1、褪黑素對花萼海綿誘癌素誘導(dǎo)的神經(jīng)細絲過分磷酸化的影響及機制【關(guān)鍵詞】阿爾茨海默病摘要：目的探究褪黑素(el)對花萼海綿誘癌素(A)在成神經(jīng)瘤細胞誘導(dǎo)的神經(jīng)細絲過分磷酸化中的影響及其機制。要領(lǐng)接納鼠野生型成神經(jīng)瘤細胞(N2at)，賜與A處置懲罰，或同時賜與差異濃度el或維生素E(VitE)處置懲罰，并用免疫印跡法檢測神經(jīng)細絲磷酸化水安然平靜卵白磷酸酯酶2A(PP2A)含量，32P特異底物標(biāo)識表記標(biāo)幟技能檢測PP2A活性。效果A可在N2at細胞引起神經(jīng)細絲過分磷酸化，同時伴有PP2A含量和活性低落。el對A引起的神經(jīng)細絲過分磷酸化有庇護作用，且強于VitE；el同時對抗A誘導(dǎo)的PP2A活性和含量低

2、落。結(jié)論el可通過調(diào)治細胞內(nèi)PP2A的含量和活性而減輕A引起的神經(jīng)細絲過分磷酸化。關(guān)鍵詞：阿爾茨海默??；花萼海綿誘癌素；褪黑素；神經(jīng)細絲；過分磷酸化KEYRDS:AlzhEiersdisease;alyulinA;elatnin;neurfilaent;hyperphsphrylatin阿爾茨海默病(Alzheiersdisease,AD)是一種以舉行性影象減退和認知成效停滯為重要臨床病癥的神經(jīng)退行性疾病，神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurfibrillarytangles,NFTs)是其重要病理特性之一。NFTs重要由非常過分磷酸化的tau卵白構(gòu)成，tau卵白作為細胞內(nèi)的重要骨架卵白，對微管組裝、維持

3、微管不變性都具有緊張作用。神經(jīng)細絲(neurfilaent，NF)是骨架卵白中的中心絲，由低(NFL)、中(NF)、高(NFH)分子量的三種亞基構(gòu)成，它與微管、微管相干卵白(包羅tau卵白在內(nèi))等其他骨架卵白存在普及的彼此作用，并配合維持著細胞骨架的正常布局。Nany等證明非常過分磷酸化的神經(jīng)細絲也是NFTs的緊張構(gòu)成身分，因此其在AD發(fā)病機制中的作用也日益受到器重。褪黑素(elatnin，el)是由松果體排泄的一種具有多種生物學(xué)成效的內(nèi)排泄激素，隨著年事的增長其排泄量漸漸落落。研究創(chuàng)造AD患者腦脊液中el的程度明顯低于同年事正凡人群，臨床上AD患者賜與el后，可以改進某些患者的認知成效。因此

4、，el排泄紊亂在AD的發(fā)病歷程中大概起緊張作用。比來有人報道，el可阻斷或逆轉(zhuǎn)岡田酸(kadaiaid,A)在神經(jīng)瘤細胞(N1E115)引起的氧化應(yīng)激、細胞凋亡和微管粉碎。我們曾報道el可對抗花萼海綿誘癌素(alyulinA,A)在SY5Y細胞引起的神經(jīng)細絲過分磷酸化。為進一步研究el對抗A引起的神經(jīng)細絲過分磷酸化的機制，我們別離用el和維生素E(vitainE,VitE)與A同時處置懲罰成神經(jīng)瘤細胞N2at，用免疫印跡法檢測神經(jīng)細絲磷酸化水安然平靜PP2A含量，免疫標(biāo)識表記標(biāo)幟技能檢測PP2A活性。效果創(chuàng)造el和VitE可對抗A引起的神經(jīng)細絲過分磷酸化，同時el對抗A引起的PP2A活性低落和

5、含量低落。本實行進一步展現(xiàn)了el和VitE對抗A誘導(dǎo)的神經(jīng)細絲磷酸化的機制。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1重要試劑DE、ptiE、胎牛血清(FBS)購自美國Gibi公司；丙烯酰胺(Ar)、N，N亞甲叉雙丙烯酰胺(Bis)、四甲基乙二胺(TEED)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甘氨酸(Glyine)、小牛血明凈卵白(BSA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、el、VitE均為美國Siga公司產(chǎn)物；過硫酸銨(AP)、二喹啉甲酸(BA)卵白檢測試劑盒購自美國Piere公司；硝酸纖維素膜(N膜)為Hybnd公司產(chǎn)物；單克隆抗體SI31(識別磷酸化的NFH、NF，15000)、SI32(識別非磷酸化的NFH、NF，15

6、000)、R123d(識別PP2A的催化亞單元，11500)購自Sternberger公司，所用抗體稀釋液為50g/L脫脂奶粉，TBS/T配制；辣根過氧化物酶標(biāo)識表記標(biāo)幟的二抗和EL顯色體系購自Santaruz公司；A購自美國Biheial公司；32PATP購自北京亞輝生物醫(yī)藥公司。1.2細胞造就鼠野生型成神經(jīng)瘤細胞貼壁生長細胞株(N2at)由許華熙傳授(TheBurnhaInstitute,LaJlla,alifrnia,USA)提供，細胞用含50g/L胎牛血清(FBS)的DE/ptiE(11)造就基，在5%(體積分?jǐn)?shù))2、37造就箱內(nèi)舉行造就，每2-3d調(diào)換造就液一次，細胞達約70%-80

7、%品貌時，傳代或用于實行。給藥處置懲罰前，細胞用無血清造就基造就12h誘導(dǎo)分化。細胞分為6組：正常比擬組，參加含DS(0.01%體積分?jǐn)?shù))的造就基；A組，參加5nl/LA；25l/Lel組，參加5nl/LA同時參加25l/Lel；50l/Lel組，參加5nl/LA同時參加50l/Lel；100l/Lel組，參加5nl/LA同時參加100l/Lel；VitE組，參加5nl/LA同時參加50l/LVitE。1.3卵白質(zhì)印跡闡發(fā)按上述分組加藥處置懲罰細胞12h后，棄造就基，預(yù)冷的PBS洗2次，參加細胞裂解液90L(50l/LTrislpH8.0，150l/LNal,10L/LTritn，1g/LSD

8、S，0.2g/LNaN3，100g/LPSF，1g/Laprtinin，PSF和aprtinin臨用前參加)，在冰上靜置10in，用細胞刮刮起細胞并轉(zhuǎn)移到EP管中，參加4加樣緩沖液30L，煮沸10in，超聲破裂(35s)，12000g離心10in，取上清。取樣品參加各個泳道(包管各泳道參加的樣品卵白總量為10g)，卵白質(zhì)經(jīng)7.5%SDSPAGE凝膠電泳分散后被轉(zhuǎn)移至N膜上；N膜用50g/L脫脂牛奶室溫關(guān)閉1h，別離參加單克隆抗體SI31、SI32，R123d，4孵育留宿，然后用含1g/LTeen20的TBS(TTBS)漂洗(35in)；再參加得當(dāng)稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)識表記標(biāo)幟的二抗，37孵育

9、1h，TTBS漂洗(35in)；參加EL顯色液，顯色1in，停頓顯色并將膠片置于N膜上，在暗室里曝光30s，免疫印跡效果掃描后用圖象闡發(fā)體系闡發(fā)。1.4PP2A活性測定根據(jù)Gng等的要領(lǐng)。在磷酸化緩沖液(單元：l/L，TrisHl40、pH8.5,E20，al20.2，gl215)中，磷酸化酶b(Phb，2g/L)和0.5l/L32PATP及10g/L磷酸化酶激酶(PhK)，在30孵育10in后，Phb被磷酸化為Pha并有一部門被32P標(biāo)識表記標(biāo)幟；32P標(biāo)識表記標(biāo)幟的磷酸化酶a(32PPha)經(jīng)SephadexG50柱與游離ATP(Free32P)分散，網(wǎng)絡(luò)組分中32PPha的放射性/(Fr

10、ee32P的放射性+32PPha的放射性)100%95%作為PP2A的底物。PP2A催化32PPha開釋出32P，根據(jù)32P的開釋量可判斷PP2A的活性。反響體系總體積20L，含Tris50l/L、pH7.0，BE10l/L，EDTA0.1l/L，affeine7.5l/L，7.5g/L32PPha和0.06g/L細胞提取物及0.2g/L按捺因子1(PP1的特異性按捺劑)，反響以參加32PPha開始，30舉行30in，參加10L停頓液(4l/LATP、200g/L三氯乙酸溶解)停頓反響，取7L反響混淆物點到層析紙上，開釋出的32P在50g/L三氯乙酸(0.2l/LNal溶解)層析液中通過上行色

11、譜法與底物分散。然后用erenkv液閃儀舉行閃耀計數(shù)闡發(fā)。1.5統(tǒng)計學(xué)處置懲罰實行數(shù)據(jù)以s表現(xiàn)，接納SPSS10.0統(tǒng)計闡發(fā)軟件行方差闡發(fā)，以P0.05為差異有明顯性。2效果2.1el和VitE對A誘導(dǎo)的神經(jīng)細絲磷酸化的影響本研究用識別磷酸化的神經(jīng)細絲(NFH，NF)的抗體SI31和識別非磷酸化的神經(jīng)細絲(NFH，NF)的抗體檢測神經(jīng)細絲的磷酸化狀態(tài)。神經(jīng)細絲的免疫印跡效果表現(xiàn)：A處置懲罰后SI31顯色明顯加強(圖1A)，而SI32顯色明顯削弱(圖1B)；25、50、100l/Lel和VitE使SI31顯色削弱(圖1A)，SI32顯色加強(圖1B)。圖象闡發(fā)效果進一步表現(xiàn)：el在50l/L時對

12、神經(jīng)細絲的磷酸化的庇護作用最強，且比同濃度的VitE的作用更強。效果提示A處置懲罰12h后N2at細胞的神經(jīng)細絲產(chǎn)生了磷酸化，el和VitE對A誘導(dǎo)的神經(jīng)細絲的磷酸化有庇護作用。圖1el和VitE對A誘導(dǎo)的神經(jīng)細絲磷酸化的影響略2.2el和VitE對A引起的PP2A活性變革的影響我們從前報道了el對A和A引起的神經(jīng)細絲的過分磷酸化都有庇護作用4,7，因此我們推測el對骨架卵白磷酸化的庇護作用大概與其升高PP2A活性有關(guān)。為了進一步探究el對A引起的神經(jīng)細絲過分磷酸化的庇護機制，我們用32P特異底物標(biāo)識表記標(biāo)幟技能檢測PP2A活性。效果表現(xiàn)：A組細胞內(nèi)PP2A活性與正常比擬組比擬明顯低落(P0.

13、01)；25、50、100l/Lel處置懲罰組的PP2A活性與A組比擬均明顯升高(P0.01)，但隨el濃度升高，PP2A活性升高程度低落；VitE組的PP2A活性與A組比擬明顯低落(P0.01)。效果提示低、中、高濃度el對A誘導(dǎo)的PP2A活性低落均有庇護作用，而VitE對之無庇護作用(圖2)。圖2el和VitE對A誘導(dǎo)的PP2A活性低落的影響略2.3el和VitE對A引起的細胞內(nèi)PP2A含量的影響為進一步探究el對抗A引起的PP2A活性低落的機制。我們用識別PP2A的單克隆抗體R123d檢測細胞內(nèi)PP2A含量。效果創(chuàng)造：A組的R123d顯色較正常比擬組削弱(P0.01)；25l/Lel組和

14、50l/Lel組的R123d顯色強于A組(P0.01)；100l/Lel組和VitE組的R123d顯色與A組比擬無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。效果表白A明顯低落細胞內(nèi)PP2A程度，25、50l/Lel可部門對抗A引起的細胞內(nèi)PP2A程度低落(圖3)。圖3el和VitE對A誘導(dǎo)的PP2A含量低落的影響略3討論我國粹者曾報道AD患者腦和腦脊液中磷酸化的NFH和NF程度明顯升高，PP2A和PP1的特異性按捺劑A處置懲罰人神經(jīng)瘤細胞SY5Y后，細胞出現(xiàn)了相似的效果。比來，我們創(chuàng)造PP2A和PP1的另一種按捺劑A處置懲罰SY5Y細胞也可引起神經(jīng)細絲過分磷酸化。在本實行中，我們創(chuàng)造A處置懲罰N2at細胞后，

15、細胞內(nèi)神經(jīng)細絲產(chǎn)生過分磷酸化，PP2A含量明顯低落，但PP2A活性輕度低落。我們曾報道A處置懲罰后，細胞內(nèi)出現(xiàn)顯著的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，同時細胞內(nèi)GSK3活性明顯升高。根據(jù)報道，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可激活GSK3引起tau卵白過分磷酸化，我們以為A引起神經(jīng)細絲過分磷酸化的機理不但與其低落PP2A含量和PP2A活性有關(guān)，并且還與其促進氧化應(yīng)激有關(guān)。el既具有脂溶性，也具有水溶性，輕易通過血腦屏蔽進著迷經(jīng)細胞。研究表白，el可逆轉(zhuǎn)或阻斷A引起的氧化應(yīng)激、細胞凋亡、骨架卵白粉碎。在本實行中，我們創(chuàng)造低、中、高濃度el均可部門對抗A引起的神經(jīng)細絲過分磷酸化，但高濃度el的對抗作用比低、中濃度的作用弱；同時，el還可升高PP2A活性，但隨el濃度升高，其升高PP2A活性的作用削弱；VitE雖低落PP2A活性，但也可部門對抗A誘導(dǎo)的神經(jīng)細絲過分磷酸化。我們推測其大概原由于：VitE部門對抗A引起的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，從而對抗A引起的GSK3活性升高；同時VitE低落PP2A活性，又使Ser9磷酸化的GSK3去磷酸化淘汰，從而Ser9磷酸化的GSK3占總GSK3的比例升高，GSK3活性低于正常，進而規(guī)復(fù)GSK3/PP2A平衡，對抗A引起的神經(jīng)細絲過分磷酸化。詳細機制尚需