1、第9章 色譜分析法第1頁第1頁9.1 色譜法原理9.2 速率理論9.3 氣相色譜法9.4 高效液相色譜法第2頁第2頁9.1 色譜法概述9.1.1 色譜法組成固定相：填入玻璃管或不銹鋼管內(nèi)靜止不動(dòng)一相（固體或液體）。流動(dòng)相：自上而下運(yùn)動(dòng)一相（普通是氣體或液體）。色譜柱：裝有固定相管子（玻璃管或不銹鋼管）。當(dāng)流動(dòng)相中樣品混合物經(jīng)過固定相時(shí)，就會(huì)與固定相發(fā)生作用，因?yàn)楦鹘M分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上差異，與固定相相互作用類型、強(qiáng)弱也有差異，因此在同一推進(jìn)力作用下，不同組分在固定相滯留時(shí)間長短不同，從而按先后不同次序從固定相中流出。第3頁第3頁色譜法分類 1. 按照流動(dòng)相和固定相物理狀態(tài)分類按流動(dòng)相物理狀態(tài)：氣相

2、色譜法（流動(dòng)相為氣體）和液相色譜法（流動(dòng)相為液體）。按照固定相物理狀態(tài)不同，氣相色譜法又可分為氣固色譜法（固定相為固體物質(zhì)）和氣液色譜法（將不揮發(fā)液體固定在適當(dāng)固體載體上作為固定相）；液相色譜法又可分為液固色譜法（固定相為固體）和液液色譜法（將固定液固定在適當(dāng)固相載體上作為固定相）。超臨界流體為流動(dòng)相色譜為超臨界流體色譜（SFC）。經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)將固定液鍵合到載體表面，這種化學(xué)鍵合固定相色譜又稱化學(xué)鍵合相色譜（CBPC）.第4頁第4頁2.按照產(chǎn)生分離過程相系統(tǒng)形式分類柱色譜法、毛細(xì)管色譜法、平板色譜法。3.按照分離過程原理分類吸附色譜法、離子互換色譜法、凝膠色譜法或尺寸排阻色譜法、親和色譜法。4

3、.按照展開程序分類洗脫法、頂替法和迎頭法。色譜法分類 第5頁第5頁9.1.2 線性洗脫色譜及名詞術(shù)語 分派系數(shù)K ：線性色譜：K為常數(shù)時(shí)所進(jìn)行色譜過程。溶質(zhì)流過色譜柱時(shí)，分派系數(shù)大組份經(jīng)過色譜柱所需要時(shí)間長，分派系數(shù)小組份需要時(shí)間短。當(dāng)樣品中各組份在兩相分派系數(shù)不同時(shí)，就能實(shí)現(xiàn)差速遷移，達(dá)到分離目標(biāo)。 第6頁第6頁色譜流出曲線第7頁第7頁1. 基線：是柱中僅有流動(dòng)相通過，檢測器響應(yīng)訊號統(tǒng)計(jì)值。2. 峰高：色譜峰頂點(diǎn)與基線之間垂直距離，以h表示。3. 保留值：1) 死時(shí)間tm：不被固定相吸附或溶解物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值所需時(shí)間。2) 保留時(shí)間tr：試樣從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)

4、時(shí)所經(jīng)歷時(shí)間。3) 調(diào)整保留時(shí)間tr：扣除死時(shí)間后保留時(shí)間。 tr = tr - tm 色譜流出曲線第8頁第8頁4. 死體積Vm：色譜柱在填充后，主管內(nèi)固定相顆粒間所剩留空間、色譜儀中管路和連接頭間空間以及檢測器空間總和。 Vm = tm F0 5. 保留體積Vr：從進(jìn)樣開始到被測組份在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所通過流動(dòng)相體積。 Vr = tr F0 6.調(diào)整保留體積Vr：扣除死體積后保留體積。 Vr= Vr - Vm 7. 相對保留體積2/1：某組份2調(diào)整保留值與組份1調(diào)整保留值之比，稱為相對保留值。色譜流出曲線第9頁第9頁8. 分派比k：也稱容量因子，組份在固定相和流動(dòng)相中分派量之比。它是衡量

5、色譜柱對被分離組份保留能力主要參數(shù)。 k與tr關(guān)系：k與分派系數(shù)K之間關(guān)系： 色譜流出曲線第10頁第10頁9. 區(qū)域?qū)挾?色譜峰區(qū)域?qū)挾仁墙M份在色譜柱中譜帶擴(kuò)張函數(shù)，它反應(yīng)了色譜操作條件動(dòng)力學(xué)原因。度量色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N辦法：1) 原則偏差：0.607倍峰高處色譜寬二分之一。2) 半峰寬：峰高二分之一處相應(yīng)峰寬。3) 基線寬度Y：色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上切線在基線上截距。 Y=4色譜流出曲線第11頁第11頁色譜流出曲線上，能夠得到許多主要信息：依據(jù)色譜峰個(gè)數(shù)，能夠判斷樣品中所含組份至少個(gè)數(shù)；依據(jù)色譜峰保留值（或位置），能夠進(jìn)行定性分析；依據(jù)色譜峰下面積或峰高，能夠進(jìn)行定量分析；色譜峰保留值及其區(qū)

6、域?qū)挾龋窃u價(jià)色譜柱分離效能依據(jù)；色譜峰間距離，是評價(jià)固定相（和流動(dòng)相）選擇是否適合依據(jù) 。色譜流出曲線第12頁第12頁9.2 色譜法基本理論兩組分全分離要求：(1)兩組份分派系數(shù)必須有差別；(2)區(qū)域擴(kuò)寬速率應(yīng)小于區(qū)域分離速度；(3)在確保快速分離前提下，提供足夠長色譜柱。 第13頁第13頁9.2.1 色譜法基本理論1）塔板理論色譜柱是由一系列連續(xù)、相等水平塔板構(gòu)成，每一塊塔板高度用H表示，稱為塔板高度。塔板理論假設(shè)：在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間不久達(dá)到分派平衡，然后伴隨流動(dòng)相按一個(gè)一個(gè)塔板方式向前轉(zhuǎn)移，對一根長為L色譜柱，溶質(zhì)平衡次數(shù)應(yīng)為：n稱為理論塔板數(shù) 第14頁第14頁塔板理論指出：(

7、1)當(dāng)理論塔板數(shù)n不小于50時(shí)，可得到基本對稱峰形曲線，氣相色譜柱n約為103106。(2)當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱后，只要各組份在兩相間分派系數(shù)有微小差別，通過重復(fù)多次分派平衡后，仍可取得良好分離。(3) n與半峰寬度及峰底寬度關(guān)系式為：有效塔板數(shù)：有效板高：9.2.1 色譜法基本理論第15頁第15頁2）速率理論速率理論指出，譜峰擴(kuò)寬受三個(gè)動(dòng)力學(xué)原因控制，即渦流擴(kuò)散項(xiàng)，分子擴(kuò)散項(xiàng)，傳質(zhì)阻力項(xiàng)，用板高方程表示為：(1)渦流擴(kuò)散項(xiàng)A： A=2dp 9.2.1 色譜法基本理論第16頁第16頁(2)分子擴(kuò)散項(xiàng)： B=2Dg (3)傳質(zhì)阻力項(xiàng)： C=Cg+Cl色譜板高方程式（范第姆特方程式）： 9.2.1 色

8、譜法基本理論第17頁第17頁3）液相色譜中速率理論和項(xiàng)分別表示渦流擴(kuò)散項(xiàng)和分子擴(kuò)散項(xiàng)。 項(xiàng)是在流動(dòng)區(qū)域內(nèi)，流動(dòng)相傳質(zhì)阻力。項(xiàng)為固定相傳質(zhì)阻力。項(xiàng)是在流動(dòng)相停滯區(qū)域內(nèi)傳質(zhì)阻力。 9.2.1 色譜法基本理論第18頁第18頁9.2.2 分離度1.柱效和選擇性柱效：理論塔板數(shù)n（或n有效）衡量選擇性：色譜圖上兩峰間距離衡量2.分離度分離度是指相鄰兩色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰峰寬度平均值之比。 分離度受柱效（n），選擇性（）和容量因子（k）三個(gè)參數(shù)控制：第19頁第19頁 s .5 兩個(gè)組分能完全分開。 s .0 兩組分能分開，滿足分析要求。 s .0 兩峰有部分重疊。9.2.2 分離度第20頁第20

9、頁9.2.3 定性和定量分析1.定性分析 在相同色譜條件下，通過比較已知物和未知物保留參數(shù)或在固定相上位置，擬定未知物是何種物質(zhì)。也可用經(jīng)驗(yàn)規(guī)律和文獻(xiàn)值進(jìn)行定性分析2.定量分析色譜定量分析依據(jù) ： mi = fiA Ai mi = fih hi 絕對校正因子： 第21頁第21頁相對校正因子： 相對相應(yīng)值： 9.2.3 定性和定量分析第22頁第22頁3）定量方法(1) 外標(biāo)法該方法是將欲測組份純物質(zhì)配制成不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，使?jié)舛扰c待測組份相近，然后取固定量上述溶液進(jìn)行色譜分析，得到標(biāo)準(zhǔn)樣品對應(yīng)色譜圖，以峰高或峰面積對濃度作圖。在完全相同色譜條件下，取一樣量試樣分析，測得該試樣響應(yīng)訊號后，由標(biāo)準(zhǔn)曲

10、線即可查出其百分含量。(2)內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確稱取樣品，加入一定量某種純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，然后進(jìn)行色譜分析。依據(jù)被測物和內(nèi)標(biāo)物色譜圖上對應(yīng)得峰面積（或峰高）和相對校正因子，求出某組份含量9.2.3 定性和定量分析第23頁第23頁(3)歸一化法是把試樣中所有組份含量之和按100%計(jì)算，它們相應(yīng)色譜峰面積或峰高為定量參數(shù)，通過下列公式計(jì)算各組份含量： 或 9.2.3 定性和定量分析第24頁第24頁9.3 氣相色譜法 9.3.1氣相色譜儀1.氣相色譜儀工作過程 第25頁第25頁2.氣相色譜儀氣相色譜儀構(gòu)成：氣路系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)以及信號檢測統(tǒng)計(jì)系統(tǒng)。1)氣路系統(tǒng)作用：讓載氣連續(xù)運(yùn)營通過度離系統(tǒng)

11、要求：管路密閉，載氣流速穩(wěn)定，流量計(jì)量準(zhǔn)確。(1)載氣： 氫氣、氮?dú)狻⒑夂蜌鍤狻?(2)凈化器：凈化器是用來提供載氣純度裝置。凈化劑主要有活性炭、硅膠和分子篩、105催化劑，分別用來除去烴類雜質(zhì)、水份、氧氣。(3)穩(wěn)壓恒流裝置第26頁第26頁2)進(jìn)樣系統(tǒng)構(gòu)成：進(jìn)樣裝置和氣化室作用：將液體或固體試樣，在進(jìn)入色譜柱前瞬間氣化，然后快速定量地轉(zhuǎn)入到色譜柱中。進(jìn)樣裝置類型：頂空進(jìn)樣系統(tǒng)、 手動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、閥進(jìn)樣系統(tǒng)、液體自動(dòng)進(jìn)樣器、吹掃捕集系統(tǒng)、熱裂解器進(jìn)樣系統(tǒng)。3)分離系統(tǒng)完畢份離過程所需要色譜柱是色譜儀關(guān)鍵部件之一。 (1)氣固填充色譜柱(2)氣液填充色譜柱(3)毛細(xì)管柱色譜柱 2.氣相色譜儀第2

12、7頁第27頁4)溫控系統(tǒng)溫控系統(tǒng)是用來設(shè)定、控制、測量色譜柱爐、氣化室、檢測室三處溫度。5)檢測器色譜檢測系統(tǒng)由檢測器、微電流放大器、統(tǒng)計(jì)器等部件構(gòu)成。 檢測器：將載氣里被分離組份量轉(zhuǎn)變?yōu)橐子跍y量信號（普通為電信號）2.氣相色譜儀第28頁第28頁檢測器種類：(1)熱導(dǎo)池檢測器(TCD)測量原理：利用惠斯登電橋，據(jù)各種物質(zhì)和載氣導(dǎo)熱系數(shù)不同，采取熱敏元件進(jìn)行檢測特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡樸，靈敏度適宜，穩(wěn)定性很好，線性范圍較寬，適合用于無機(jī)氣體和有機(jī)物，它既可做常量分析，也可做微量分析。2.氣相色譜儀第29頁第29頁(2) 氫火焰離子化檢測器(FID) 構(gòu)成：離子室，離子頭及氣體供應(yīng)三部分。 原理：首先在空氣

13、存在時(shí)，用點(diǎn)火線圈通電，點(diǎn)燃?xì)溲妗．?dāng)被測組份由載氣帶出色譜柱后，與氫氣在進(jìn)入噴咀前混合，然后進(jìn)入離子室火焰區(qū)，生成負(fù)離子。在電場作用下，它們分別向兩極定向移動(dòng)，從而形成離子流。此離子流即基流，經(jīng)放大后送至統(tǒng)計(jì)儀統(tǒng)計(jì)。特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡樸、基流小，最小檢測量為ng/mL級、靈敏度高、死體積小、響應(yīng)快、線性范圍寬、穩(wěn)定性好，對操作條件要求不甚嚴(yán)格。僅對含碳有機(jī)化合物有響應(yīng)，對一些物質(zhì)，如永久性氣體、水、一氧化碳、二氧化碳、氮氧化物、硫化氫等不產(chǎn)生信號或者信號很弱。 2.氣相色譜儀第30頁第30頁(3)電子捕獲檢測器(ECD)原理：放射性源作用下，載氣電離發(fā)射電子形成基流，當(dāng)電負(fù)性大元素進(jìn)入后，能夠捕獲基

14、流中電子，使基流下降產(chǎn)生倒峰。被測組分濃度越大，倒峰越大；電負(fù)性越強(qiáng)，捕獲電子能力越大，倒峰越大。特點(diǎn)：只對電負(fù)性(親電子)物質(zhì)有信號，對非電負(fù)性物質(zhì)則沒有響應(yīng)或響應(yīng)很小。測含有鹵素、O、N、S、P等電負(fù)性大原子或基團(tuán)有機(jī)化合物2.氣相色譜儀第31頁第31頁(4)火焰光度檢測器(FPD)原理：在富氫焰（H2:O23:1）中燃燒時(shí)，含硫、磷化合物硫分別發(fā)出394nm和526nm特性光，經(jīng)濾光片分開，然后經(jīng)光電倍增管把光強(qiáng)度變?yōu)殡娦盘柖M(jìn)行測量。特點(diǎn)：對含硫、含磷化合物檢測靈敏度很高。用于含硫、磷元素化合物分析，又稱硫磷檢測器2.氣相色譜儀第32頁第32頁9.3.2 氣相色譜固定相及其選擇 分類：

15、液體固定相（由固定液和載體構(gòu)成 ）和固體固定相。1.液體固定相固定液要求：熱穩(wěn)定性好，化學(xué)穩(wěn)定性，固定液粘度和凝固點(diǎn)要低，各組份必須在固定液中有一定溶解度。固定液選擇：按照“相同相溶”規(guī)律來選擇。對于復(fù)雜組份，可選取兩種或兩種以上混合固定液，配合使用，增長分離效果。對組份性質(zhì)不明未知樣品，普通首先在最慣用五種固定液上進(jìn)行試驗(yàn)觀測未知物色譜圖分離情況，然后在十二種慣用固定中，選擇適當(dāng)極性固定液。 載體特點(diǎn)：含有多孔性，化學(xué)惰性，表面沒有活性但有較好浸潤性，熱定性好，有一定得機(jī)械強(qiáng)度。載分體類：硅藻土類和非硅藻土類。2.固體固定相第33頁第33頁9.3.3氣相色譜分離條件選擇1)載氣及其線速選擇依

16、據(jù)式 繪制 關(guān)系曲線，擬定 由 和所用檢測器選擇適宜載氣。2)柱溫選擇柱溫直接影響分離效率和分析速度，普通說來，操作溫度至少必須高于固定液熔點(diǎn)，以使其有效地發(fā)揮作用。第34頁第34頁9.4 高效液相色譜法液相色譜法：流動(dòng)相是液體色譜法。分類：平板色譜和柱色譜液相色譜法不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性限制，非常適合于分離生物大分子、離子型化合物、不穩(wěn)定天然產(chǎn)物以及其它各種高分子化合物等。 第35頁第35頁9.4.1高效液相色譜儀構(gòu)成：高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。另外還配備一些附屬裝置，如梯度洗脫、自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理裝置等。1.高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)由儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動(dòng)阻力器等組份，關(guān)鍵部件是高壓輸液泵。2.進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣方式： 直接注射進(jìn)樣、停流進(jìn)樣和高壓六