1、核酸雜交檢測(cè)技術(shù)根本原理是堿基互補(bǔ)的二條單鏈核酸退火形成雙鏈。用于診斷目的的雜交雙方是序列的病毒探針和待 (一) 建立雜交體系 有較高的技術(shù)要求。了解各種組份及反響條件對(duì)雜交的影響是建立雜交體系,獲得抱負(fù)結(jié)果的根底。 1、溫度雜交反響中,雙鏈核酸的變 性與復(fù)性主要是溫度把握的。選擇適當(dāng)?shù)碾s交和洗膜溫度是試驗(yàn)成敗最關(guān)的因素之一。雜 交反響通常在低于解鏈溫度(T m)1525的條件下進(jìn)展。T m(G+C) pH 下,DNA6850%變性劑甲酰胺, 則在 42進(jìn)展。 2、pH雜交體系的pH59pH6 5 7 5 之間進(jìn)展。較高的pH的雜交條件。 3、鹽離子濃度 體 系 中往往參加單價(jià)離子的鹽,由于單

2、價(jià)陽(yáng)離子與核酸鏈上的磷DNA6SSC(1SSC015mol/LNaCl0015mol/LpH7緩沖 性劑是甲酰胺。 5、DNA 濃度 濃度愈高,復(fù)性速度愈快。所以雜交反響中應(yīng)參加足夠的探針,還應(yīng)盡量減cm225ml 6DNA長(zhǎng)度的平方根成正比。所以用長(zhǎng)的 探針可獲得高的復(fù)性率。但原位雜交通常用較短的探針,以削減探針進(jìn)入細(xì)胞并集中到 靶核酸的阻力。 7、硫酸葡聚糖 DNA 探針分子1010100糖可能導(dǎo)致背景加深,所以一般在探針濃度過(guò)低的狀況下才使用。 8、雜交時(shí)間 它受探針的長(zhǎng)度與濃度、反響積等因素的影響,較短的探針、較高 的探針濃度和較小的雜交體積,需要較短的雜交時(shí)間。一般來(lái)說(shuō),雜交216

3、9、預(yù)雜交 DNA DNA(鮭魚精子DNADNA)和大分子化合物(聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、脫脂奶粉等)。 10、堿基 錯(cuò)配 雜交中堿基錯(cuò)配將明顯提高T m15的溫度雜交。 11、漂洗 雜交后的漂洗是削減非特異雜交,降低本底的關(guān)鍵步驟。通常用較低鹽濃度(0SSC68)漂洗雜交膜。 (二) 核酸打點(diǎn)雜交 1、操作步核酸打點(diǎn)雜交是最常用的一種雜交檢測(cè)方法,是作為診斷 目的的首選方法。它是將肯定量的病毒核酸(DNARNA(DNA探針進(jìn)展雜交,雜交后通過(guò)放 射自顯影(檢測(cè)放射性探針)或顯色反響(檢測(cè)非放射性探針)檢測(cè)雜交信號(hào)。裁剪一張大小適度的硝酸纖維素膜(NC20SSC30取變性的病毒核

4、酸(DNA 或RNA)15lNC 膜上,同時(shí)點(diǎn)上探針同源核 酸(作為陽(yáng)性比照)和非同源核酸(作為陰性比照);將點(diǎn)樣的NC8026 倍SSC,0 1%十二烷基肌氨酸鈉,0 6846100cm 2 膜用至少20ml將膜用雜交液(預(yù)雜交液中參加2080ng/ml 變性的探針) 于1216100cm 22 5ml2 倍SSC,0 1%SDS2680 1SSC,0 1%SDS215假設(shè)進(jìn)展放 射自0 1 倍SSC下操作(以地高辛顯色為例);100 mmol/L TrisHCl,pH7 5, 150mmol/L NaCl;100cm220ml30;10 重復(fù)的洗滌二15;11膜在100mmol/L Tri

5、sHCl,pH9 5, 100mmol/L N aCl,50mmol/L MgCl 22暗中顯色,當(dāng)要求的點(diǎn)顯出顏色時(shí), 可用TE 2、操作說(shuō)明 (1)從感染的動(dòng)物組織血NC (2)點(diǎn)5 l,假設(shè)樣品中核酸含量很低,可在上一次點(diǎn)樣枯燥后在同一點(diǎn)重復(fù)點(diǎn) 樣。也可用多孔抽濾加200 l(3NC 膜外,也可用尼 龍膜載樣;(4)樣品或探針是RNase 處理,而且操作要嚴(yán) 格,雜交后可以不必如此要求;(5)預(yù)雜交液配方多種多樣。作者閱歷說(shuō)明,上述預(yù)雜交 液簡(jiǎn)潔配制,可用于放射性和非放射性標(biāo)記的DNA (三) 核 酸酶保護(hù)分析法 RNARNA酶(S1,RNA酶AT1被保護(hù))的雙鏈雜交體。與 Northe

6、rn 分析法相比,核酸酶保護(hù)分 析法不需要固相支持膜,所以操作簡(jiǎn)便,雜交RNA/10RNA。核酸酶保護(hù)分析法對(duì)RNARNA,即使輕度降解,也 不影響檢測(cè)結(jié)果。承受的探針通常是單鏈的、但必需完全均一的DNARNADNA 探針通常承受M13噬菌體系統(tǒng),摻入同位素標(biāo)記的一種dNTP 1、RNA保護(hù)分析法(RNase protection assay, RPA) RNA,DNA/RNARNAA 和T1,它們專一性地水解未形成雜交體的單鏈RNA,而探針與被檢雜交后形成的雙鏈 RNA 15 個(gè)RNA5 lRNARNA0 150 g),置冰浴;25 l(80%去離子化甲酰胺,0 4 mol/L NaCl,

7、40 mmol/L PIPES, 4,1 mmol /L EDTA, pH8 5)RNA1105 cpm), 混勻并離心;9534250水浴中雜交過(guò)夜(1216 hr);300 l RNA(300mmol/LNaCl, 10mmol/L TrisHCl,pH7 4, 5mmol/L EDTA, pH7 5, 20 g/ml R NA 酶T 1, 40 g/ml A),373020 l 10% SDS,10 l 10mg/m l 蛋白酶K,3730;2 l10mg/ml 酵母tRNA;酚/10 l(80%甲酰胺,10mmol/LEDTA, pH80,01%二甲苯蘭FF,01%溴酚蘭)溶解;95變

8、性358mol/L尿素變性聚丙 烯酰胺凝膠中電泳分別。最終放射自顯影,判定結(jié)果。 2、S 1 核酸酶保護(hù)分析法 此方法類似于RPA,只是所用的探針是單鏈DNA(一般不用雙鏈DNA的酶是S 1DNA 或RNA,而RNA/DNA 雜交體則被保護(hù),操作過(guò)程如下:取0 5 150ng 樣品RNA30 lRPA);1105cpmDNA探針 ;95352水浴過(guò)夜;300 l 冰預(yù)冷的S 1(028mol/LNaCl,005mol/L 乙酸鈉,pH45,45mmol/LZnSO4,1000/ml S 1),37水浴30參加75 l(25mol/L乙酸胺, 50mmol/L EDTA), 2 l10mg/ m

9、l 酵母RNA;10 l953 (四) 核酸原位雜交所謂 原位量極低的靶序列有較高的敏感性。原位雜交是可以用于病毒感染檢測(cè)的另一方法。它能檢測(cè)細(xì)胞中病毒核酸復(fù)制與表達(dá)以及病毒的傳播,并對(duì)細(xì)胞中的病毒核酸進(jìn)展定位;它能鑒定感染細(xì)胞中病毒基因的整合以及染除了必需對(duì)組織細(xì)胞進(jìn)展的效果,所以用于核酸原位雜交的固定液必需:理化 性質(zhì)穩(wěn)定;能很好保持細(xì)胞形態(tài)的完整;對(duì)核酸無(wú)修飾和降解作用,并維持其在細(xì)胞內(nèi)的 定位;不阻礙探針與靶核酸的雜交,不引起雜交本底過(guò)高。符合4%多聚甲醛最為常用。病毒單鏈 RNA 原位雜交的根本方法如下:將組織切片附于清潔的無(wú)核酸酶污染的載玻片上,或取2 34%穎配制的多聚甲醛(PBS20,PBS不同濃度(30%,60%,80%,95%,100%)100%乙醇中,-20保存?zhèn)溆?1 g/ml 蛋白酶K01mol/L TrisHC l, pH80,50mmol/L EDTA),3730;依據(jù)探針和被檢核 酸性質(zhì),選擇適當(dāng)?shù)念A(yù)雜交