1、ICS65.105ICS65.105B50 備案號：DB天 津 市 地 方 標 準DB12/T 1782003對蝦弧菌病(Vibriosis)的檢疫規程The Quarantion Istruction for Penaeus Vibriosis2004-01-01 實施2003-11-25 2004-01-01 實施天津市技術監督局發布DB12/T 1782003DB12/T 1782003本標準的附錄A、附錄B為資料性附錄。 本標準由天津市水產局提出。本標準由天津市水產局歸口。本標準起草單位：天津市水產研究所本標準主要起草人：李秀梅、付志茹、趙燕超 本標準于2003年11月發布DB12/T

2、 1782003DB12/T 1782003 對蝦弧菌病（Vibriosis）的檢疫規程1范圍本標準規定了對蝦弧菌病的檢疫規程。本標準適用于天津地區對蝦弧菌病的檢疫，也適用于我國國內地區間同種疫病的檢疫、診斷。2規范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的 修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究 是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB4789. 128食品衛生檢驗方法微生物學部分GB/T 6682-1992分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T

3、180882000出入境動物檢疫釆樣SN0173出口食品副溶血弧菌檢疫方法3準備3.1設備和儀器設備和儀器見附錄A。3.2培養基和試劑培養基和試劑的配制方法見附錄B。4采樣4.1采樣數量對無癥狀的蝦體釆樣：按照GB/T 18088-2000的規定執行。對有癥狀的蝦體，隨機挑取不少于10 尾有發病癥狀的新鮮或瀕死的個體。4.2采集部位懷疑有病原存在的組織或器官。5實驗室用水要求按照GB/T 6682-1992的規定執行。6臨床癥狀患病的幼蝦行動遲緩、體表或附肢上易粘附臟物，眼球腫脹，由黑變褐，隨后潰爛脫落，僅留眼柄。 肝胰腺組織及血淋巴液中有大量弧菌。被感染的成蝦，身體消瘦，甲殼與肌肉間空隙加大

4、，頭胸甲的心 區上方成白色或淡桔紅色，附肢發紅，病重個體呈鮮紅色（紅腿病重者有的出現爛離）血淋巴液中弧菌 很多。7實驗室檢驗7.1取樣針對患病的對蝦，眼部潰爛或紅肢或爛觥，直接用接種環無菌操作，從病灶取樣在TCBS培養基上劃 線接種；如果病灶不明顯，用75%酒精棉球擦凈被檢蝦體表，揭開頭胸甲，用接種環無菌操作，從肝胰 腺及血淋巴液中取組織塊放在TCBS培養基上，輕壓組織塊，在培養基上劃線接種。7.2培養倒置TCBS平皿，37C恒溫培養24小時后，分別挑選不同顏色、大小和形狀的單個菌落，轉接到普通 瓊脂平板培養基上進一步分離純化培養。7.3取待檢菌作下列檢驗菌體運動性觀察選厚薄在1. 11. 2

5、mm的干凈載玻片一塊，加一滴無菌水至載玻片上，用接種環挑取待檢菌菌苔少 許，涂抹在水滴中，加蓋玻片用400600倍的暗視野顯微鏡觀察菌體是否運動。菌體染色特性與形態觀察取干凈載玻片一塊，滴12滴無菌水，用接種環挑取待檢菌菌苔少許涂片，干燥后在火焰上通過 三次固定，滴加革藍氏染液，I液染Imin, II液染2min, 液脫色至酒精剛不出現藍紫色為止，IV 液染12min。用油鏡觀察染色特性和形態。氧化酶試驗用滅菌接種環挑取普通瓊脂平板上分離純化培養的待檢菌涂于氧化酶紙片上或直接用紙片沾取菌 落，1020秒鐘觀察結果，陽性為紫紅色，陰性為無色或淡黃色。弧菌科的細菌應為氧化酶陽性，但弧 菌屬中的梅氏

6、弧菌例外，為氧化酶陰性，須予以區別對待。氧化-發酵試驗即（0-F）試驗將被檢菌接種到0-F生化管中，并加滅菌液體石蠟覆蓋培養基液面，約加1cm,然后置滅菌平皿內， 35C培養2448h后觀察結果。如0-F生化管變黃色，則為發酵型細菌。弧菌科的細菌應為發酵型代謝。用弧菌科細菌生化編碼鑒定管GYZ-9V進行檢驗用接種環挑取在普通瓊脂平板上28C培養1824h的菌苔少許，分別加入生化鑒定管:賴氨酸、精 氨酸、鳥氨酸、葡萄糖產氣、蔗糖、甘露醇、水楊昔、6%氯化鈉、枸橡酸鹽中，進行九項生化反應。其 中賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸和氨基酸空白對照管都應加入滅菌液體石蠟覆蓋培養基液面，約加0.5cm, 然后置滅菌

7、平皿內，經35C過夜孵育后，將反應結果記錄在鑒定單上，見表1,并按照所示的方法記取 由反應結果得出的相應編碼，得到一個三位數字，查檢索編碼表，確定鑒定結果。8判定主要致病弧菌的判定見表2。表2主要致病弧菌的判定名稱細菌在 TCBS培養 基上的菌 落顏色菌落形態 光澤菌體運動 情況革藍氏 染色生化管反 應結果血清凝集試驗 按 GB4789. 1 28食品衛生檢 驗方法微生物 學部分進行副溶血弧菌藍綠角圓形，邊緣整齊，濕 潤，稍混濁，半透明， 多數為尖形，半笠狀 直徑24mm活潑陰性依據得到 的相應編 碼査檢索 編碼表不做非0-1群霍 亂弧菌桔紅色或 黃色菌落正圓隆起，周緣光 滑，有光澤，半透明運

8、動活潑 呈穿梭狀陰性同上不凝集0-1群霍亂 弧菌桔紅色或 黃色菌落正圓隆起，周緣光 滑，有光澤，半透明運動活潑 呈穿梭狀陰性同上凝集溶藻弧菌桔紅色或 黃色菌落 隨時間延 長會變為 藍綠色正圓隆起，周緣光 滑，有光澤，半透明活潑陰性同上不做注：表中所列的病原，對海水魚蝦類均有一定的致病力，危害多種蝦類，可使對蝦的幼蝦、成蝦階 段感染發病，幼蝦階段表現為菌血癥，成蝦有爛眼病、紅腿病及爛觥病。凡是在組織器官中檢驗出所列 病原菌的，即判定為弧菌病。附錄A（資料性附錄）設備和儀器顯微鏡（具油鏡和暗視野）、超凈工作臺、恒溫培養箱、培養皿和接種環，以及水生動物檢疫所用 的常規儀器和設備。附錄B（資料性附錄）試劑配制B. 1硫代硫酸鈉-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂（TCBS）培養基： TOC o 1-5 h z 酵母浸膏5. 0g蛋白腺10.0g氯化鈉10.0g檸檬酸鈉10. 0g膽酸鈉（牛膽酸鈉也可）3.0g牛膽代粉（混合膽鹽代替也可）5.0g蔗糖20.0g檸檬酸鐵l.Og瓊脂18.0g漠麝香草酚藍0. 04g麝香草酚藍0. 04g蒸饞水1000ml除指示劑外,將各種成分加熱溶解，調整pH至8. 6后，加入指示劑。此培養基不必高壓滅菌，煮沸12min,待培養基稍涼后傾注平板。（可直接購置商品）B.2革藍氏染液：I、結晶紫酒精飽和