1、PAGE 15 -黑曲霉木聚糖酶在大腸桿菌中的胞外表達和酶學(xué)性質(zhì)研究植物細胞壁中有豐富的多糖成分，包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。其中，半纖維素是僅次于纖維素的可再生資源，但轉(zhuǎn)化率較低，是亟待開發(fā)的生物物質(zhì)1。木聚糖酶是一類能將木聚糖降解為低聚木糖和木單糖的酶系。其中，-D-1,4內(nèi)切木聚糖酶(-D-1,4endoxylanase,xynA)(EC3.2.1.8)以內(nèi)切的方式降解主鏈上的-1,4糖苷鍵，生成低聚木糖。其次，-D-1,4木糖苷酶(EC3.2.1.37)從還原端釋放木糖。此外，-L-阿拉伯糖苷酶(EC3.2.1.55)和-L-葡萄糖醛酸苷酶(EC3.2.1.139)催化木聚糖中支鏈糖

2、苷鍵的斷裂，加速低聚木糖的形成2。在上述酶系當(dāng)中，-D-1,4內(nèi)切木聚糖酶是木聚糖水解過程中的關(guān)鍵酶，受到的關(guān)注最多。迄今為止，國內(nèi)外相繼報道了約400種不同來源的xynA基因。大部分木聚糖酶基因來源于括黑曲霉3、米曲霉4和里氏木霉5等真菌。不同微生物來源的木聚糖酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì)差異較大6。真菌木聚糖酶的酶分子質(zhì)量較小，在1833kDa，最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH分別為4560和3.06.5。在酶的穩(wěn)定性方面，多數(shù)真菌來源的酶在4060較為穩(wěn)定，而pH在2.510.0都有較好的穩(wěn)定性7-8。為提高木聚糖酶的發(fā)酵水平，近百種不同來源的木聚糖酶基因已在大腸桿菌(Escherich

3、iacoli)中成功實現(xiàn)高效表達9。然而，木聚糖酶在E.coli中主要為胞內(nèi)表達，不利于酶分離提取。在本研究中，克隆了來源于黑曲霉(Aspergillusniger)AG11的xynA基因(GenBankNo.XM_001388485.2)，并表達于E.coliBL21(DE3)，構(gòu)建得到能分泌xynA的重組菌。通過誘導(dǎo)條件優(yōu)化提高xynA分泌表達水平，并研究了其酶學(xué)性質(zhì)。1材料與方法1.1材料與試劑1.1.1菌株與質(zhì)粒A.nigerAG11、E.coliJM109、BL21(DE)感受肽細胞、質(zhì)粒pET28a(+)和質(zhì)粒pET22b(+)均由實驗室保藏。1.1.2試驗試劑柱回收試劑盒，The

4、rmo公司；大腸桿菌感受態(tài)制備試劑盒、限制性內(nèi)切酶、PrimerSTARMaxDNA聚合酶，大連TaKaRa公司；氨芐青霉素、質(zhì)粒提取試劑盒、真菌基因組快速提取試劑盒，上海生工公司；一步克隆試劑盒，南京諾維贊公司；酵母粉與胰蛋白胨，Oxoid公司；底物樺木聚糖，Sigma公司(美國)；蛋白質(zhì)marker和BCA蛋白濃度檢測試劑盒，上海翊圣公司；蛋白電泳Loadingbuffer與Bis-Tris預(yù)制凝膠，Invitrogen公司。其他常規(guī)試劑及藥品為國產(chǎn)或進口分裝。1.1.3培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，蛋白胨10，NaCl5，自然pH。PDA培養(yǎng)基(g/L)：土豆200，葡萄糖2

5、0，瓊脂15，自然pH。1.2試驗方法1.2.1黑曲霉基因組的提取將孢子懸液涂布于PDA固體培養(yǎng)基，30靜置培養(yǎng)47d。用無菌水緩慢刮取固體培養(yǎng)基表面孢子，經(jīng)濾膜過濾獲得高活性的孢子懸液。將接種于PDA液體培養(yǎng)基中，30、220r/min條件下培養(yǎng)24h。通過離心及紗布過濾收集黑曲霉菌絲體，置于滅菌的研缽中(加液氮)研磨至細小粉末，用離心管收集待用。使用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取黑曲霉基因組。1.2.2xynA基因的克隆與表達載體的構(gòu)建以A.nigerAG11基因組為模板，利用引物xynAprimerF和xynApimerR(表1)進行PCR擴增，得到xynA基因。擴增程序為：94預(yù)變

6、性3min；94變性10s，55退火15s，72延伸50s，循環(huán)34次；最后72延伸5min。將PCR擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對產(chǎn)物進行純化并測序。分別用NcoI和XhoI對PCR產(chǎn)物、pET-28a(+)和pET-22b(+)載體進行雙酶切。PCR產(chǎn)物經(jīng)SolutionI分別連接至pET-28a(+)和pET-22b(+)載體的雙酶切片段，并轉(zhuǎn)化E.coliJM109。為去除內(nèi)含子，以intronprimeF和introprimerR(表1)對重組載體進行擴增，所得PCR產(chǎn)物用磷酸化酶處理后，用SolutionI連接酶連接，得到xynA表達載體pET-28a(+)-xynA和pET-

7、22b(+)-xynA。其中，pET-22b(+)載體由于在多克隆位點的上游添加了信號肽序列，可將外源蛋白從大腸桿菌中高效地引導(dǎo)出胞外，減少包涵體形成，常被用于胞外異源表達。同時，由于pelB信號肽融合在xynA的N端，可能對xynA的表達有影響，所以需要實驗驗證。1.2.3重組xynA的表達將構(gòu)建的pET-28a(+)-xynA和pET-22b(+)-xynA轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE)，得到重組菌pET-28a(+)-xynA/BL21(DE)和pET-22b(+)-xynA/BL21(DE)。重組菌分別接種于含100g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中。經(jīng)37，220r/min條件

8、下培養(yǎng)12h，再轉(zhuǎn)接至含100g/mL氨芐青霉素的TB發(fā)酵培養(yǎng)基中。經(jīng)37，220r/min搖瓶培養(yǎng)至OD600值為1.0時，用終濃度為0.1mmol/L的異丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)，并于25和220r/min下發(fā)酵24h。表1本研究使用的引物Table1Primersusedinthisstudy注：下劃線為酶切位點或一步克隆對應(yīng)的同源臂序列將重組菌發(fā)酵液離心并收集菌體，用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH7.5)重懸后于冰水浴中超聲破碎(200W，超聲3s，間隔4s，50次)，在4，12

9、000r/min條件下離心15min后將上清液和沉淀分別測定酶活力，并進行SDS檢測。將上清液中的目標(biāo)條帶切膠回收，用MALDI-TOF/MS對樣品進行質(zhì)譜分析10。同時將pET-22b-xynA/BL21(DE)發(fā)酵上清液進行SDS和酶活力檢測。1.2.4正交實驗優(yōu)化胞外表達水平以IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)OD600值為xynA胞外表達的因素，設(shè)計正交試驗(表2)。將pET-22b(+)-xynA/BL21(DE)重組菌在不同條件下進行發(fā)酵并比較不同條件對胞外表達的木聚糖酶的影響。并通過計算各條件下的k值和極差R，確定xynA胞外表達影響最大的因素11。表2大腸桿菌分泌表達xynA的L

10、9(33)正交試驗表Table2L9(33)orthogonaltableoftheextracellularxynAexpresioninE.coli1.2.5重組xynA的分離純化使用鎳親和層析柱對表達的xynA進行分離純化。將重組菌發(fā)酵液在4、12000r/min離心5min。取25mL上清液于0.22m水系膜過濾后，上樣至用緩沖液A(50mmol/LNaH2PO4-Na2HPO4，pH7.5)平衡的HisTrapTMFF。用8%的緩沖液B(50mmol/LNaH2PO4-Na2HPO4，pH7.5，500mmol/L咪唑)沖洗純化柱后，xynA于20%B緩沖液(100mmol/L咪唑)

11、洗脫。用脫鹽柱SephadexG25脫鹽，置于4保存，用SDS檢測其純度。1.2.6重組xynA酶學(xué)性質(zhì)測定最適反應(yīng)溫度：純化后的酶液經(jīng)NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(50mmol/L，pH7.5)稀釋至適當(dāng)濃度，分別測定在3560的酶活力。以最高酶活力為100%，計算各溫度下的相對酶活力。溫度穩(wěn)定性：將上述稀釋后酶液分別在4060條件下孵育090min后置于冰上保存，測定各條件下的酶活力。以孵育0min時的酶活力為100%，計算各孵育時間下的相對酶活力。在上述溫度穩(wěn)定性測定的基礎(chǔ)上擬合不同溫度下的回歸方程，計算各溫度下木聚糖酶的半衰期12。最適反應(yīng)pH：分別用Na2HPO4-檸檬酸(p

12、H2.05.0)、Na2HPO4-NaH2PO4(pH6.07.0)、Tris-HCl(pH8.0)和甘氨酸-NaOH(pH9.0)緩沖液將pH調(diào)至2.09.0后測定酶活力。以最高酶活力為100%，計算各pH下的相對酶活力。用上述相同的緩沖液，將酶液pH調(diào)至2.09.0，在40條件下孵育1h后，再將pH調(diào)至4.0測定酶活力。以孵育0min時的酶活力為100%，計算各孵育條件下的相對酶活力。1.2.7木聚糖酶酶反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)測定在酶的最適條件下測定質(zhì)量濃度為025mg/mL的樺木木聚糖的初始酶活力。基于上述酶反應(yīng)數(shù)據(jù)，作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，計算重組木聚糖酶的Km和kcat13

13、。1.2.8木聚糖酶酶活力和蛋白含量的測定采用3,5-二硝基水楊酸法測定木聚糖酶酶活力14。將500L稀釋至適當(dāng)濃度的酶液與500L樺木木聚糖底物(pH4.0，10mg/mL)混合，在50條件下反應(yīng)10min后用3,5-二硝基水楊酸試劑終止反應(yīng)。反應(yīng)的樣品于沸水內(nèi)顯色5min后立即用水冷卻，并在545nm條件下測定吸光度。酶活力單位(U/mL)定義為1min水解木聚糖所產(chǎn)生的1mol還原糖所需的酶量。蛋白濃度的測定采用了BCA法，以牛血清蛋白為標(biāo)準品。2結(jié)果與分析2.1xynA基因的克隆與載體的構(gòu)建以A.nigerAG11基因組為模板，通過PCR擴增xynA基因。電泳分析顯示，PCR產(chǎn)物大小約

14、為750bp，與理論值相似(圖1-a)。將PCR產(chǎn)物分別克隆至pET-28a(+)和pET-22b(+)-xynA的NcoI-XhoI位點，得到編碼xynA的質(zhì)粒pET-28a(+)-xynA和pET-22b(+)-xynA。基于一步克隆法刪除pET-28a(+)-xynA和pET-22b(+)-xynA中xynA的內(nèi)含子序列，進一步構(gòu)建得到xynA表達質(zhì)粒pET-28a(+)-xynA和pET-22b(+)-xynA(圖1-b)。其中，pET-22b(+)-xynA編碼了pelB信號肽，將促進融合在其下游xynA的分泌表達。上述表達質(zhì)粒序列均經(jīng)測序驗證。M-DNAmarker;1-xynAa

15、-xynA基因的擴增產(chǎn)物核酸膠圖；b-pET-28a(+)-xynA和pET-22b(+)-xynA載體圖譜圖1xynA基因的克隆與載體構(gòu)建Fig.1CloningofxynAgeneandvectorsconstruction2.2重組xynA的表達將pET-28a(+)-xynA載體轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE)中，轉(zhuǎn)接后OD600值達到1.0時添加IPTG，使終濃度為0.1mmol/L，25發(fā)酵24h并收集菌體。經(jīng)超聲破碎，在沉淀和上清液中都有20kDa左右的條帶(圖2-a)，但空白對照中不存在該條帶，初步判斷E.coliBL21(DE)成功表達xynA，同時存在部分包涵體。用MALD

16、I-TOF/MS對該條帶進行質(zhì)譜分析,確定為A.nigerCBS513.88來源的木聚糖酶(圖3)。對胞內(nèi)上清液和沉淀分別測定酶活力，上清液中xynA活力為10.4U/mL(圖2-c)，而沉淀中的包涵體不具有活性。為實現(xiàn)胞外表達，將pET-22b(+)-xynA轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE)并進行搖瓶發(fā)酵。分別對胞外上清液、胞內(nèi)上清液和沉淀進行酶活力測定和SDS檢測(圖2-b)。結(jié)果顯示在胞外上清液中存在xynA條帶，而胞內(nèi)上清液和沉淀中也存在對應(yīng)條帶。其中，pelB作為大腸桿菌中高效的信號肽，被融合到xynA的N端，可將外源蛋白引導(dǎo)至周質(zhì)空間并轉(zhuǎn)移到胞外，提高xynA的可溶性。在胞外上清液

17、中可測得xynA活力為8.5U/mL(圖2-c)。與空白對照組比較，在SDS圖中可基本確定目的條帶(圖2-b)，而在不添加pelB信號肽的重組菌胞外上清液中未測得酶活力。以上結(jié)果說明，在添加信號肽后胞內(nèi)部分xynA成功分泌至胞外。同時，在胞內(nèi)上清液中也檢測到xynA活力為0.8U/mL(圖2-c)，并在SDS圖上顯示對應(yīng)條帶(圖2-b)，表明胞內(nèi)依然存在部分包涵體，需進一步優(yōu)化誘導(dǎo)條件。M-蛋白質(zhì)marker；1-pET-28a(+)胞內(nèi)上清液空白對照；2-pET-28a(+)-xynA胞內(nèi)上清液；3-pET-28a(+)胞內(nèi)胞內(nèi)沉淀空白對照；4-pET-28a(+)-xynA胞內(nèi)沉淀；5-p

18、ET-22b(+)胞內(nèi)上清液空白對照；6-pET-22b(+)-xynA胞外上清液；7-pET-22b(+)-xynA胞內(nèi)上清液；8-pET-22b(+)-xynA胞內(nèi)沉淀；9-純化后的xynA條帶；10-pET-28a(+)/BL21(DE)空白對照；11-pET-28a(+)-xynA/BL21(DE)胞內(nèi)上清液酶活力；12-pET-28a(+)-xynA/BL21(DE)胞內(nèi)沉淀酶活力；13-pET-22b(+)-xynA/BL21(DE)胞外上清液酶活力；14-pET-22b(+)-xynA/BL21(DE)胞內(nèi)上清液酶活力；15-pET-22b(+)-xynA/BL21(DE)胞內(nèi)沉

19、淀酶活力a-pET-28a(+)-xynA在E.coliBL21(DE)中表達的SDS圖；b-pET-22b(+)-xynA在E.coliBL21(DE)中表達的SDS圖；c-pET-28a(+)-xynA和pET-22b(+)-xynA在E.coliBL21(DE)中表達的酶活力柱狀圖圖2重組xynA的表達情況分析Fig.2ExpressionanalysisofrecombinantxynA圖3重組xynA的MALDI-TOF/MS檢測結(jié)果Fig.3MALDI-TOF/MSresultofrecombinantxynA2.3重組xynA的分泌表達優(yōu)化分別取各組24h和36h時的發(fā)酵液，對比

20、胞外上清液中的xynA活力。在IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1mmol/L、誘導(dǎo)溫度為20、誘導(dǎo)OD600值為0.5，發(fā)酵至24h時的酶活力為10.2U/mL，比未經(jīng)優(yōu)化的條件下，發(fā)酵至24h時的酶活力提高20%。在發(fā)酵36h時胞外有15.8U/mL的最高酶活力，比初始條件下提高85.9%(圖4-a)。對該組收集的細胞進行超聲破碎并進行SDS檢測，顯示胞內(nèi)沉淀中的包涵體量有較明顯的減少(圖4-b)。對36h時各組胞外酶活力的數(shù)據(jù)進行處理，分別計算各因素下的k值和極差R，結(jié)果如表3所示。IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度的極差R高于誘導(dǎo)OD600值的極差，表明前2個因素對xynA胞外表達水平的影響更大。IPTG終濃

21、度為0.1mmol/L，誘導(dǎo)溫度為20時可減少包涵體的形成。但發(fā)酵36h的胞外酶活力比24h的酶活力高55%，說明20低溫誘導(dǎo)xynA需要更長的時間表達。而30發(fā)酵36h的胞外酶活力低于24h，較高溫度下誘導(dǎo)可以加速xynA的分泌表達，但發(fā)酵時間過長致使xynA部分失活。適當(dāng)?shù)亟档驼T導(dǎo)溫度，延長發(fā)酵時間可以提高xynA的可溶性表達水平。表336h發(fā)酵時間下不同因素的k值和極差RTable3ThekvalueandtherangeRofdifferentfactorsunder36hfermentationtimeM-蛋白質(zhì)marker；1-初始條件下的胞內(nèi)沉淀；2-最佳優(yōu)化條件下的胞內(nèi)沉淀a-

22、正交試驗各組條件下胞外xynA活力柱狀圖；b-初始條件與最佳條件下胞外沉淀的SDS圖圖4重組xynA胞外表達條件優(yōu)化Fig.4OptimizingextracellularexpressionofrecombinantxynA2.4重組xynA的酶學(xué)性質(zhì)2.4.1重組xynA的純化和動力學(xué)參數(shù)測定對發(fā)酵液進行離心并用0.22m的濾膜過濾，用20%的500mmol/LB液洗脫xynA，獲得單一的目的蛋白條帶。蛋白條帶與理論值相符，且無雜帶(圖2-b)。脫鹽后分別測定蛋白濃度和酶活力，計算得重組xynA的比酶活為175.1U/mg。當(dāng)以樺木木聚糖為底物時，測定重組xynA的動力學(xué)參數(shù)如表4所示。表

23、4以樺木木聚糖為底物時的重組xynA動力學(xué)參數(shù)Table4KineticparametersofxynAwithbetulaxylanassubstrate2.4.2重組xynA的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性測定如圖5所示，在2560，重組xynA的酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，50時測得最高酶活力。在2550酶活力緩慢上升，25反應(yīng)條件下有60%以上的相對酶活，說明在該溫度范圍內(nèi)xynA較穩(wěn)定。但當(dāng)反應(yīng)溫度超過50，xynA的相對酶活顯著下降，55時相對酶活力下降了40%，反應(yīng)溫度為60時，相對酶活力降至50%以下(圖5-a)。以上結(jié)果說明50為xynA的最適反應(yīng)溫度，但當(dāng)反應(yīng)溫度超過50，相對

24、酶活顯著下降，xynA在該反應(yīng)溫度下表現(xiàn)出較差的酶活力。a-重組xynA最佳反應(yīng)溫度曲線；b-重組xynA溫度穩(wěn)定性曲線；c-重組xynA不同溫度下的半衰期柱狀圖；d-重組xynA最佳反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性曲線圖5溫度和pH對重組xynA活性的影響Fig.5TheinfluenceoftemperatureandpHontheactivityofrecombinantxynA孵育溫度為40時xynA呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性，相對酶活力保持在97%以上，孵育時間為90min時未表現(xiàn)出下降趨勢。但當(dāng)溫度上升至55，孵育5min時殘留酶活力僅為8%，10min時xynA全部失活，而60孵育5min時已檢測不到xynA的酶活力(圖5-b)。經(jīng)計算得xynA在40的半衰期為182min。而45、50、55的半衰期分別僅為40時的33.3%、10%和2.6%(圖5-c)。表明xynA在40時具有最佳的熱穩(wěn)定性，而高于40熱穩(wěn)定性顯著下降。2.4.3重組xynA的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性測定當(dāng)反應(yīng)體系的pH為4.0時測得x