1、強制性運動療法促進腦缺血大鼠神經功能康復分子機制的研究張 璇濟寧市第一人民醫院前 言腦梗死 ( cerebral infarction) 是一種發病率、死亡率和致殘率均較高的疾病，給家庭和社會帶來了巨大的經濟和精神負擔。雖然超早期溶栓治療效果好 ，但大部分病人受時間窗限制而失去了溶栓時機 ，神經功能缺失不可避免，總會遺留不同程度的神經功能障礙，如偏癱、失語等。由于神經系統具有很強的可塑性，后期的神經功能康復顯得非常重要。 強制性運動療法 （congstraint-induced movement therapy CIMT）是以中樞神經系統可塑性為基礎，發展起來的一種康復治療技術。 CIMT的基

2、本概念是在生活環境中通過限制患者使用健側肢體，達到強制反復使用和強化訓練患肢為目的的療法。神經影像學研究及臨床應用研究均顯示CIMT有顯著促進神經功能康復的作用。但其確切的作用機制還不十分清晰。立題目的和意義探討CIMT促進腦缺血大鼠神經功能康復的分子機制 ，從而為臨床該療法的廣泛應用推廣提供理論指導。材料與方法1材料1.1實驗動物 120只SD大鼠，體重（26050）g，雌雄不拘，實驗期間定期檢測大鼠心率、血壓、呼吸并維持于正常范圍。大鼠術前12h禁食，自由飲水。1.3 動物模型制備：大鼠自體血栓栓塞大腦中動脈局灶腦缺血模型的制備，選用SD大鼠，體重230350g, 用大鼠自體血制成直徑為0

3、.35mm的血栓，切成1.52mm長，用麻醉導管將58個栓子注入一側頸內動脈，使其堵塞大腦中動脈起始部，建立大腦中動脈閉塞局灶腦缺血模型。假手術組只分離血管不注入血栓1.4 強制性使用運動療法干預80只腦缺血模型成功大鼠，1W時給予進行神經功能缺損評分，隨機分2組（即對照組和CIMT組），CIMT組大鼠用 10%水合氯醛麻醉，將健康的一側前肢置于自然屈曲位置，用手術縫線將皮膚縫在一段3 厘米長的鐵絲上（鐵絲尾端與繞在胸部的鐵環相連），然后用石膏纏繞固定該肢體，部分限制其肢體活動，固定后仍飼養于原籠中。手術后第 8W解除固定。 1.5.1 石蠟切片制備：每組在1W、2W、4W、8W各時間點，分別

4、隨機取2只大鼠，局部麻醉后經2.5%的戊二醛固定后，斷頭取腦。用鋒利刀于病灶邊緣取腦組織（各標本取材部位大致相同），0.51mm3的3小塊。經再固定、梯度酒精脫水、丙酮、環氧丙烷、環氧樹脂包埋后，進行超薄切片。1.5.2 電鏡超薄切片制備： 每組在1W、2W、4W、8W各時間點，分別隨機取2只大鼠，局部麻醉后經2.5%的戊二醛固定后，斷頭取腦。用鋒利刀片于病灶邊緣取腦組織（各標本取材部位大致相同）0.51mm3的3小塊。經戊二醛再固定、梯度酒精脫水、丙酮、環氧丙烷浸透、環氧樹脂包埋后，進行超薄切片1.5.3 免疫印跡腦組織取材每組在1W、2W、4W、8W各時間點，分別隨機取3只大鼠，局部麻醉后

5、經以 4生理鹽水進行灌洗，斷頭取腦，迅速取缺血側大腦皮層及缺血灶邊緣各200mg 腦組織備用2.1 神經功能缺損評分 每組在1W、2W、4W、8W各時間點進行神經功能缺損評分，參照改良的Bederson氏6級評分標準 進行評分。2.2 電鏡觀察超微結構變化2.3.1原位雜交及免疫組化結果觀察原位雜交及免疫組化結果，經常規染色、封片后，自然晾干，結果在40倍物鏡下觀察每張切片陽性細胞表達，經td2000圖像處理系統分析處理，采集圖像輸入計算機，,以灰度計算所選視野陽性染色的單位面積(陽性細胞的的面積占所選整個視野面積的百分比),每張切片取梗死灶邊緣區互不重疊的5個視野，其均值即為該標本每個高倍鏡

6、視野中陽性細胞的單位面積。2.3.2免疫印跡結果分析采用2200 凝膠圖像分析儀，于可見光下采集底片上的蛋白條帶圖像，通過與相應 -actin 條帶密度比較，計算每個條帶密度相對值。2.4 統計學方法 數據采用均數標準差（s）表示，運用spss10.0 統計學軟件包分析，采用單因素方差分析oneWayANOVY方法統計，其中兩兩比較采用Student-Newman-keuls方法，顯著性水平為0.05。3.結 果 結果 3.1 CIMT對大鼠腦缺血后神經功能缺損的影響大鼠腦缺血模型術后7d，CIMT組和對照組Bederson評分比較無顯著性差異(P0.05),與假手術組比較，差異明顯（P0.0

7、1）。隨著時間的延長，兩組神經功能缺損癥狀都逐漸減輕。CIMT神經功能改善較對照組顯著(P0.01)。3.2超微結構觀察結果超微結構觀察 缺血1W時對照組缺血邊緣區大量膠質細胞和神經元受損，細胞內外水腫，核膜結構破壞，核內異染色質增多、聚集，毛細血管、軸突水腫，線粒體腫脹，突觸解體，數目減少。殘存突觸結構腫脹明顯，突觸前膜、突觸間隙和突觸后膜特化帶結構模糊，分界不清，在突觸前成分內散在分布結構不完整的囊泡，突觸連接帶明顯變短，突觸間隙變窄; 隨著時間的延長，在2W、4W、8W時上述病理改變逐漸減輕，突觸數量有所增加，可見新生突觸，4W時超微結構CIMT組超微結構觀察CIMT組經治療在第2W、4

8、W、8W觀察時發現其缺血邊緣區突觸結構損傷程度較對照組明顯減輕，突觸數目減少較對照組少，新生突觸明顯增多，見圖10。隨著時間的延長，這種效果愈加明顯。4W時超微結構CIMT對NgR mRNA表達的影響 CIMT對NgR 蛋白表達的影響 CIMT對NgR mRNA及蛋白表達的影響與假手術組比較，在第一周對照組及CIMT缺血灶邊緣腦組織及同側皮質中NgR mRNA及蛋白表達明顯增多。隨著缺血時間延長，對照組及CIMT缺血灶邊緣腦組織及同側皮質中NgR mRNA及蛋白表達逐漸減少。與對照組比較，CIMT組缺血灶邊緣腦組織及同側皮質中NgR mRNA及蛋白表達減少程度更顯著（0.01）。CIMT對BD

9、NF mRNA及蛋白表達的影響 CIMT對BDNF mRNA表達的影響 CIMT對BDNF 蛋白表達的影響 與假手術組比較，在第一周對照組及CIMT缺血灶邊緣腦組織及同側皮質中BDNF mRNA及蛋白表達明顯增多。隨著缺血時間延長，對照組缺血灶邊緣腦組織及同側皮質中BDNFmRNA及蛋白表達逐漸減少，而CIMT在觀察點第2W、4W時（即治療1W、3W后）其缺血灶邊緣腦組織及同側皮質中BDNF mRNA及蛋白表達較觀察點第1W時明顯增加，觀察點第8W時逐漸下降，但與對照組比較有顯著變化見表3（0.01）。CIMT對GAP-43 mRNA表達的影響 各組大鼠腦組織在4W時GAP-43的表達 假手術組 對照組 CIMT組CIMT對GAP-43 蛋白表達的影響 CIMT對SYPmRNA表達的影響 各組大鼠腦組織在4W時SYP的表達 假手術組 對照組CIMT組 結 論1、強制性使用運動療法可明顯降低腦缺血大鼠神經功能缺損程度，減低腦梗塞的致殘率2、強制性使用運動療法通過降低NgR的表達，促進腦源性神經生長因子BDNF的表達，減少對神經再生的阻滯，促進神經軸突發芽、建立側枝反射，促進神經修復。3、強制性使用運動療法通過促進大鼠腦梗死后缺血邊緣區及大腦皮層GAP43和SYP的表達，具有促進神經生長、突觸再生和重建、完善突觸效能的作用，促進神經修復。結 語通過本課