1、Southern Blot 原理及實驗方法原理：將待檢測的DNA分子用/不用限制性內切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再 與同位素或其它標記物標記的DNA或RNA探針進行反應。如果待檢物中含有與探 針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結合，游離探針洗滌后用自顯影或 其它合適的技術進行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。用途：檢測樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態，如是否有點突變、擴增重排等。一、試劑變性液： 1.5mol/L NaCl， 0.5mol/L NaOH。中和液： 0.5mol/L Tris-H

2、Cl （pH=7.0）， 1.5mol/L NaCl。20 xSSC： 3mol/L NaCI, 0.3mol/L 檸檬酸鈉。以上溶液均在 100Kpa 滅菌 20 分鐘。2xSSC：用無菌移液管吸取20 xSSC溶液5mL，加無菌水45mL。6xSSC：用無菌移液管吸取20 xSSC溶液15mL，加無菌水75mL。二、器材22cmx15cm 瓷盤操作方法在瓊脂糖凝膠上電泳分離DNA。取出凝膠，切去邊緣多于部分，EB染色，在紫外燈下 照相（放一標尺，可從像片中讀出DNA遷移的距離）。將凝膠置于200mL變性液中，浸泡45分鐘，并溫和地不斷振蕩，使凝膠上的ds-DNA 轉變為ss-DNA，然后用

3、重蒸水沖洗凝膠幾次。用中和液浸泡凝膠并不斷地振蕩 45分鐘，將凝膠中和至中性。防止凝膠的堿性破壞硝酸 纖維膜。取一個瓷盤，在底部放一塊玻璃板（或一塊海綿）使盛器內的20倍SSC轉移濾液低于 玻板表面，在玻板表面蓋一張3mm的二號濾紙，濾紙兩邊浸沒于20倍SSC溶液中，在玻 璃和濾紙之間，趕掉所有的氣泡。把凝膠底面朝上放在濾紙上，趕走兩層之間出現的氣泡。裁剪一張硝酸纖維膜，其長與寬大于凝膠12mm，并在角上作記號，以確定濾膜方位。 先把它放在去離子水中潤濕后，再放在20倍SSC溶液中潤濕5分鐘，然后放在凝膠表面， 兩層之間不可有氣泡。然后再把兩張與濾膜一樣大小的二號濾紙，在2倍SSC溶液中浸濕，

4、覆蓋在硝酸纖維膜 上，同樣要把氣泡趕走。把一疊吸水紙（或衛生紙，約有58cm高，略小于濾紙），放置在濾紙上，在吸水紙上 再放一塊玻璃板和重約 500g 的重物，放置過夜。轉移結束后，移去上面的吸水紙和濾紙，同時翻轉取出凝膠與硝酸纖維膜，把凝膠的點樣 與硝酸纖維膜的相對應位置用鉛筆或解剖針的針尖做好標記。把已轉移了 DNA的硝酸纖維膜放在6倍SSC溶液中振蕩浸泡5分鐘，然后放在濾紙 上吸干溶液。再把它夾在兩層濾紙之間，80C真空干燥2小時。注意事項（1）將凝膠中和至中性時，要測 pH, 防止凝膠的堿性破壞硝酸纖維膜。（2） 要注意趕走凝膠和濾紙及硝酸纖維素膜之間的氣泡。Northern Blot

5、 原理及實驗方法原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同的原理進行轉膜和用探針進行雜交檢測。用途：檢測樣品中是否含有基因的轉錄產物（mRNA）及其含量。實驗方法：（一）儀器恒溫水浴箱，電泳儀，凝膠成像系統，真空轉移儀，真空泵， UV 交聯儀，雜交爐，恒溫搖 床，脫色搖床，漩渦振蕩器，分光光度計，微量移液器，電爐（或微波爐），離心管，燒杯， 量筒，三角瓶，等。（二）材料總RNA樣品或mRNA樣品，探針模板DNA（25 ng）,尼龍膜（三）試劑NorthernMax Kit（Cat. # 1940, Ambion, Inc.），瓊脂糖,DEP

6、C, X 光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmola-32PdCTP, Exo-free Klenow Fragment 和 10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS,雙氧水，滅菌水等。方法與步驟用具的準備：180 度烤器皿：三角錐瓶、量筒、鑷子、刀片等4小時。電泳槽：清洗梳子和電泳槽，并用雙氧水浸泡過夜，用DEPC水沖洗，干燥備用。處理DEPC水（2 L）備用。用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子，電泳槽，刀片等，然后用DEPC水沖洗二次，去除RNAZap。制膠：稱取0.36mg瓊脂糖

7、加入三角錐瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波爐加熱至瓊脂糖 完全熔解。60C空氣浴平衡溶液（需加DEPC水補充蒸發的水分）在通風廚中加入3.6ml的10*Denaturing Gel buffer,輕輕振蕩混勻。 注意盡量避免產生氣泡。將熔膠倒入制膠板中，插上梳子 如果膠溶液上存在氣泡，可以用熱的玻璃棒或其它方法去除，或將氣泡推到膠的邊緣。注： 膠的厚度不能超過 0.5cm。4膠在室溫下完全凝固后，將膠轉移到電泳槽中，加入 1x MOPS Gel Running buffer 蓋過 膠面約1cm,小心拔出梳子。（配制250ml 1 *MOPS Gel Running buffer，在電泳

8、過程中 補充蒸發的 buffer。）5檢查點樣孔。RNA樣品的制備在RNA樣品中加入3倍體積的formaldehyde load dye和適當的EB （終濃度為10ug/ml）?；靹蚝?，65C空氣浴15min。短暫低速離心后，立即放置于冰上5min。電泳：將RNA樣品小心加到點樣孔中。在5V/cm下跑膠（5x14cm）。在電泳過程中，每隔30min短暫停止電泳，取出膠，混 勻兩極的電泳液后繼續電泳。當膠中的溴紛藍（ 500bp ）接近膠的邊緣時終止電泳。紫外燈下，檢驗電泳情況，并用尺子測量18S、28S、溴紛藍到點樣孔的距離。 注意不要讓膠在紫外燈下曝光太長時間。轉膜1用 3%雙氧水浸泡真空轉

9、移儀后，用 DEPC 水沖洗。2.用RNAZap擦洗多孔滲水屏和塑膠屏，用DEPC水沖洗二次。 3連接真空泵和真空轉移儀，剪取一塊適當大小的膜（膜的四邊緣應大于塑膠屏孔口的 5mm），膜在Transfer buffer浸濕5分鐘后，放置在多孔滲水屏的適當位置。蓋上塑膠屏，蓋上外框，扣上鎖。將膠的多余部分切除，切后的膠四邊緣要能蓋過塑膠屏孔，并至少蓋過邊緣約2mm，以 防止漏氣。將膠小心放置在膜的上面，膜與膠之間不能有氣泡。打開真空泵，使壓強維持在5058mbar；立即將transfer buffer加到膠面和四周。每隔 10min在膠面加上1ml transfer buffer，真空轉移2小時

10、。&轉膜后，用鑷子夾住膜，于1x MOPS Gel Running buffer中輕輕泡洗10秒，去除殘余 的膠和鹽。用吸水紙吸取膜上多余的液體后，將膜置于UV交聯儀中自動交聯。將膠和紫外交聯后的膜，在紫外燈下檢測轉移效率。 （避免太長的紫外曝光時間） 12.將膜在-20 C保存。7. 探針的制備1在 1.5ml 離心管中配制以下反應液：模板 DNA（25 ng） 1ulRandom Primer 2ul滅菌水 11ul總體積：14ul2. 95C加熱3分鐘后，迅速放置于冰冷卻5min。3在離心管中按下列順序加入以下溶液：10 xBuffer 2.5uldNTP Mixture 2.5ul11

11、1 TBq/mmola-32PdCTP 5 ulExo-free Klenow Fragment 1 ul混勻后（25ul）, 379下反應30分鐘。短暫離心，收集溶液到管底。65C加熱5min使酶失活。8. 探針的純化及比活性測定：準備凝膠：將1g凝膠加入30ml的DEPC水中，浸泡過夜。用DEPC水洗滌膨脹的凝 膠數次，以除去可溶解的葡聚糖。換用新配制的 TE（PH7.6）。取1ml 次性注射器，去除內芯推捍，將注射器底部用硅化的玻璃纖維塞住，在注射器 中裝填 Sephadex G-50 凝膠。將注射器放入一支15ml離心管中，注射器把手架在離心管口上。1600g離心4分鐘， 凝膠壓緊后，

12、補加 Sephadex G-50 凝膠懸液，重復此步直至凝膠柱高度達注射器 0.9ml 刻 度處100ul STE緩沖液洗柱，1600g離心4min。重復3次。倒掉離心管中的溶液后，將一去蓋的1.5ml離心管置于管中，再將裝填了 Sephadex G-50 凝膠的注射器插入離心管中，注射器口對準1.5ml離心管。將標記的DNA樣品加入25 ul STE，取出0.5ul點樣于DE8 paper上，其余上樣于層 析柱上。1600g離心4min, DNA將流出被收集在去蓋的離心管中，而未摻入DNA的dNTP則保 留在層析柱中。取0.5ul己純化的探針點樣于DE8-paper.& 測比活性（試劑比活要

13、求:106cpm/ml）。9預雜交：將預雜交液在雜交爐中68C預熱，并漩渦使未溶解的物質溶解。加入適當的ULRAhyb到雜交管中（以100cm2膜面積加入lOmlULRAhyb雜交液），42C 預雜交 4 hr。10探針變性：.用10 mM EDTA將探針稀釋10倍。90C熱處理稀釋后探針10min后，立即放置于冰上5min。短暫離心，將溶液收集到管底。.雜交：加入0.5ml ULTRAhyb到變性的探針中，混勻后，將探針加到預雜交液中。42C雜交過夜（1424hr）。雜交完后，將雜交液收集起來于一20 C保存。洗膜：1 .低嚴緊性洗膜：加入 Low Stringency Wash Solut

14、ion#1 （100cm2 膜面積加入 20ml 洗膜 溶液），室溫下，搖動洗膜 5min 兩次。2.高嚴緊性洗膜： 加入 High Stringency Wash Solution#2 （100cm2 膜面積加入 20ml 洗 膜溶液）， 42C 搖動洗膜 20min 兩次。13 .曝光：將膜從洗膜液中取出，用保鮮膜包住，以防止膜干燥。檢查膜上放射性強度，估計曝光時間將 X 光底片覆蓋與膜上，曝光沖洗 X 光底片，掃描記錄結果。去除膜上的探針：將200ml 0.1%SDS （由DEPC水配制）煮沸后，將膜放入，室溫下讓SDS冷卻到室溫，取出膜，去除多余的液體，干燥后，可以保存幾個月。雜交結果

15、操作應該小心，但不必緊張。用于RNA電泳、轉膜的所有器械、用具均須處理以除去RNAse 酶，以免樣品的降解。轉膜時，注意膜和多孔滲水屏之間不要有氣泡。RFLPRFLP標記是發展最早的DNA標記技術。RFLP是指基因型之間限制性片段長度的差異， 這種差異是由限制性酶切位點上堿基的插入、缺失、重排或點突變所引起的。RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性內切酶片段長度多態性）作為 第一代分子生物學標記自問世以來已廣泛運用于多門生物學科研究中，但它運用于植物抗性 研究還只是近幾年的事。RFLP能對植物的抗性基因進行定位和分離，利用RFLP技術

16、，對 于核基因組或葉綠體基因組、尤其是后者，若能提取純凈DNA，則可直接從酶切后的電泳 圖譜看出其多態性，利用這一方法可以測定種群內、種群間不同水平的物種在污染環境下抗 性分化進化水平上的差異。RFLP技術在用于基因型分型研究的同時，同樣的可用于在不同 環境中微生物多樣性的研究。RFLP技術主要包括以下基本步驟：DNA提取-用限制性內切酶酶切DNA-用凝膠電泳分開DNA片段-把DNA片段轉移到濾 膜上-利用放射性標記的探針雜交顯示特定的DNA片段（Southern雜交）和結果分析。RFLP遍布低拷貝編碼序列，并且非常穩定，但RFLP實驗操作繁瑣，檢測周期長，成本高 昂，不適于大規模的分子育種，在植物分子標記輔助育種中需要將RFLP轉換成以PCR為 基礎的標記。與核酸序列分析相比，RFLP可省去序列分析中許多非常繁瑣工序，但相對RAPD而言， RFLP方法更費時、費力，需要進行DNA多種酶切、