1、結核桿菌H37Ra免疫小鼠后脾淋巴細胞的殺傷活性及免疫機制的研究王利嫻,盧賢瑜,李惠,陽強【關鍵詞】結核桿菌H37Ra;,Ag85B卵白;,小鼠淋巴細胞;,穿孔素;,顆粒酶BStudyntheyttxiityfspleenlyphytesandiuneehanissinieiunizedbyybateriutuberulsisH37RaAbstratAI:TexplrethespeifiyttxiityfspleenlyphytesandtheiuneehanissinieiunizedbyybateriutuberulsisTBH37Ra.ETHDS:Atthevariusinterval(

2、30days,60days)aftertheieereiunizedbyTBH37Ra,BGandPBS,thespleenlyphytesftheiunizedieereusedastheeffetrellshiletheSp2/0ellsexpressingtheseretedprtEinAg85Bereusedasthetargetells,andtheyttxiityfspleenlyphytesintheiunizedieaseasuredbyTTassay.Spleenlyphyteserelletedat60daysafteriunizatinandstiulatedithPPD

3、,andtheexpressinfperfrin,granzyeBnRNAlevelasdetetedbyRTPR.RESULTS:TheyttxiityfspleenlyphytesinthegrupiunizedbyTBH37RaassignifiantlyhigherthanthatfPBSntrlgrup(P005),andslightlyhigherthanthatfBGgrup.TheRNAexpressinfperfrin,granzyeBinH37RagrupandBGgrupassignifiantlyhigherthanthatinPBSntrlgrup(P005);the

4、expressinfperfrinRNAinH37RagrupassignifiantlyhigherthanthatinBGgrup(P005),butthereasnbviusdiffereneithregardttheexpressinfgranzyeBRNAbeteenH37RagrupandBGgrup.NLUSIN:TheyttxiityfspleenlyphytesisenhanedafterieereiunizedbyTBH37Ra,hihayberelatedttheexpressinfperfrinandgranzyeB.KeyrdsTBH37Ra;Ag85Bprtein;

5、spleenlyphyte;perfrin;granzyeB摘要目的:探究結核桿菌H37Ra免疫小鼠后,產生特異性的脾淋巴細胞殺傷活性及其免疫機制。要領:(1)別離以結核桿菌H37Ra、BG和PBS免疫小鼠后第30天及第60天,分散各組小鼠脾淋巴細胞作為效應細胞,以表達Ag85B排泄卵白的Sp2/0細胞為靶細胞,用TT比色法檢測免疫小鼠脾淋巴細胞的殺傷率;(2)在免疫后第60天,小鼠脾淋巴細胞經PPD刺激后,以RTPR法檢測穿孔素RNA及顆粒酶BRNA的表達。結果:(1)結核桿菌H37Ra組脾淋巴細胞的殺傷率顯著高于PBS比擬組(P0.05),略高于BG組;(2)H37Ra組和BG組穿孔素、顆

6、粒酶RNA的表達量均明顯高于PBS組P0.05,H37Ra組穿孔素RNA的表達量明顯高于BG組(P0.05),但顆粒酶BRNA的表達量兩組無差異。結論:結核桿菌H37Ra免疫小鼠后,能加強脾淋巴細胞的殺傷活性,其機制大概與增長穿孔素、顆粒酶B的表達有關。關鍵詞結核桿菌H37Ra;Ag85B卵白;小鼠淋巴細胞;穿孔素;顆粒酶B比年來,由于生齒活動的增長,多重耐藥菌株的盛行,以及結核分枝桿菌TB和HIV的雙重熏染,導致TB的發病率和殞命率大副度進步。而如今惟一獲準利用的卡介苗BG的防范結果又不甚抱負,對差異的人群庇護力差異較大,因此,天下各國加強了對宿主對抗結核桿菌免疫機制的研究。H37Ra是由H

7、37Rv人型結核分枝桿菌尺度毒株屢次傳代后得到的無毒株。國表里文獻報道,H37Ra具有毒力較低、抗原性完備1,2及能充實活化巨噬細胞3,4等長處,因此,結核桿菌H37Ra作為侯選減毒活疫苗具有相對的上風。然而怎樣進步D8+T細胞的特異性殺傷活性,是研制新型抗結核疫苗急迫必要思量的題目。以往結核疫苗的研究中,有關特異性小鼠脾淋巴細胞殺傷作用的研究較比菲薄。Ag85B是結核分枝桿菌的重要排泄卵白,可誘發對TB的庇護性免疫應答。本研究中擬用能表達此目的卵白的Sp2/0細胞為靶細胞,檢測結核桿菌H37Ra免疫小鼠后,誘導機體產生特異性脾淋巴細胞殺傷活性的結果,并從分子程度上檢測穿孔素、顆粒酶RNA的表

8、達,以探究小鼠脾淋巴細胞抗TB熏染的免疫機制。1質料和要領1.1質料攜帶有Ag85B排泄卵白基因的真核表達質粒pTB30,由華中科技大學同濟醫學院微生物教研室范雄林博士奉送,本室保存。結核桿菌H37Ra、BG菌株由本室保存。Sp2/0細胞由重慶醫科大學熏抱病研究所提供。Lipfetaine2000購自美國Invitrgen公司。總RNA提取試劑Trizl購自上海生工公司。RTPR試劑盒購自TaKaRa公司。PPD尺度品購自成都市生物成品研究所。抗Ag85B排泄卵白的多克隆抗體本室制備。HRP標識表記標幟的羊抗鼠IgG及二氨基聯苯胺(DAB)購自北京中杉公司。G418、RPI1640造就液、TT

9、和淋巴細胞分散液,均購自北方同正公司。小牛血清購自GIB公司。SPF雌性57BL/6小鼠,68周齡,質量1820g,購自重慶醫科大學實行動物中央。1.2要領2結果2.1Sp2/0細胞中Ag85BRNA及其卵白表達的檢測1瓊脂糖凝膠電泳闡發:轉染重組質粒的Sp2/0細胞的裂解液在880bp處出現一條顯著的帶,而未轉染重組質粒Sp2/0細胞的裂解液那么無此條帶,表白轉染的細胞中有Ag85BRNA的表達(圖1)。2免疫細胞化學染色檢測:轉染的Sp2/0細胞經G418挑選后,別離用抗Ag85B排泄卵白的多克隆抗體作為一抗和HRP標識表記標幟的羊抗鼠IgG作為二抗,結果表現,Sp2/0細胞中有棕黃色的顆

10、粒,表白其可表達Ag85B排泄卵白圖2。圖1Sp2/0細胞中Ag85BRNA表達的檢測略Fig1AnalysisfAg85BRNAexpressininSp2/0ells1:NntransfetedSp2/0ells;2:Sp2/0ellstransfetedbypTB30;3:DNAarker.圖2Sp2/0細胞中Ag85B卵白表達的免疫細胞化學染色檢測略Fig2DetetinfAg85BexpressininSp2/0ellsbyiunytheialstaining4002.3小鼠脾淋巴細胞殺傷活性的檢測TT比色法檢測表白,免疫后第30天、第60天,H37Ra免疫組和BG免疫組小鼠脾淋巴細

11、胞的殺傷率明顯高于PBS組(P005),H37Ra免疫組的殺傷率略優于BG免疫組(P005,表1)。表1小鼠脾淋巴細胞特異性殺傷率的檢測略Tab1DetetinfthespeifiyttxiityfiespleenlyphytesaP0.05vsPBSgrup;P0.05vsBGgrup.2.4脾淋巴細胞中穿孔素及顆粒酶BRNA的表達RTPR產物的瓊脂糖凝膠電泳表現:H37Ra組和BG組小鼠脾淋巴細胞裂解液中穿孔素及顆粒酶BRNA的表達量均明顯高于PBS組P005。H37Ra組與BG組比擬力,穿孔素RNA的表達量有統計學差異P005;而顆粒酶BRNA的表達量,前者略多于后者但無統計學意義圖3、

12、圖4。圖3小鼠脾淋巴細胞中穿孔素RNA表達的檢測略Fig3DetetinftheperfrinRNAexpressininiespleenlyphytes:DNAarker;1:BGiunizatingrup;2:H37Raiunizatingrup;3:PBSntrlgrup.2.5脾淋巴細胞顆粒酶RNA的表達免疫小鼠脾淋巴細胞顆粒酶基因PR產物的電泳結果見圖4A,基因表達的相對值見圖4B。結果表現H37Ra組和BG組顆粒酶RNA的表達量明顯高于PBS組P005,H37Ra組略高于BG組,但無統計學差異。圖4小鼠脾淋巴細胞中顆粒酶BRNA表達的檢測略Fig4Detetinfthegranzy

13、eBRNAexpressininiespleenlyphytesA:AnalysisfgranzyeBRNAexpressinbyagarsegeleletrphresis.:DNAarker;1:H37Raiunizatingrup;2:BGiunizatingrup;3:PBSntrlgrup.B:TherelativedensityfgranzyeBRNAexpressin.3討論Ag85B是結核分枝桿菌的重要排泄卵白。本研究中以攜帶有Ag85B排泄卵白的真核表達質粒pTB30轉染Sp2/0細胞后,用RTPR法檢測在Sp2/0細胞內有Ag85BRNA的表達。免疫細胞化學染色表白,轉染重組

14、質粒的Sp2/0細胞中有Ag85B卵白表達。接納TT法檢測小鼠脾淋巴細胞特異性殺傷率,此法輕便易行,無需預標靶細胞,與51r開釋法比力相干性好,還可測定淋巴細胞增殖活性和NK細胞活性。本實行表白,以結核桿菌H37Ra和BG免疫57BL/6小鼠后,均可產生Ag85B排泄卵白,從而便可誘導小鼠脾淋巴細胞特異性地殺傷Sp2/0靶細胞,且表現H37Ra組小鼠脾淋巴細胞的殺傷率略優于BG組,提示結核桿菌H37Ra具有較好的免疫原性,免疫57BL/6小鼠后可誘導特異性的細胞免疫應答。檢測脾淋巴細胞中穿孔素、顆粒酶BRNA表達的結果表白,穿孔素RNA的表達量明顯高于BG免疫組,與脾淋巴細胞殺傷活性的結果相符

15、合,其殺傷機制大概與細胞中穿孔素、顆粒酶BRNA表達增長有關。BG不克不及有用刺激D8+T細胞,從而導致個別產生的庇護力有限,外洋文獻報道7,8特異性D8+T細胞對靶細胞的殺傷成效在抗結核分枝桿菌熏染中具有緊張的作用。本研究未分散D8+T細胞,但其結果為結核疫苗的研制提供了必然的實行根據。參考文獻:1styS,usinsD,BrinkanJ,etal.GenideletinssuggestaphylgenyfrtheybateriutuberulsisplexJ.JInfetDis,2002,186(1):74-80.2DhianN,KhullerGK.Iunreativityfpeptide

16、sgeneratedbyliitedprtelysisf71kDaellallprtEinfybateriutuberulsisH37RausingPLGirpartilesJ.LettApplirbil,2000,30(5):345-350.3Sank,Satk,San,etal.parativeprfilesfintraarphagebehavirfybateriutuberulsisandybateriuaviuplexithdifferentlevelsfviruleneJ.irbilIunl,2002,46(7):483-486.4陶昆,盧賢瑜.H37Ra皮內接種對巨噬細胞的激活效應J.中國人獸共患疾病學報,2022,22(3):232-235.5范雄林,徐志凱,白光春,等.結核桿菌Ag85B基因的克隆及真核表達載體的構建J.細胞與分子免疫學雜志,2000,16(4):314-315.6BalkS,KerstenA,TranTT,etal.nertedatinftheFasL/Fasandperfrin/granzyeAandBpathaysisandatryfrthedevelpentfearlyviralhepatitisbutntfrreveryfrviralinfetinJ.JVirl,2001,75(18):8781-8791.7anadayDH,ilk