1、關(guān)于鼠疫檢測新技術(shù)新方法第一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一、核酸檢測技術(shù) （PCR檢測）二、標(biāo)記檢測技術(shù)（ELISA，膠體金）第二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一、核酸檢測技術(shù)定義：對動(dòng)植物、微生物的基因序列進(jìn)行測定。 核酸的分離與純化內(nèi)容： 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù)) 核酸雜交技術(shù)第三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月核酸的純化與分離目的：獲得完整的核酸一級結(jié)構(gòu)，并提高核酸純度。 破碎細(xì)胞（細(xì)菌） 技術(shù)流程 核酸提取 核酸純化第四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月材料的前處理細(xì)胞破碎，核酸釋放核酸分離、純化沉淀或吸附核酸，去除雜質(zhì)核酸溶解緩沖液第五

2、張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月全自動(dòng)核酸、蛋白提取儀第六張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR技術(shù)） 簡史： 1971年，Khorana提出：DNA變性后，與合適引物進(jìn)行雜交，在DNA聚合酶作用下，延伸引物，并不斷重復(fù)該過程，即可克隆tRNA基因。 1985年，Mullis等人 發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）， 隨后，Mullis所屬公司PE推 出第一臺PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀。第七張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基本原理：第八張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基本步驟第九張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第十張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于

3、2022年6月實(shí)時(shí)定量PCR儀PCR儀第十一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月凝膠成像系統(tǒng)凝膠電泳系統(tǒng)第十二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR結(jié)果判定（凝膠電泳）第十三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR類型： 1.多重PCR 2.巢式PCR 3.定量PCR 4.反向PCR 5.逆轉(zhuǎn)錄PCR第十四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR技術(shù)在鼠疫檢測中的應(yīng)用鼠疫菌PCR檢測法： 從疑似鼠疫的標(biāo)本（全血、組織）中檢測鼠疫菌，以鼠疫菌fra和pla基因片段作為PCR擴(kuò)增目的片段。鼠疫判定標(biāo)準(zhǔn)： PCR擴(kuò)增（fra + pla） + 膠體金抗原檢測 or 酶

4、聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) or反相血凝試驗(yàn) = 確診鼠疫第十五張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月鼠疫菌核酸檢測樣本處理樣本類別1.鼠疫菌培養(yǎng)物2.鼠疫病人血液、痰液或尸檢標(biāo)本3.自斃或捕獲動(dòng)物血液或組織臟器（肝臟、脾臟等）4.媒介昆蟲第十六張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月樣品處理方法1.煮沸法2.DNA提取試劑盒3.CTAB法4.氯仿抽提法第十七張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第十八張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月鼠疫菌PCR檢測反應(yīng)體系10 x bufferdNTPsFra-F（5-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3）Fra-R（5-ACCTGCTGC

5、AAGTTTACCGCC-3）Pla-F （5-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3）Pla-R （5-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3）Taq聚合酶待檢測模板（基因組DNA）去離子水第十九張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月鼠疫菌PCR檢測反應(yīng)程序預(yù)變性95 5min 1個(gè)循環(huán)變性95 1min退火72 1min延伸72 1min變性72 5min30個(gè)循環(huán)第二十張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 M 1 2 3 4 5 6內(nèi)參基因 Pla Fra鼠疫PCR檢測電泳結(jié)果判定陽性結(jié)果：內(nèi)參基因+Pla+Fra陰性結(jié)果：內(nèi)參基因第二十一張，PPT

6、共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月核酸雜交技術(shù) 待檢測DNA或RNA先轉(zhuǎn)移并固定到硝酸纖維素或尼龍膜上，與其互補(bǔ)的單鏈DNA或RNA探針用放射性或非放射性標(biāo)記。在膜上雜交時(shí)，探針通過氫鍵與其互補(bǔ)的靶序列結(jié)合，洗去未結(jié)合的游離探針后，經(jīng)放射自顯影或顯色反應(yīng)檢測特異結(jié)合的探針。第二十二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、標(biāo)記檢測技術(shù)標(biāo)記技術(shù)：用標(biāo)記物質(zhì)熒光素、同位素或酶等示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體（或抗原）進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)。通過測定標(biāo)記物-抗原-抗體復(fù)合物來定性或定量的檢測標(biāo)本中的抗體或抗原。第二十三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)記檢測特點(diǎn)：標(biāo)記免疫技術(shù)=免疫技術(shù) + 標(biāo)記技術(shù)抗原抗

7、體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點(diǎn)：高特異性、高靈敏性第二十四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月鼠疫標(biāo)記檢測技術(shù)ELISA膠體金第二十五張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISA技術(shù)原理：1.使抗原或抗體結(jié)合到到某種固相載體表面,并保持其免疫活性.2.在測定時(shí),把受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面抗原抗體反應(yīng).3.用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分開,最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)量成一定比例.4.加入底物,通過顏色變化來測定.第二十六張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISA的類型：間接法第二十七張

8、，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月雙抗夾心法第二十八張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISA技術(shù)在鼠疫檢測中的應(yīng)用1.檢測鼠疫F1抗原（or抗體）原理：以雙抗體夾心法測定F1抗原為例。采用F1抗體包被反應(yīng)板，加入待測標(biāo)本，反應(yīng)除去未結(jié)合物質(zhì)，加入HRP-F1MCAb，如待測標(biāo)本中含有F1抗原時(shí)就與包被F1抗體、HRP-F1抗體結(jié)合形成復(fù)合物，加入OPD底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，反之就無顯色反應(yīng)。所需試劑及器材：HRP-F1McAb凍干劑，F(xiàn)1McAb包被板，鼠疫F1陽性對照、陰性對照，PBS（稀釋液）,顯色液（鄰苯二胺），終止液（2M硫酸）。ELISA檢測工作站，ELISA洗板機(jī)、振

9、蕩器等第二十九張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISA結(jié)果判讀：1.目測：平持反應(yīng)版，距白色背景5-10cm，從板的正上方觀察。（+）深黃棕色；（+） 淺黃棕色；（+） 顏色明顯可見；（-） 無色或顏色很淺2.ELISA檢測工作站 標(biāo)本OD/陰性O(shè)D2.1位陽性。 第三十二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISA操作注意事項(xiàng)：（一）加樣 加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在Elisa板孔的底部，避免加在孔壁的上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。 加標(biāo)本一般用微量加樣器，每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸頭

10、，以免交叉污染。（二）保溫 在Elisa中一般有二次抗原抗體反應(yīng)，此時(shí)反應(yīng)的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定的要求，保溫容器最好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。 為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，或?qū)⑵桨逯糜跐窈兄小５谌龔垼琍PT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）洗滌 洗滌的目的是吸取反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌一般采用以下方法：1、吸干孔內(nèi)反應(yīng)液。2、將洗滌液注滿孔板。3、放置3分鐘，略作搖動(dòng)。4、吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干，洗滌次數(shù)3-4次，又是需洗5-6次。（四）顯色和比色 顯色的最后一部是溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物，反應(yīng)溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素，在定量測定中加入底物后的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確，而在定性測定中，可根據(jù)顯色程度適當(dāng)提高溫度，或者適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時(shí)間。第三十四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月膠體金檢測技術(shù)：原理：將F1-McAb抗體以條帶狀固定在NC 膜上，膠體金標(biāo)記F1-McAb吸