80頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三一般結構：攜帶一個抗生素抗性基因、來源于 F 因子的嚴謹型控制復制子 oriS、 一個易于 DNA 復制的由 ATP 驅動的解旋酶repE基

58、因 以及三個確保低拷貝質粒精確分配至子代細胞的基因 （parA , parB , 和 parC） 拷貝數：BAC 載體的低拷貝性可以避免嵌合體的產生，減小外源基因的表達產物對宿主細胞的毒副作用?？寺∧芰Γ捍蠖鄶?BAC 文庫中克隆的平均大小約 120kb ，個別的 BAC 重組子中含有的基因組 DNA 可達 300kb BACs 第81頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三第82頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三1. 易于用電擊法轉化E.coli(轉化效率比轉化酵母高10-100倍)； 2. 超螺旋環狀載體，易于操作；（YAC為線狀） 3. F質粒的

59、復制系統控制復制，復制穩定，12個拷貝，保證分配和結構穩定，很少發生體內重排。 4.宿主E.coli可以構建重組缺陷株，進一步提高BAC的穩定性（酵母細胞無法構建重組缺陷株） BAC的優點： 第83頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三基于 P1 噬菌體構建的，與柯斯載體工作原理比較相似的一種高容量載體，含有很多 P1 噬菌體來源的順式作用元件，能容納 70100kb 大小的基因組DNA片段。含有基因組和載體序列的線狀重組分子在體外被組裝到 P1 噬菌體顆粒中，包裝容量可達 115kb。將重組 P1 噬菌體顆粒感染表達 Cre 重組酶的大腸桿菌，線狀 DNA 分子進入宿主后

60、通過載體上兩個 loxP 位點之間的重組而發生環化。載體攜帶kan基因、克隆篩選系統（sacB系統）、以及一個能夠使每個細胞都含有約一個拷貝環狀重組質粒的 P1 質粒復制子。另一個 P1 復制子（ P1 裂解性復制子）在可誘導的 lac 啟動子（IPTG 誘導）控制下，用于 DNA 分離前質粒的擴增。P1 噬菌體載體（Bacteriophage P1 vectors）第84頁，共134頁，2022年，5月20日，18點5分，星期三P1 噬菌體載體克隆過程類似于cosmid：載體酶切、去磷酸化后產生長臂與短臂長、短臂同酶切去磷酸化的插入片段混合連接，形成多連體分子Pacase識別pac位點進行切