1、第十章高效液相色譜法第一節(jié) 固定相和流動(dòng)相第二節(jié) 高效液相色譜儀第三節(jié) 液-固色譜法第四節(jié) 化學(xué)鍵合相色譜法第五節(jié) 離子交換色譜法第六節(jié) 尺寸排阻色譜法第七節(jié) 分離方式的選擇及應(yīng)用 high performance liquid chromatograph,HPLC2022/9/181色譜法分類示意圖2022/9/182概述 高效液相色譜法是在氣相色譜和經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上70年代初期發(fā)展起來的一種以液體做流動(dòng)相的新色譜技術(shù)。 現(xiàn)代液相色譜和經(jīng)典液相色譜沒有本質(zhì)的區(qū)別。不同點(diǎn)僅僅是現(xiàn)代液相色譜比經(jīng)典液相色譜有較高的效率 和實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化 操作。經(jīng)典的液相色譜法，流動(dòng)相在常壓下輸送，所用的固定相柱

2、效低，分析周期長(zhǎng)。而現(xiàn)代液相色譜法引用了氣相色譜的理論，流動(dòng)相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達(dá)4.9107Pa）；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬）；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。因此，高效液相色譜具有分析速度快、分離效能高、自動(dòng)化等特點(diǎn)。所以人們稱它為高壓、高速、高效或現(xiàn)代液相色譜法。2022/9/183一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測(cè)手段1經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段 柱內(nèi)徑13cm，固定相粒徑100m 且不均勻 常壓輸送流動(dòng)相 柱效低（H，n） 分析周期長(zhǎng) 無法在線檢

3、測(cè)2HPLC：分離和分析 柱內(nèi)徑26mm，固定相粒徑17% 分配色譜 硅膠失活載體 吸附的水固定液2022/9/1846第四節(jié) 化學(xué)鍵合相色譜法一、概述二、化學(xué)鍵合相三、反相鍵合相色譜法四、正相鍵合相色譜法2022/9/1847一、概述 將固定液機(jī)械地涂漬在擔(dān)體上組成固定相。盡管選用與固定液不互溶的溶劑作流動(dòng)相，但在色譜過程中固定液仍會(huì)有微量溶解。以及流動(dòng)相經(jīng)過色譜柱的機(jī)械沖擊，固定相會(huì)不斷流失，即使將流動(dòng)相預(yù)先用固定相液體飽和或在色譜柱前加一個(gè)前置柱，使流動(dòng)相先通過前置柱，再進(jìn)入色譜柱，但仍難以完全避免固定液的流失。 2022/9/1848續(xù)前 70年代初發(fā)展了一種新型的固定相化學(xué)鍵合固定相

4、。這種固定相是通過化學(xué)反應(yīng)把各種不同的有機(jī)基團(tuán)鍵合到硅膠（載體）表面的游離羥基上，代替機(jī)械涂漬的液體固定相。這不僅避免了液體固定相流失的困擾，還大大改善了固定相的功能，提高了分離的選擇性，化學(xué)鍵合色譜適用于分離幾乎所有類型的化合物。2022/9/1849 根據(jù)鍵合相與流動(dòng)相之間相對(duì)極性的強(qiáng)弱，可將鍵合相色譜分為極性鍵合相色譜和非極性鍵合相色譜。在極性鍵合相色譜中，由于流動(dòng)相的極性比固定相極性要小，所以極性鍵合相色譜屬于正相色譜。弱極性鍵合相既可作為正相色譜，也可作為反相色譜。但通常所說的反相色譜系指非極性鍵合色譜。反相色譜在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛。2022/9/1850二、化學(xué)鍵合相 化學(xué)

5、鍵合固定相一般都采用硅膠（薄殼型或全多孔微粒型）為基體。在鍵合反應(yīng)之前，要對(duì)硅膠進(jìn)行酸洗、中和、干燥活化等處理，然后再使硅膠表面上的硅羥基與各種有機(jī)物或有機(jī)硅化合物起反應(yīng)，制備化學(xué)鍵合固定相。2022/9/1851鍵合相可分為四種鍵型：A 硅酸酯型（=Si-O-C=）鍵合相 將醇與硅膠表面的羥基進(jìn)行酯化反應(yīng)，在硅膠表面形成（=Si-O-C=）鍵合相。反應(yīng)生成單分子層鍵合相。一般用極性小的溶劑洗脫，分離極性化合物。B 硅氮型（=Si-N=）鍵合相 如果用SOCl2將硅膠表面的羥基先轉(zhuǎn)化成鹵素（氯化），再與各種有機(jī)胺反應(yīng)，可以得到各種不同極性基因的鍵合相。可用非極性或強(qiáng)極性的溶劑作為流動(dòng)相。202

6、2/9/1852C 硅碳型（=Si-C=）鍵合相 將硅膠表面氯化后，使Si-Cl鍵轉(zhuǎn)化為Si-C鍵。在這類固定相中，有機(jī)基團(tuán)直接鍵合在硅膠表面上。D 硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）鍵合相 將硅膠與有機(jī)氯硅烷或烷氧基硅烷反應(yīng)制備。這類鍵合相具有相當(dāng)?shù)哪蜔嵝院突瘜W(xué)穩(wěn)定性，是目前應(yīng)用最為廣泛的鍵合相。2022/9/1853三、反相鍵合相色譜法 在反相色譜中，一般采用非極性鍵合固定相，如硅膠-C18H37（簡(jiǎn)稱O D S或C18）硅膠-苯基等，用強(qiáng)極性的溶劑為流動(dòng)相，如甲醇/水，乙腈/水，水和無機(jī)鹽的緩沖液等。 目前，對(duì)于反相色譜的保留機(jī)制還沒有一致的看法，大致有兩種觀點(diǎn)：一種認(rèn)為屬于分配色譜，另

7、一種認(rèn)為屬于吸附色譜。在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。 分配色譜的作用機(jī)制是假設(shè)混合溶劑（水+有機(jī)溶劑）中極性弱的有機(jī)溶劑吸附于非極性烷基配合基表面，組分分子在流動(dòng)相中與被非極性烷基配合基所吸附的液相中進(jìn)行分配。2022/9/1854 吸附色譜的作用機(jī)制是把非極性的烷基鍵合相，看作是在硅膠表面上覆蓋了一層鍵合的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有強(qiáng)的疏水特性。當(dāng)用水與有機(jī)溶劑所組成的極性溶劑為流動(dòng)相來分離有機(jī)化合物時(shí)，一方面，非極性組分分子或組分分子的非極性部分，由于疏溶劑的作用，將會(huì)從水中被“擠”出來，與固定相上的疏水烷基之間產(chǎn)生締合作用。另一方面，被分離物的極

8、性部分受到極性流動(dòng)相的作用，使它離開固定相，減少保留值，此即解締過程。顯然，這兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。 一般地，固定相的烷基配合基或分離分子中非極性部分的表面積越大，或者流動(dòng)相表面張力及介電常數(shù)越大，則締合作用越強(qiáng)，分配比也越大，保留值越大。 2022/9/1855四、正相鍵合色譜法 在正相色譜中，一般采用極性鍵合固定相，硅膠表面鍵合的是極性的有機(jī)基團(tuán)，鍵合相的名稱由鍵合上去的基團(tuán)而定。最常用的有氰基（-C N）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）鍵合相。流動(dòng)相一般用比鍵合相極性小的非極性或弱極性有機(jī)溶劑，如烴類溶劑，或其中加入一定量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等），以

9、調(diào)節(jié)流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度。通常用于分離極性化合物。2022/9/1856 一般認(rèn)為正相色譜的分離機(jī)制屬于分配色譜。組分的分配比k值，隨其極性的增加而增大，但隨流動(dòng)相中極性調(diào)節(jié)劑的極性增大（或濃度增大）而降低。同時(shí)，極性鍵合相的極性越大，組分的保留值越大。 該法主要用于分離異構(gòu)體，極性不同的化合物，特別是用來分離不同類型的化合物。2022/9/1857化學(xué)鍵合色譜具有下列優(yōu)點(diǎn)： A. 適用于分離幾乎所有類型的化合物。一方面通過控制化學(xué)鍵合反應(yīng)，可以把不同的有機(jī)基團(tuán)鍵合到硅膠表面上，從而大大提高了分離的選擇性；另一方面可以通過改變流動(dòng)相的組成合乎種類來有效地分離非極性、極性和離子型化合物。 B. 由于

10、鍵合到載體上的基團(tuán)不易被剪切而流失，這不僅解決了由于固定液流失所帶來的困擾，還特別適合于梯度洗脫，為復(fù)雜體系的分離創(chuàng)造了條件。2022/9/1858續(xù)前C. 鍵合固定相對(duì)不太強(qiáng)的酸及各種極性的溶劑都有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。D. 固定相柱效高，使用壽命長(zhǎng)，分析重現(xiàn)性好。2022/9/18591分離機(jī)制：利用組分在兩相中溶解度的差異2固定相：載體+固定液（物理或機(jī)械涂漬法） 缺點(diǎn)：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實(shí)用 固定液極性NLLC 固定液非極性RLLC3正相色譜固定液極性 流動(dòng)相極性（NLLC） 極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱 適于分離極性組分 反相色譜固定液極性 固定相極性 底劑

11、+ 有機(jī)調(diào)節(jié)劑（極性調(diào)節(jié)劑） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF2022/9/18624流動(dòng)相極性與k的關(guān)系： 流動(dòng)相極性，洗脫能力，k，組分tR5出柱順序：極性大的組分先出柱 極性小的組分后出柱6適用：非極性中等極性組分（HPLC80%問題）（三）正相鍵合相色譜1分離機(jī)制：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、 誘導(dǎo)力、或氫鍵作用力2固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相3流動(dòng)相：極性小（同LSC） 底劑 + 有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇2022/9/18634流動(dòng)相極性與k的關(guān)系： 流動(dòng)相極性，洗脫能力，組分tR，k5出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分，極性小的組分先 出柱極性大的組分后出柱

12、6適用： 氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍小） 分離物質(zhì)也相似 氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差別大，堿性 分析極性大物質(zhì)、糖類等2022/9/1864第五節(jié) 離子交換色譜法一、原理二、固定相三、流動(dòng)相四、離子色譜法ion-exchange chromatograph2022/9/1865 離子交換色譜法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測(cè)定溶液中陽(yáng)離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，因此應(yīng)用范圍較廣。 2022/9/1866一、原理 離子交換色

13、譜法是利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相親和力的差別來實(shí)現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下： 陽(yáng)離子交換： 陰離子交換： 一般形式： R一AB RBA2022/9/1867對(duì)于陽(yáng)離子交換樹脂，一價(jià)離子的選擇性順序?yàn)椋?Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+二價(jià)離子的順序?yàn)椋?Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+，Zn2+Mg2+對(duì)于陰離子交換樹指，各陰離子的選擇性順序?yàn)椋?ClO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-OH- HCO3

14、-H2P04-IO3-CH3COOF2022/9/1868二、固定相 作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽(yáng)離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強(qiáng)弱之分（見下表）表10- 2 離子交換劑上的官能基2022/9/1869 常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種： 1. 多孔型離子交換樹脂 它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為520m，有微孔型和大孔型之分2. 薄膜型離子交換樹脂 它是在直徑約為30m的固體情性核上，凝聚12m厚的樹脂層。3. 表面多孔型離子交換樹脂 它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂

15、一層很薄的離子交換樹脂。2022/9/18704. 離子交換鍵合固定相 它是用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。它也分為兩種類型。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點(diǎn)是機(jī)械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來實(shí)現(xiàn)快速分離。 2022/9/1871三、流動(dòng)相 離子交換色譜法所用流動(dòng)相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強(qiáng)度）的緩沖溶液。通過改變流動(dòng)相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競(jìng)爭(zhēng)吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。 關(guān)于pH值的影響，要

16、視不同情況而定。例如，分離有機(jī)酸和有機(jī)堿時(shí)，這些酸堿的離解程度可通過改變流動(dòng)相的pH值來控制。增大pH值會(huì)使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低pH值，其結(jié)果相反。但無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會(huì)使樣品的保留值增大。 2022/9/1872四、離子色譜法 離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。 離子交換色譜法在無機(jī)離子的分析和應(yīng)用受到限制。例如，對(duì)于那些不能采用紫外檢測(cè)器的被測(cè)離子，如采用電導(dǎo)檢測(cè)器，由于被測(cè)離子的電導(dǎo)信號(hào)被強(qiáng)電解質(zhì)流動(dòng)相的高背景電導(dǎo)信號(hào)淹沒而無法檢測(cè)。為了解決這一問題，1975年Small等人提出一種能同時(shí)測(cè)定多種無機(jī)和有機(jī)離子的新技術(shù)：2022/9/

17、1873續(xù)前 他們?cè)陔x子交換分離柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹脂。通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動(dòng)相，從而用電導(dǎo)檢測(cè)器可直接檢測(cè)各種離子的含量。這種色譜技術(shù)稱為離子色譜。若樣品為陽(yáng)離子，用無機(jī)酸作流動(dòng)相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換劑。當(dāng)試樣經(jīng)陽(yáng)離子交換劑的分離柱后，隨流動(dòng)相進(jìn)入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個(gè)重要反應(yīng)：2022/9/1874 R+OHH+Cl- R+Cl十H2O R+一OH-M+Cl-M+OHR+Cl- 由反應(yīng)可見：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動(dòng)相本底電導(dǎo)的影響。同時(shí)，又將樣品陽(yáng)

18、離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的2.6倍，提高了所測(cè)陽(yáng)離子電導(dǎo)的檢測(cè)靈敏度。對(duì)于陰離子樣品也有相似的作用機(jī)理。 2022/9/1875續(xù)前 在分離柱后加一個(gè)抑制柱的離子色譜亦稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過抑制柱后會(huì)加寬，降低了分離度。后來，F(xiàn)rits等人提出采用非抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導(dǎo)率極低的溶液，例如110-4510-4molL-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動(dòng)相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。2022/9/18761.離子色譜法原理 離子色譜原理，與傳統(tǒng)離子交換的不同點(diǎn)：采用交換容量非常低的特制離子

19、交換樹脂為固定相；細(xì)顆粒柱填料，高柱效；采用高壓輸液泵；低濃度淋洗液或本底電導(dǎo)抑制（在分離柱后，采用抑制柱來消除淋洗液的高本底電導(dǎo)）；可采用電導(dǎo)檢測(cè)器，快速分離分析微量無機(jī)離子混合物；各種抑制裝置及無抑制方法的出現(xiàn)，發(fā)展迅速。2022/9/18772.離子色譜具有以下優(yōu)點(diǎn)（1）分析速度快 可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個(gè)試樣的分析；（2）分離能力高 在適宜的條件下，可使常見的各種陰離子混合物分離；例：使用雙柱法，在十幾分鐘內(nèi)，可使七種陰離子完全分離。（3）分離混合陰離子的最有效方法（4）耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱2022/9/18783. 離子色譜法裝置：2022/9/1879第六節(jié) 尺寸排阻色譜

20、法一、原理二、固定相三、流動(dòng)相size- exclusion chromatograph2022/9/1880 尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機(jī)理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實(shí)現(xiàn)分離的。 2022/9/1881尺寸排阻色譜具有其他液相色譜所沒有的特點(diǎn)： （1）保留時(shí)間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息。(2)保留時(shí)間短，譜峰窄，易檢測(cè)，可采用靈敏度較低的檢測(cè)器。（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強(qiáng)保留分子，因此柱壽命長(zhǎng)。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對(duì)分子質(zhì)量差別

21、必須大于10才能得以分離。2022/9/1882一、原理 尺寸排阻色譜是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法。其固定相為化學(xué)惰性多孔物質(zhì)凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其滲透過程模型見圖20-7。 2022/9/18832022/9/1884 二、固定相 排阻色譜固定相種類很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。 所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過

22、交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。 1. 軟性凝膠 如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動(dòng)相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。 2022/9/18852. 半剛性凝膠 如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。用于高效液相色譜時(shí)，流速不宜大。3. 剛性凝膠 如多孔硅膠、多孔玻璃等；它們既可用水溶性溶劑，又可用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作。一般控制壓強(qiáng)小于7MPa，流速1cm3s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分

23、離。2022/9/1886三、流動(dòng)相 排阻色譜所選用的流動(dòng)相必須能溶解樣品，并必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤(rùn)濕凝膠。當(dāng)采用軟性凝膠時(shí)，溶劑也必須能溶脹凝膠。另外，溶劑的粘度要小，因?yàn)楦哒扯热軇┩拗品肿訑U(kuò)散作用而影響分離效果。這對(duì)于具有低擴(kuò)散系數(shù)的大分子物質(zhì)分離，尤需注意。選擇溶劑還必須與檢測(cè)器相匹配。常用的流動(dòng)相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。 以水溶液為流動(dòng)相的凝膠色譜適用于水溶性樣品， 以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。2022/9/1887第七節(jié) 分離方式的選擇及應(yīng)用 choice of separation types and applacations of HPLC 一、相對(duì)分子質(zhì)量二、溶解度三、化學(xué)結(jié)構(gòu)四、應(yīng)用2022/9/1888色譜分離類型的選擇 要正確地選擇色譜分離方法，首先必須盡可能多的 了解樣品的有關(guān)性質(zhì)，其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點(diǎn)及其應(yīng)用范圍。 選擇色譜分離方法的主要根據(jù) 是樣品的相對(duì)分