1、副豬嗜血桿菌的病原學檢測RESEARCH ON DETECTION OF HAEMOPHILUS PARASUIS匯報內容 研究背景 研究的主要內容 結果與分析 小結研究背景隨著我國規模化養豬業的發展，副豬嗜血桿菌感染有明顯增加趨勢，已成為豬場保育仔豬發病率和死亡率增加的重要原因之一，造成重大經濟損失。由于需要從病原學角度證實，而我國缺乏用于副豬嗜血桿菌檢測的標準血清及診斷方法，因此我們開展相關研究。解決方法1 分離鑒定副豬嗜血桿菌。進行副豬嗜血桿菌的流行病學調查，從而生產相對于主要流行優勢菌株的疫苗。建立副豬嗜血桿菌的快速診斷方法，為控制該病提供前提。研究的主要內容1病原的分離鑒定。2標準血

2、清、分型方法的建立和臨床應用。3轉鐵結合蛋白PCR診斷方法的建立和臨床應用。 第一章 副豬嗜血桿菌的分離鑒定病料采集剖檢樣品的病變表現為胸膜炎、心包炎、腹膜炎、關節炎和腦膜炎等。我們采集病變的肺臟和扁桃體作為病原分離的樣本。病原菌分離方法 在無菌操作條件下從疑似病豬的肺臟和扁桃體等病料中取樣, 在巧克力瓊脂平板或TSA培養基上劃線接種, 37 培養48 h后挑取單個菌落,轉接相同的培養基再進行純培養。涂片鏡檢 挑取上述純培養菌落涂片,革蘭氏染色后觀察細菌形態。分離鑒定兩株副豬嗜血桿菌 分離菌株溶血性測定 16s rRNA PCR鑒定 兩株副豬嗜血的血清型鑒定用本實驗室制備的Hps標準陽性血清對

3、本地分離菌株進行血清型鑒定。(1) 瓊脂擴散方法：湖北分離株血清型為5型，湖南分離株則未能檢測出血清型。(2) 間接血凝抑制方法: 檢測出湖北分離株的血清型為5型，湖南分離株的血清型為13型。分析與討論對于Hps 分離較為困難, 需要在典型新鮮病料的采集、適宜的培養條件及分離者的判斷經驗上更為關注, 才能提高其臨床分離率。這兩株副豬嗜血桿菌分離株對麥芽糖、葡萄糖、蜜三糖、木糖、阿拉伯糖、D-核糖、接觸酶、氧化酶、甘露醇、山梨糖、乳糖、尿素酶反應表現為一致,但對蔗糖、半乳糖、果糖、和H2S、山梨醇、甘露糖的生化反應不一致。第二章 副豬嗜血桿菌的血清學分型方 法的建立和臨床應用 標準抗原制備制備

4、分離株分型標準陽性血清家兔免疫分型方法的建立檢測抗原的制備 鹽析抗原(Salt Antigen)含菌量為1.8109 CFU/mL 煮沸抗原(Boiled Antigen)含菌量為3109 CFU/mL熱穩定抗原（Heat-stable Antigen）含菌量為1.8109/mL結果分析 免疫后抗體產生的規律(Hps-5、Hps-1為例)Hps-1（玻片）Hps-1（瓊擴）抗血清效價檢測抗血清的在兩種檢測方法中的特異性抗血清的保存期測定 將所保存的不同時期的Hps-5抗血清用于玻片凝集試驗。 分離株的鑒定 將保存的96株副豬嗜血桿菌制作成相應的熱穩定分型抗原，利用本試驗制備標準陽性血清，采用瓊

5、脂擴散試驗進行分型。分析與討論標準副豬嗜血桿菌在家兔內產生抗體的強弱。 本研究中探索了瓊脂擴散方法和玻片凝集方法在副豬嗜血桿菌血清分型中的應用。三種分型抗原在瓊脂擴散分型方法的應用。 第三章 副豬嗜血桿菌轉鐵結合蛋白 PCR診斷方法的建立和臨床應用副豬嗜血桿菌轉鐵結合蛋白tbpB保守序列的篩選標準副豬嗜血桿菌（15個血清型）tbpB的檢測該方法靈敏性、特異性檢測人工感染病料和臨床病料的檢測討論分析副豬嗜血桿菌轉鐵結合蛋白tbpB保守序列的選用將tpbB-PCR檢測的目的片段在NCBI網站上經過BLAST比對后發現，該基因5端225bp到514bp（288個nt）片段在大部分Hps中保守 不同血

6、清型副豬嗜血桿菌tbpB的檢測 對15種血清型的標準Hps進行擴增，由結果可知1、3、4、 5、6、7、8 、11 、12、13、15型菌株均能通過本實驗檢測，而9、10、14型菌株未被檢測出此目的帶。靈敏性試驗 將Hps-5型標準菌株的培養后，用比濁管測定，菌液濃度為1.25109 CFU/mL，模板稀釋倍數依次為100、101、102、103、104、105、106、107、108、109后進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖5所示。可見陽性結果的最高稀釋度為稀釋105倍，后取2L 做為模板，因此推算出PCR反應中最低檢測量為25 CFU/mL。特異性試驗僅有Hps(lane1,3)

7、擴增出目的帶，而多殺性巴氏桿菌（lane 4） ，大腸桿菌（lane 5）,沙門氏菌（lane 6）為PCR陰性，如圖6。該方法在檢測豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌標準菌株過程中，僅在血清型9型中擴增出微弱目的帶，其余為陰性，如圖7。人工感染病樣的檢測 選擇豬副豬嗜血桿菌抗體陰性30日齡的豬，攻毒后收集豬死亡后的肺和腦，置-20保存備用, 作為陽性材料；對照豬在3d后撲殺，采集肺和腦，置-20保存備用，作為陰性材料。圖8為從組織病料中直接提取該菌基因的結果。圖9為病料中細菌過夜培養后提取的基因組的檢測結果。臨床病料中檢測的結果 對送檢的18份臨床病料進行tpbB-PCR檢測7、 14號樣品中出現28

8、8bp的目的帶。 臨床病料的16S rRNA-PCR檢測結果 在相應的16S rRNA檢測過程中，7、14號樣品中出現821bp的目的帶 分析與討論為了評估tbpB-PCR方法的特異性，12種血清型的APP和多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌一些其他的菌株被用于實驗，結果11個血清型的APP和一些其它菌株的檢測結果均為陰性，這有力證明了我們所確定的tbpB的序列在Hps中的保守性。 實驗比較了2種不同的模板制作方法，一種是碾磨病料，直接提取病菌的全基因組作為模板。第二種是將小塊病料在TSB液體中過夜培養，煮菌，離心后提取上清作為模版。結果顯示第二種方法制做模板所檢測的效果明顯優于第一種方法。因

9、此我們認為該方法靈敏性較高，模板制作方法簡單，更加適用于臨床病料的檢測。根據文獻介紹，Hps多定居在鼻腔和扁桃體，所以我們在采集病料過程中也應該注意這一點，這也會影響到我們檢測該菌的敏感度。 小 結從病料中分離鑒定了2株副豬嗜血桿菌。制備了15個血清型的副豬嗜血桿菌標準陽性血清及對96株Hps進行了血清型分型。 對不同血清型tbpB基因進行了調查并建立了副豬嗜血桿菌tbpB-PCR檢測方法，為本病的診斷提供了有力工具。 相關研究文章1 王磊，何啟蓋，蔡旭旺，陳煥春，劉正飛，P.J. Blackall副豬嗜血桿菌標準抗血清的制備及臨床應用中國獸醫雜志（在投）2. Cai X, Chen H, B

10、lackall PJ, Yin Z, Wang L, Liu Z, Jin M. Serological characterization of Haemophilus parasuis isolates from China. Veterinary Microbiology, 2005,111( 3-4): 231-236致 謝感謝指導老師何啟蓋教授對我課題的指導！感謝實驗室全體同學對我的支持與幫助！本研究是在湖北省自然科學基金創新團體項目(2001ABA19)資助完成的。感謝評審老師對我論文的評閱！請各位老師多提寶貴意見！Hps標準陽性血清的制備 免疫原的制備每種血清型標準菌株分別免疫3只家兔。免疫程序首次免疫用0.5毫升（含菌量為109CFU）與等量的福氏不完全佐劑充分混合，在頸背部皮下分四點注射兔子。兩個星期后,將菌液濃度增至4