1、基因組測(cè)序生物信息系列講座之二基因組測(cè)序基本原理分解第1頁(yè)綱領(lǐng)I. 核酸DNA發(fā)覺(jué)以及測(cè)序歷史介紹II. 雙脫氧化(Sanger dideoxy method)測(cè)序III.大片段DNA測(cè)序與基因組測(cè)序大發(fā)展VI.人類基因組V. 1000美元個(gè)體化基因組測(cè)序計(jì)劃(The “$1,000 dollar genome)On WebCT- “The $1000 genome”- review of new sequencing techniques by George Church基因組測(cè)序基本原理分解第2頁(yè)P(yáng)art I.核酸測(cè)序原理基因組測(cè)序基本原理分解第3頁(yè)核酸發(fā)覺(jué)與測(cè)序簡(jiǎn)史基因組測(cè)序基本原理分解

2、第4頁(yè)MC chapter 12DNA測(cè)序簡(jiǎn)史基因組測(cè)序基本原理分解第5頁(yè)DNA測(cè)序方法雙脫氧法 (Sanger dideoxy) (primer extension/chain-termination) method: 最流行也是最廣為接收方法。Maxam-Gilbert化學(xué)剪切法(chemical cleavage method): DNA is labelled and then chemically cleaved in a sequence-dependent manner. This method is not easily scaled and is rather tedious

3、焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing): measuring chain extension by pyrophosphate monitoring。焦磷酸測(cè)序技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù)，該技術(shù)無(wú)須進(jìn)行電泳，DNA片段也無(wú)須熒光標(biāo)識(shí)，操作極為簡(jiǎn)便，能夠快速、準(zhǔn)確地確定DNA序列。基因組測(cè)序基本原理分解第6頁(yè)Single stranded DNA5353Sanger 雙脫氧測(cè)序原理a) 常規(guī)PCR，粘附(Anneal)基因組測(cè)序基本原理分解第7頁(yè)Sanger 雙脫氧測(cè)序原理b) 在延伸時(shí)候?qū)NA聚合酶與加入正常dNTP，同時(shí)摻入少許雙脫氧ddNTP53DNA聚合酶延伸方向基因組測(cè)序基本

4、原理分解第8頁(yè)Sanger 雙脫氧測(cè)序原理5353TTTTddAddAddAddA以ddATP為例，能夠看到在反應(yīng)中帶有T模板被摻入互補(bǔ)ddATP隨機(jī)停頓。因?yàn)閐dATP不能夠再使其主鏈延伸。基因組測(cè)序基本原理分解第9頁(yè)怎樣讀取這些DNA片段？同位素標(biāo)識(shí)同位素標(biāo)識(shí)引物 (如 32P)同位素標(biāo)識(shí)dNTPs (如35S 或者 32P)熒光標(biāo)識(shí)化學(xué)合成時(shí)帶有熒光素標(biāo)識(shí)ddNTPs被摻入到反應(yīng)中。每一個(gè)ddNTP都帶有本身特定熒光波長(zhǎng)方便于觀察基因組測(cè)序基本原理分解第10頁(yè)測(cè)序結(jié)果分析當(dāng)前普通采取凝膠電泳法分析-能夠比很好將每一條dNTP產(chǎn)生DNA條帶分離開。基因組測(cè)序基本原理分解第11頁(yè)DNA測(cè)序膠

5、: 老方法利用電泳或者放射自顯影方法來(lái)分析DNA序列在反應(yīng)中加入不一樣ddNTP得到結(jié)果帶有同位素標(biāo)識(shí)引物或者ddNTP被摻入到反應(yīng)中，方便于觀察基因組測(cè)序基本原理分解第12頁(yè)基因組測(cè)序基本原理分解第13頁(yè)自動(dòng)測(cè)序儀輸出基因組測(cè)序基本原理分解第14頁(yè)DNA測(cè)序?qū)嵗龢颖疽粋€(gè)帶有28個(gè)DNA樣品膠圖: 綠帶：堿基A，,藍(lán)帶 C, 黃帶G，紅帶 T.越小片段跑得越快基因組測(cè)序基本原理分解第15頁(yè)自動(dòng)測(cè)序儀/sci/techresources/Human_Genome/publicat/hgn/v10n3/images/megabaces.jpg基因組測(cè)序基本原理分解第16頁(yè)測(cè)序趨勢(shì)相對(duì)而言普通極少試

6、驗(yàn)室會(huì)自己做測(cè)序，一則本身測(cè)序費(fèi)用比較高，而且熒光試劑輕易粹滅，同時(shí)也比較消耗時(shí)間，另外可能出現(xiàn)一些其它問(wèn)題引發(fā)結(jié)果不成功。所以大部分測(cè)序都是送到相關(guān)測(cè)序中心或者企業(yè)完成:-下面這個(gè)序列就是一個(gè)自動(dòng)測(cè)序儀統(tǒng)計(jì)一段DNA片段基因組測(cè)序基本原理分解第17頁(yè)P(yáng)art II.大片段DNA測(cè)序與基因組測(cè)序大發(fā)展基因組測(cè)序基本原理分解第18頁(yè)19基因組測(cè)序基本原理分解第19頁(yè)蜜蜂基因組是怎樣取得？基因組測(cè)序基本原理分解第20頁(yè)基因組文庫(kù)建立當(dāng)前基將基因組片段打壞建立文庫(kù)。基因組文庫(kù)含有某種生物體全部基因隨機(jī)片段重組DNA克隆群體。基因組測(cè)序基本原理分解第21頁(yè)酵母人工染色體(YACs) 200-1000

7、kbBacteriophage P1 90 kbCosmids 40 kbBacteriophage l 9-23 kb質(zhì)粒(2-6 kb)基因組測(cè)序基本原理分解第22頁(yè)大片段載體Lambda phage插入大小: 2030 kbCosmids插入大小: 3545 kbBACs and PACs (bacterial and P1 artificial chromosomes (Viral) respectively)插入大小: 100300 kbYACs (yeast artificial chromosomes)插入大小: 2001,000 kb基因組測(cè)序基本原理分解第23頁(yè)大片段插入載體

8、Lambda 噬菌體 以及 cosmids插入穩(wěn)定但插入片段容量可能不足以做大規(guī)模測(cè)序YACs能夠插入大片段但不太穩(wěn)定，比較難實(shí)際操作基因組測(cè)序基本原理分解第24頁(yè)BACs and PACsBACs and PACs大規(guī)模測(cè)序通用質(zhì)粒對(duì)插入片段大小比較適當(dāng)，而且輕易使用與其它正常質(zhì)粒一樣能夠擴(kuò)增和分離基因組測(cè)序基本原理分解第25頁(yè)全基因組鳥槍法測(cè)序不過(guò)片段比較大時(shí)，如在基因組測(cè)序時(shí)，僅僅由Sanger方法并不適當(dāng)，所以Shotgun測(cè)序，將基因大片段打壞后測(cè)序。鳥槍法戰(zhàn)略（Shotgun Strategy）又稱隨機(jī)測(cè)序戰(zhàn)略，是由美國(guó)塞萊拉遺傳企業(yè)創(chuàng)始人克雷格文特爾創(chuàng)造，主要針對(duì)大片段全長(zhǎng)測(cè)序。

9、因?yàn)檎麄€(gè)基因組太長(zhǎng)而每次只能測(cè)得一個(gè)500小片斷(read)。基因組測(cè)序基本原理分解第26頁(yè)鳥槍法測(cè)序步驟第一，建立高度隨機(jī)、插入片段大小為2kb左右基因組文庫(kù)。克隆數(shù)要到達(dá)一定數(shù)量，即經(jīng)末端測(cè)序克隆片段堿基總數(shù)應(yīng)到達(dá)基因組5倍以上。第二，高效、大規(guī)模末端測(cè)序。第三，序列集合。第四，填補(bǔ)缺口。基因組測(cè)序基本原理分解第27頁(yè)鳥槍法測(cè)序簡(jiǎn)明基因組測(cè)序基本原理分解第28頁(yè)SIZE SELECTe.g., 10Kbp 8% std.dev.SHEAR鳥槍法測(cè)序技術(shù)DNA target sampleVectorLIGATE & CLONEPrimerEnd Reads (Mates)SEQUENCE55

10、0bp基因組測(cè)序基本原理分解第29頁(yè)重合群Contigs重合群是指一組相互重合染色體DNA序列怎樣建立重合群基因克隆？For sequencing one wants to create “minimum tiling path”Contig of smallest number of inserts that covers a region of the chromosome基因組genomic DNA重合群contig最小路徑minimumtiling path基因組測(cè)序基本原理分解第30頁(yè)限制性酶切產(chǎn)生不一樣重合群Contigs經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切將重合片段序列排列直到建立一個(gè)完整con

11、tig基因組測(cè)序基本原理分解第31頁(yè)兩種不一樣全基因組鳥槍法測(cè)序基因組測(cè)序基本原理分解第32頁(yè)序列拼接與組裝獨(dú)立測(cè)序片段(read)經(jīng)過(guò)逐步把它們拼接起來(lái)形成序列更長(zhǎng)重合群(Contig)，直至得到完整序列過(guò)程稱為重合群裝配(Scaffold)。當(dāng)前DNA 序列拼接應(yīng)用主要軟件是由美國(guó)華盛頓大學(xué)Phil Green試驗(yàn)室開發(fā)Phred Phrap Consed系統(tǒng)。當(dāng)前36個(gè)國(guó)家900 多個(gè)試驗(yàn)室都在使用上述系統(tǒng)。非贏利研究機(jī)構(gòu)或個(gè)人可申請(qǐng)無(wú)償利用該系統(tǒng)。另外還有一序列商業(yè)軟件，如主流基因組拼接軟件（GenomeAssembly），華大基因開發(fā)SOAPdenovo都能夠做基因組拼接，然后能夠用

12、補(bǔ)漏軟件進(jìn)行補(bǔ)漏，得到完整基因組序列。基因組測(cè)序基本原理分解第33頁(yè)基因組de novo測(cè)序基因組de novo測(cè)序也叫做基因組從頭測(cè)序，是指不依賴于任何已知基因組序列信息對(duì)某個(gè)物種基因組進(jìn)行測(cè)序，然后應(yīng)用生物信息學(xué)伎倆對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行拼接和組裝，最終取得該物種基因組序列圖譜。基因組測(cè)序基本原理分解第34頁(yè)De novo基因原理淺解假設(shè)有原始序列：I did not know what is written in this paper.那么經(jīng)過(guò)de novo分段重復(fù)測(cè)序得到了3次不一樣結(jié)果。測(cè)序結(jié)果1：id idn otkn owwh ati swr itteni nthisp aper測(cè)序結(jié)果

13、2: idid notkn owwha tiswrrit enin th isp ap er測(cè)序結(jié)果3: i di dno tkno ww hati swri tteni nth ispap er將3次重合(overlap)部分進(jìn)行拼接組成contig(重合群) idn otkn owwhidid notkn owwha dno tkno wwididnotknowwha (Contig)基因組測(cè)序基本原理分解第35頁(yè)De novo測(cè)序原理基因組測(cè)序基本原理分解第36頁(yè)mapping測(cè)序經(jīng)過(guò)現(xiàn)有已知同源主鏈序列，將同源測(cè)序片段組裝拼裝，建立新序列。該序列與主鏈類似，但不一定相同。基因組測(cè)序基本

14、原理分解第37頁(yè)測(cè)序試驗(yàn)室基因組測(cè)序基本原理分解第38頁(yè)39組裝缺口測(cè)序缺口- 我們假如已經(jīng)知道重合群次序和方向，那么能夠經(jīng)過(guò)跨越式測(cè)序得到缺口序列信息。物理缺口- 沒(méi)有重合群覆蓋，同時(shí)也沒(méi)有DNA測(cè)序結(jié)果 測(cè)序缺口物理缺口基因組測(cè)序基本原理分解第39頁(yè)重復(fù)序列干擾鳥槍法測(cè)序拼接基因組測(cè)序基本原理分解第40頁(yè)41重復(fù)序列REPEATS基因組測(cè)序基本原理分解第41頁(yè)重復(fù)序列真核生物染色體基因組中重復(fù)出現(xiàn)核苷酸序列。這些序列普通不編碼多肽，在基因組內(nèi)可成簇排布，也可散布于基因組。基因組測(cè)序基本原理分解第42頁(yè)重復(fù)序列屏蔽軟件CENSOR是一個(gè)經(jīng)過(guò)參考序列篩選查詢序列中重復(fù)序列并屏蔽同源重復(fù)序列軟件

15、工具，其能夠?qū)⑷空业街貜?fù)生成匯報(bào)以及分類基因組測(cè)序基本原理分解第43頁(yè)CENSOR也可提供離線軟件包基因組測(cè)序基本原理分解第44頁(yè)Repeat maskerRepeatMasker經(jīng)過(guò)已知數(shù)據(jù)庫(kù)中重復(fù)元素篩選FASTA格式查詢序列，并返回一個(gè)屏蔽之后能夠用于準(zhǔn)備數(shù)據(jù)庫(kù)檢索查詢序列DNA序列。基因組測(cè)序基本原理分解第45頁(yè)Repeat masker離線軟件包基因組測(cè)序基本原理分解第46頁(yè)兩種屏蔽方法差異Repeatmasker使用方法類似于CENSOR，但這兩個(gè)工具各自有本身優(yōu)點(diǎn)，在于他們數(shù)據(jù)庫(kù)選取中有差異，假如要確保數(shù)據(jù)愈加可信。所以同時(shí)用兩個(gè)工具或者與與其它類似工具組合使用。基因組測(cè)序基本

16、原理分解第47頁(yè)48一些錯(cuò)配重復(fù)序列collapsed tandemexcisionrearrangement基因組測(cè)序基本原理分解第48頁(yè)人類基因組計(jì)劃人類基因組計(jì)劃 (英語(yǔ)：Human Genome Project, HGP）是一項(xiàng)規(guī)模宏大，跨國(guó)跨學(xué)科科學(xué)探索工程。其宗意在于測(cè)定組成人類染色體（指單倍體）中所包含30億個(gè)堿基對(duì)組成核苷酸序列，從而繪制人類基因組圖譜，而且辨識(shí)其載有基因及其序列，到達(dá)破譯人類遺傳信息最終目標(biāo)。基因組測(cè)序基本原理分解第49頁(yè)人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)/projects/genome/guide/human/http:/hgpd.lifesciencedb.jp/cgi/i

17、ndex.html基因組測(cè)序基本原理分解第50頁(yè)個(gè)體化基因組測(cè)序計(jì)劃已經(jīng)有研究表明，基因或基因組變異是腫瘤發(fā)生根本原因，利用單細(xì)胞全基因組測(cè)序技術(shù)，能夠?qū)Λ@取腫瘤細(xì)胞進(jìn)行更為準(zhǔn)確和深入分析，了解癌細(xì)胞基因怎樣突變，以及腫瘤起源、屬于哪種基因型等，為早期檢測(cè)和診療腫瘤和腫瘤個(gè)體化治療提供指導(dǎo)。而基因分析是個(gè)體化醫(yī)療前提，所以個(gè)體化基因測(cè)序技術(shù)發(fā)展能夠驅(qū)動(dòng)著個(gè)體化醫(yī)療進(jìn)程。基因組測(cè)序基本原理分解第51頁(yè)乳腺癌患者全基因組測(cè)序年歐洲內(nèi)科腫瘤學(xué)會(huì)（ESMO）研究者首次完成了對(duì)個(gè)體乳腺癌患者全基因組測(cè)序以期制訂個(gè)體化治療大型臨床試驗(yàn)。截至年9月23日，共有 402名乳腺癌患者已經(jīng)完成了這項(xiàng)檢測(cè)，還有26名患者分析正在進(jìn)行中。276名患者得到了基因組檢測(cè)結(jié)果，其中248例進(jìn)行了完整全基因組分析。 Andr博士說(shuō)，在172例患者中發(fā)覺(jué)了一個(gè)能作為抗腫瘤藥品靶點(diǎn)基因組改變。有趣是，20%患者表現(xiàn)出一個(gè)罕見和意料之外基因組改變，這就愈加突顯了全基因組測(cè)序主要性。