1、YUNNANNDRMALUNIVERSITY本科學生綜合性實驗報告學號姓名黃秀敏學院專業、班級應生B班實驗課程名教師及職稱開課學期2011至2012學年下學期填報時間2011年12月4日云南師范大學教務處編印、試驗設計方案實驗序號五實驗名稱I人類淋巴細胞株培養實驗時間2011年11月1日至22日實驗室生物綜合實驗室1實驗目的能獨立地進行用于細胞培養的個中器皿的清洗與消毒，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作，了解化學消毒法的使用方法。練掌握RPMI1640培養基的配制方法。熟練掌握細胞傳代培養的操作方法。觀察外培細胞在不同時期的形態變化及生長狀況。掌握死活細胞的鑒別原理及方法。實驗原理

2、、實驗流程或裝置示意圖實驗原理：清洗與消毒是組織培養實驗的第一步，是組織培養中工作量最大，也是最基本的步驟。體外培養細胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對清潔和無菌操作的要求程度很高。細胞培養不好與清洗不徹底有很大關系。滅菌手段的選擇也十分重要，對不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對，即使達到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養價值、生物學特性或其他使用價值也不行。細胞培養使用的培養基一般是由合成培養基和小牛血清配制而成。合成培養基有商品出售，它是根據細胞生長的需要按一定配方制成的粉狀物質。其主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子和其他輔助物質。它的酸堿度和滲透壓與活體內細胞外液相似

3、。小牛血清含有一定的營養成分，更重要的是它含有細胞生長所必需的生長因子；酶、微量元素和激素；保護作用；提供伸展和貼附因子等，是合成培養基所無法替代的。此外它還能中和有毒物質（重金屬、抗菌素）的毒性。L-谷氨酰胺:氨基酸是組成蛋白質的基本單位。不同種類的細胞對氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養基提供，這幾種氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細胞合成核酸和蛋白質必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡。因此，各種培養液中都有較大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定，應置于-20C冰箱中保存，在使用前加入培養液內。細胞傳代培養：當原代培養細胞或細胞

4、系細胞增殖達到一定密度后（一般形成致密單層），則需要做再培養。即將培養的細胞分散后，以適當比例轉移到另一個或幾個容器中擴大培養，此過程為傳代培養。一般將傳代培養的累積次數作為傳代細胞的代數。懸浮型細胞培養常見于淋巴細胞、白血病細胞、骨髓瘤細胞和腹水型惡性細胞等的培養。由于這類細胞或細胞集體可懸浮在液體培養基中，而不附著在固體表面上，因此無論原代培養或傳代培養的細胞增殖過程都沒有貼附性細胞那種明顯可辨的3個變化階段，其培養的可見效果是細胞數目的增多及溶液中細胞濃度和密度的加大。懸浮型細胞傳代培養的最大特點是原代細胞不必經過機械分離或消化酶消化處理,傳代時只須把培養的懸浮細胞做適度稀釋或把培養細胞

5、經簡單的離心處理后再加入適量的培養液即可培養。因此，細胞在從原代到傳代的轉變過程中遭受的機械損傷和化學損傷的可能性較少，損傷程度也較輕，相對而言，傳代的成功率較高。細胞的存活率是反映細胞群體生活狀態的重要指標。多種方法可以鑒別細胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。許多酸性物質不容易穿過活細胞的質膜進入胞內，卻能滲入死亡的細胞內，使其著色，以次來區別死活細胞。試驗流程：細胞培養準備工作（清洗、消毒、滅菌）|k培養基的配制細胞傳代死活細胞的鑒別實驗設備及材料儀器：超凈工作臺、干燥箱、過濾器、超凈工作臺、多重蒸餾水器、磁力攪拌器、天平、微量加樣器(移液槍)倒置顯微鏡、光學顯微鏡、高壓滅菌鍋、蒸餾水

6、器、超低溫冰箱二氧化碳培養箱材料：微孔濾膜(直徑25mm)、孔徑為0.22um、細胞培養瓶、量筒、研缽、燒杯、漏斗、濾紙pH試紙、微孔過濾器(0.22“m)、注射器、各種規格的Tip、離心管血球計數板、滴管、培養細胞、人類淋巴細胞株試劑：75%酒精、重鉻酸鉀、濃硫酸、NaOH、HCl、酚紅RPMI1640干粉、小牛血清、青霉素、鏈霉素、NaHCO3、L-谷氨酰胺三蒸水0.4%臺盼藍溶液臺盼藍(染料)、乙醇實驗方法步驟及注意事項方法步驟細胞培養準備工作：清洗新玻璃器皿的清洗：先用自來水刷洗，再浸泡5%稀鹽酸中和玻璃表面的堿性物質和有害物質。使用過的玻璃器皿的清洗立即進入清水，避免干涸難洗；用洗滌

7、劑清洗玻璃器皿，自來水清洗數遍，倒置自然干燥；浸酸性洗液過夜；從洗液撈出自來水沖洗1015次去除酸性洗液，蒸餾水刷洗10次，倒置烘干；包裝(牛皮紙或不透水紙)；高壓(15磅20min)或干熱(160度2h)滅菌；備用。膠塞處理新膠塞應先用清水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸1020min。自來水清洗10次用1%稀鹽酸浸泡30min。自來水清洗10次，蒸餾水刷洗10次。晾干舊膠塞不必用酸堿處理可直接用洗滌劑煮沸清洗數次，過蒸餾水，晾干，包裝高壓滅菌，可使用。塑料制品的清洗用洗滌劑清洗，自來水沖洗數遍強(次強)酸洗液浸泡26h.自來水沖洗10次以上，蒸餾水刷洗10次浸泡在70%乙醇0.51h,備用

8、。用前從乙醇中取出，在超級工作臺內紫外線照射1h。Tip和Tube的清洗新的國產Tip和Tube如用于非RNA提取時可用蒸餾水刷洗，晾干，高壓滅菌后使用。用于RNA提取時，用蒸餾水刷洗后再用DEPC水(抑制RNA酶)浸泡過夜晾干，高壓滅菌后使用。使用過的Tip和Tube用后浸泡在0.2mol/LNaOH或0.2mol/LHCl溶液中，清水洗過，自來水清洗10次晾干，進洗液224h。晾干，放入飯盒高壓滅菌，備用。（五）洗液的配制常用的洗液是硫酸-重鉻酸鉀溶液。洗液可根據需要配制不同的濃度成分強酸洗液次強酸洗液重鉻酸鉀63g3150g120g6000g濃硫酸1000ml50000ml200ml10

9、000ml蒸餾水200ml10000ml1000ml50000ml配制方法：（1）將重鉻酸鉀放入大燒杯中，加入蒸餾水放在石棉網上加熱至沸騰并攪拌，使重鉻酸鉀充分溶解。（2）將重鉻酸鉀倒入酸缸中，然后緩慢加入濃硫酸并用一長玻璃棒不斷攪拌，充分溶解。注意：操作時注意安全，穿戴好耐酸手套和圍裙，防止洗液飛濺到衣物皮膚上，不慎飛濺到皮膚應立即用大量清水沖洗。（六）消毒和滅菌（1）射線消毒滅菌主要使用X、60C。進行消毒滅菌，用于牛血清或塑料制品。（2）紫外線消毒一般用無臭氧型紫外燈。一般20min,71%細菌消滅；40min后79%細菌消滅，60min后86%細菌消滅。紫外線照射時間照射再長也不能10

10、0%滅菌，最多只能達到90%。（3）干熱滅菌主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細胞培養的器皿放入干燥箱內，加熱至160度，保溫90120min。用于RNA提取實驗的用品則需要180度，保溫58h.（4）濕熱滅菌也稱高壓蒸汽滅菌，是最有效的一種滅菌方法。主要應用布類、橡膠、金屬器械、玻璃器皿、塑料以及加熱后不發生沉淀的無機溶液。（5）濾過滅菌用于培養用液和各種不能高壓滅菌的溶液。（七）化學消毒法（1）70%（75%）酒精消毒（2）0.1%新潔爾滅消毒（3）來蘇兒水消毒（4）0.5%過氧乙酸消毒（5）乳酸蒸汽消毒（6）37%甲醛加高錳酸鉀消毒（7）煮沸消毒培養基的配制（一）準備（清洗與滅菌）（二）合成

11、培養基的配制1%酚紅：配制0.1mol/LNaOH100ml。稱量1g酚紅于研缽中，取30ml0.1mol/LNaOH逐漸加入研缽中，盡量研細，然后過濾。過濾后的酚紅液加三蒸水至100ml。4C保存。飽和NaHCO3的配制：v稱取10g的NaHC03溶于200ml三蒸水中，滅菌后分裝于50ml試劑瓶。4C保存。RPMI1640培養液配制：配制50mlRPMI1640培養液：每組稱取RPMI1640干粉0.52g，溶于50ml的三蒸水。置于攪拌器上攪拌20min,直到液體變為澄清為止。RPMI1640合成培養基配制：v加入0.1ml1%的酚紅，通入CO2，使液體變為金黃色，說明培養基完全溶好。配

12、制好的培養基，用時用飽和NaHCO3液調節pH至687.0。溶好以后的培養液在超凈臺中進行0.22pm濾過除菌，分裝至細胞培養瓶中。瓶口封好，-20C或4C貯存。小牛血清的處理新買的新生小牛血清一定要滅活。將買來的新生小牛血清不開封置于水浴鍋中56C，30min,期間要不時輕輕晃動，使受熱均勻，防止沉淀析出。處理后的血清貯存于4C。(四)生長培養基的配制雙抗：(100000U/ml)v160萬單位青霉素/瓶+8ml3DW=20萬單位/ml1g鏈霉素+5ml3DW=200000pg/ml各取以上的液體5ml混合，使其濃度為10萬單位/ml，0.22pm過濾至1.5ml離心管，-20C貯存。谷氨酰

13、胺儲備液(200mmol/L)：v1.5g的谷氨酰胺溶于50ml三蒸水中(30mg/ml=200mmol/L),0.22pm過濾至1.5ml離心管中。-20C貯存。RPMI1640生長培養基的配制50毫升儲備液濃度終濃度RPMI1640培養液44.5谷氨酰胺0.530mg/ml0.3mg/ml雙抗0.05100000u/ml100u/ml小牛血清510%細胞傳代選取擬作傳代培養的樣本，取0.5mL細胞懸浮液加入等量臺盼藍染液，混勻后用血球計數板計算細胞的成活率。如果樣本成活率高，無污染即可用于傳代。用彎頭吸管將原代培養瓶內的細胞吹打均勻，注意將那些半貼壁生長的細胞吹打脫離以免在移換容器時丟失。

14、把細胞懸液吸入無菌離心管中，塞緊反口橡皮塞以防止空氣污染，用1000r/min離心5min。吸去上清夜，加入適量的培養液，用吸管打勻制成細胞懸液。重復步驟1,計算細胞數，加入適量培養液把最終細胞數調節至1X1053X105個/mL。把細胞懸浮分裝至新備的細胞培養瓶中，置于37C二氧化碳培養箱中繼續培養。具體操作：每小組先用一個培養瓶配制50ml的生長培養基每人取10ml培養基到自己的細胞培養瓶內然后向細胞培養瓶內接種400ul的人淋巴細胞株原液放入二氧化碳培養箱，旋松瓶蓋根據細胞的數量看細胞瓶是否平放或直立放置觀察死活細胞的鑒別取20ul細胞懸液放入干凈的離心管中，加入等體積的0.4%的臺盼藍

15、染液混合，放置lmin。取一干凈的血球計數板，蓋上蓋片，從蓋片兩邊滴入細胞懸液使之充滿計數板和蓋片之間。注意滴液勿有氣泡，也不能太多，否則會使蓋片浮起而是細胞計數不準。低倍鏡下觀察，活細胞不著色，臺盼藍著色的細胞呈深藍色，是不健康或已死亡的細胞，不能計數。找出計數板上的方格，計算四角大格內總的細胞數，壓著大格線者只計左側或上方，不計右側或下方。結果記錄計算：每毫升原液細胞數=4大格細胞總數/4X10000X稀釋倍數細胞存活率（）=（細胞總數-死細胞數）/細胞總數血球計數板的分區與分格1大格=16中格1大格=25中格=16X25小格=25X16小格=400小格=400小格每個大方格邊長為1mm,

16、則每個大方格面積為1X1=1mm2。蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間高度為0.1mm,所以每個計數室的體積為0.1X1X1=0.1mm3lml=1000mm3每個大格有400個小格，所以每個小方格體積為0.1/400=l/4000mm3=l/4000,000ml注意事項1、首次傳代的細胞因需適應新的環境，可適當增加其接種量，以促進其生存與增殖。2、在對細胞進行吹打時，不要用力過猛，盡量不出現氣泡，以免損傷細胞。3、傳代培養的過程較長，細胞被污染的可能增加，因此，必須嚴格進行無菌操作。4、注意控制細胞濃度。5、沉淀后的小牛血清不能再使用。6、在供給細胞存活所必需的條件中，除適量的水、無機鹽、氨基

17、酸、維生素、葡萄糖及其有關的生長因子、氧氣、適宜的溫度以外，注意外環境酸堿度和滲透壓的調節。7、小牛血清一定要滅活，除去補體和支原體等有毒物質。可用51C水浴滅活，但不能用高壓鍋或紫外線消毒。5、實驗數據處理方法Spssl7.0中文版單因素方差分析6、參考辛華主編.現代細胞生物技術.北京：高等教育出版社，2009.129138章靜波等主編.細胞生物學實驗技術.北京：化學工業出版社，2006.6370丁勇，許瑞安主編.細胞生物技術實驗指南.北京：化學工業出版社，2009.124130丁明孝等主編.細胞生物學實驗指南.北京：高等教育出版社，2009.83865安利國，邢維賢主編.細胞生物學實驗教程

18、.北京：科學出版社，2010.6465二實驗報告1、實驗現象與結果淋巴細胞是一種懸浮型生長細胞，在培養過程中幾乎不貼附于支持物上，而成懸浮狀態生長。在實驗現象上，沒有貼附性細胞那種明顯可辨的3個變化階段，其培養的可見效果是細胞數目的增多及溶液中細胞濃度和密度的加大，在原淋巴細胞團的周圍可見新生細胞長出。在倒置顯微鏡下，可以觀察到淋巴細胞在實驗培養下，明顯地增多。其生長過程分為四個期：游離期、繁殖期、維持期、衰退期。鏡檢，從培養箱中取出的培養液變黃，在光學顯微鏡下，可見淋巴細胞呈球狀，死細胞或不健康的細胞被染成藍色，活細胞不被染色。2.對實驗現象、實驗結果的分析及其結論實驗現象及結果的分析（一）

19、在淋巴細胞培養過程中，細胞逐漸增多培養液變黃并出現了四個生長期有以下解釋：游離期：淋巴細胞在原培養瓶中加以分離，經稀釋后接種到新的培養瓶中，由于原生質收縮和表面張力以及細胞膜的彈性，細胞呈圓形，折光性強，懸浮狀態。繁殖期：淋巴細胞在豐富的營養狀態下，快速生長、分裂，形成細胞島直至單層。細胞透明，顆粒少，細胞之間界限清楚。維持期：細胞形成單層后，生長與分裂減緩，折光性減弱，細胞內顆粒增多，由于代謝物的積累，C02增多，培養液變黃。衰退期：由于營養缺乏、代謝物積累，細胞內顆粒進一步增多，立體感變差，細胞皺縮，細胞開始衰老直至死亡。（二）死細胞或不健康的細胞質膜已經失活或活性變差，質膜通透性變強，染

20、液由此進入細胞內，使得細胞被染成藍色。而活細胞質膜具有很強的選擇透性，染液不易滲入細胞內，故不被染色呈透明狀。三)相關器皿的清洗方法及注意事項器皿種類清洗步驟新玻璃器皿先用自來水刷洗，再浸泡5%稀鹽酸中和玻璃表面的堿性物質和有害物質。從洗液撈出自來水沖洗1015次去除酸性洗液，蒸餾水刷洗10次，倒置烘干；(3)包裝(牛皮紙或不透水紙)；高壓(15磅20min)或干熱(160度2h)滅菌；備用。舊玻璃器皿(1)立即浸入清水，避免干涸難洗；(2)用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來水清洗數遍，倒置自然干燥；(3)浸酸性洗液過夜；(4)從洗液撈出自來水沖洗1015次去除酸性洗液，蒸餾水刷洗10次，倒置烘干；(5)包裝(牛皮紙或不透水紙)；高壓(15磅20min)或干熱(160度2h)滅菌；備用。注意：在刷洗過程中，不留死角。浸泡時，器皿要充滿清潔液，勿留氣泡。膠塞(1)新膠塞應先用清水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸1020min。自來水清洗10次用1%稀鹽酸浸泡30min。