1、生物化學試驗課件生物化學試驗課件實驗室安全守則一、實驗課規則1、實驗室是師生進行實驗教學的活動場所，學生進入實驗室后要保持肅靜，遵守紀律。提前5分鐘進入實驗室。2、做實驗前，認真聽教師講解實驗目的，步驟，儀器的性能操作方法和注意事項、認真檢查所需儀器設備，藥品是否齊全、完好，如有缺損要及時向教師報告。3、實驗時要遵守操作規程，按照實驗步驟認真操作，嚴禁違規操作，嚴禁未經教師指導、許可私自操作。實驗必須按步驟進行，并仔細觀察，做好記錄，課后及時寫好實驗報告。4、實驗過程中如發生故障或異常情況，應及時報告老師，防止意外事故發生。5、應愛護實驗器材，愛惜藥品，不隨意玩弄器材藥品。實驗完畢，應及時洗滌

2、器皿，并把器材、藥品按規定位置放好，嚴禁私自帶走器材、藥品。6、實驗結束，要將儀器整理成洗凈，保持桌面，室內的整潔，認真清理儀器設備，關閉水源電源。由老師檢查后才能離開。實驗室安全守則一、實驗課規則實驗室安全守則二、安全用電原則：1、不要私自連接實驗桌上的插頭、插座不要私自拆卸實驗桌上的插頭、插座。2、使用學生電源時，打開開關之前檢查是否已將用電器連入電路中，如果沒有，須重新連接電路。3、如果發現電線絕緣層已損壞，須告知實驗老師，切不可用手直接接觸。三、使用化學藥品制度：1、取用固體化學藥品用藥匙，不可用手拿。2、取用少量液體藥品用滴管，大量使用時口對口傾倒，一定要膽大心細。如不慎手上粘有藥品

3、。應立即用水沖洗。3、如果不慎將腐蝕性試劑滴到手上，應立即用抹布擦干，再用大量的水清洗。若不慎濺入眼中，應立即用清水沖洗，并告知實驗老師。實驗室安全守則二、安全用電原則：一、目的掌握還原糖定量測定的基本原理；學習比色定糖法的基本操作；熟悉分光光度計的使用方法。一、目的掌握還原糖定量測定的基本原理；二、原理堿性條件加熱3-氨基-5-硝基水楊酸糖酸還原糖3,5-二硝基水楊酸在一定范圍內，還原糖的量與棕紅色物質顏色深淺的程度成一定的比例關系（540nm波長吸收）；還原糖：具有還原性的糖類。分子中含有游離醛基或羰基的單糖和含有游離醛基的二糖都具有還原性。常見的有葡萄糖、果糖、半乳糖、麥芽糖等；淀粉中所

4、含各種單糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖；利用溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來；二、原理堿性條件加熱3-氨基-5-硝基水楊酸糖酸還原糖3三、實驗材料、儀器、試劑實驗材料：面粉儀器：1、25mL 刻度試管(9個);2、大離心管(2個); 3、100mL燒杯(1個) ;4、100mL容量瓶(1個); 5、1mL, 2mL, 20mL刻度吸管各一個; 6、恒溫水浴鍋; 7、離心機;8、電子天平; 9、分光光度計;三、實驗材料、儀器、試劑實驗材料：面粉試劑:（1）1 mg/mL葡萄糖標準液：準確稱取100mg分析純葡萄糖，置于小燒杯中，用少量蒸餾水熔解后，定量轉移到10

5、0mL的容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，搖勻，冰箱中保存備用。（2）3,5-二硝基水楊酸試劑：將6.3g 3,5二硝基水楊酸和262mL 2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，貯于棕色瓶中備用。試劑:（1）1 mg/mL葡萄糖標準液：準確稱取100mg分四、實驗步驟葡萄糖標準曲線制作：取7支試管，編號，按表1-1所示的量，精確加入葡萄糖標準液和3,5二硝基水楊酸及蒸餾水，搖勻，沸水浴中加熱5min，取出后立即用冷水冷卻至室溫，再向每管加入21.5mL蒸餾水，用橡皮塞塞住管口，顛倒混勻，在54

6、0nm波長下，用0號管調零，分別讀取16號管的吸光值。以吸光值為縱坐標，葡萄糖毫克數為橫坐標，繪制標準曲線。項目 管號0123456葡萄糖標準液(mL)00.20.40.60.81.01.2蒸餾水(mL)2.01.81.61.41.21.00.83,5二硝基水楊酸試劑(mL)1.51.51.51.51.51.51.5表1-1 葡萄糖標準曲線的測定四、實驗步驟葡萄糖標準曲線制作：項目 樣品中還原糖的提取：稱取3g食用面粉，放在100mL的燒杯中，先以少量蒸餾水調成糊狀，然后加50mL蒸餾水，攪勻，置于50oC恒溫水浴中保溫20min，攪拌，使還原糖浸出，離心（4000rpm 10min），用20

7、mL蒸餾水洗，混勻殘渣，再離心，將兩次離心的上清液全部收集在100mL的容量瓶中，用蒸餾水定容，混勻，作為還原糖待測液。顯色和比色：取2試管，編號，按表1-2所示的量，精確加入待測液和試劑。加完試劑后，其余操作均與制作葡萄糖標準曲線時相同，測定各管吸光值。表1-2 還原糖含量的測定項 目 編號 還原糖測定管號還原糖待測液（mL）22蒸餾水（mL）003,5二硝基水楊酸試劑(mL)1.51.5樣品中還原糖的提取：表1-2 還原糖含量的測定項 目 五、結果與計算實驗數據記錄表用各管平均A值（吸光度）繪制標準曲線圖測定次數各管A值（吸光度）1234567123平均值五、結果與計算實驗數據記錄表用各管

8、平均A值（吸光度）繪制五、結果與計算以管、的吸光值平均值，分別利用標準曲線所求得的公式計算出還原糖毫克數，按下式計算出樣品中還原糖的百分含量。五、結果與計算以管、的吸光值平均值，分別利用標準曲線所求思考題1使用紫外分光光度計時應注意哪些事項？2思考在沒有離心機的情況下怎樣設計一套方案完成本實驗?3為什么標準曲線制作與樣品含糖量測定應同時進行，一起顯色和比色？4關于糖的測定除了本實驗中涉及的水楊酸比色法還有另一種蒽酮比色定糖法，查找相關資料，比較兩種方法有何異同？思考題1使用紫外分光光度計時應注意哪些事項？實驗二 可溶性糖的硅膠G薄層層析東北大學生命科學與健康學院實驗二 可溶性糖的硅膠G薄層層析

9、東北大學生命科學與健康學院一、目的了解薄層層析的一般原理；掌握硅膠G薄層層析的基本技術及其在可溶性糖分離鑒定中的應用。一、目的了解薄層層析的一般原理；二、原理植物組織中的可溶性糖可用一定濃度的乙醇提取出來，并可通過一定的手段，去除蛋白質，獲得較純的可溶性糖的混合液。糖為多羥基化合物，具有較強的極性，在硅膠G層上遷移時，與硅膠分子間有一定吸附力，糖羥基多少不同，與硅膠吸附力存在差異，該吸附力的大小順序為：三糖二糖已糖戊糖。極性不同的糖在硅膠G層上展層時，遷移率(Rf)不同，通過與已知糖的Rf相比較，可分離鑒定植物樣品提取液中糖的種類。二、原理植物組織中的可溶性糖可用一定濃度的乙醇提取出來，并可三

10、、實驗材料、儀器、試劑實驗材料：蘋果儀器：1、離心機及大離心管； 2、藥物天平； 3、研缽； 4、蒸發皿； 5、量筒：25mL, 10mL； 6、恒溫水浴鍋； 7、層析缸； 8、微量點樣管(毛細管)； 9、玻璃板7.515cm； 10、吹風機、噴霧器、烘箱；三、實驗材料、儀器、試劑實驗材料：蘋果試劑（1）95%乙醇（2）80%乙醇（3）10%Pb(Ac)2 （4）飽和Na2SO4（5）氯仿 （6）冰乙酸（7）1%標準糖溶液(10 mg/mL)：木糖，果糖，葡萄糖，蔗糖 （8）苯胺-二苯胺-磷酸顯色劑：2g二苯胺，加2mL苯胺，10mL 85%磷酸，1mL HCl，100mL丙酮，溶后搖勻，置于

11、棕色瓶中。試劑（1）95%乙醇（2）80%乙醇四、實驗步驟1硅膠G薄板的制備稱取硅膠G粉3.5g，羧甲基纖維素納0.03g，加入0.1M 硼酸溶液9-12mL，于研缽中充分研磨，待硅膠G開始變稠時, 傾入玻璃板上(7.515cm)，快速鋪板，并震蕩均勻，鋪層后的薄板放置在實驗臺上，用前于110oC烘箱中活化1 h。四、實驗步驟1硅膠G薄板的制備實驗步驟2蘋果中可溶性糖提取液的制備：洗凈蘋果，去果皮，稱5g果肉，在研缽中將果肉磨成勻漿，裝入大離心管中，用20mL 95%乙醇，洗滌研缽，洗滌液加入離心管中，浸提30min，然后3500rpm，離心10min，上清液傾入另一大離心管中，殘渣加5mL

12、80%乙醇洗滌，離心取上清液。重復兩次，合并上清液，于70oC水浴上預熱上清液，趁熱逐滴加入10%中性醋酸鉛溶液，沉淀蛋白質。然后再逐滴加入飽和硫酸鈉，沉淀多余的鉛，3500rpm，離心10min，收集上清液，放入蒸發皿中，飄在水浴鍋中。于70oC水浴上蒸干，析出物質以35mL蒸餾水溶解，即得糖抽提液。實驗步驟2蘋果中可溶性糖提取液的制備：實驗步驟3蘋果提取液中可溶性糖的分離鑒定：取活化過的硅膠G玻板一塊，在距底邊1.5cm水平線上確定5個點，相互間隔1 cm，其中4個點分別點上木糖、葡萄糖、果糖和蔗糖標準溶液適量，另一個點點上蘋果提出液適量，以氯仿冰乙酸水=30355為展層劑，將玻璃板放入層

13、析缸中展層。當展層劑前沿達距薄板頂端約1 cm處，停止層析，取出玻璃板以吹風機吹干。然后以苯胺-二苯胺-磷酸噴霧，于85oC烘箱中烘10min，各種糖即顯出不同顏色，與標準糖比較，根據色斑顏色及Rf值即可鑒定出蘋果提取液中所存在的可溶性糖種類。實驗步驟3蘋果提取液中可溶性糖的分離鑒定：五、結果與計算顯色后照相或繪圖記錄層析圖譜，也可用CS-930進行掃描其展層圖譜。Rf（值）=溶質斑點中心到點樣點的距離溶劑前沿到點樣點的距離五、結果與計算顯色后照相或繪圖記錄層析圖譜，也可用CS-93思考題1本實驗中薄層層析的原理是什么?2影響Rf值的因素有哪些？3根據薄層層析原理，選擇展層溶劑時應注意些什么？

14、4查找相關資料，熟悉用薄層層析方法分離各類物質常用的固定相、流動相和顯色劑？思考題1本實驗中薄層層析的原理是什么?實驗三 酵母核糖核酸的提取東北大學生命科學與健康學院實驗三 酵母核糖核酸的提取東北大學生命科學與健康學院一、目的學習和掌握從酵母中提制RNA的原理和方法，從而加深對核酸性質的認識；一、目的學習和掌握從酵母中提制RNA的原理和方法，從而加深對二、原理酵母核酸中主要是RNA (2.6710.0%)，DNA很少 (0.030.516%)，而且菌體容易收集，RNA也易于分離。RNA提取方法：先使利用高濃度的鹽改變細胞膜的通透性，使RNA從細胞中釋放，并使它和蛋白質分離，再根據核酸在等電點時

15、溶解度最小的性質，將pH調至2.02.5，使RNA沉淀，進行離心收集。該方法提取RNA時應注意掌握溫度，避免在2027oC之間停留時間過長，因為磷酸二酯酶和磷酸單酯酶在該溫度范圍活性較高，會使RNA降解進而降低提取率。加熱至90100oC可使蛋白質變性，破壞該類酶，有利于RNA的提取。二、原理酵母核酸中主要是RNA (2.6710.0%)，D三、實驗材料、儀器、試劑實驗材料：干酵母 儀器：1、50mL 量筒； 2、100mL 燒杯； 3、250mL，50mL，10mL燒杯； 4、40mm 布氏漏斗； 5、125mL吸濾瓶； 6、6cm表面皿； 7、UV-5200紫外分光光度計； 8、離心機；

16、9、恒溫水浴； 10、藥物天平； 11、烘箱三、實驗材料、儀器、試劑實驗材料：干酵母 試劑（1）NaCl（化學純）（2）6mol/L HCl（3）95%乙醇（化學純）試劑（1）NaCl（化學純）四、實驗步驟1RNA 提取稱取干酵母粉5g，倒入100mL燒杯中，加NaCl 5g，水50mL，攪拌均勻，置于沸水浴中提取1h。2. RNA 與菌體分離將上述提取液取出，用自來水冷卻，裝入大離心管內，以3500rpm離心10min，留取上清，使提取液與菌體殘渣等分離。四、實驗步驟1RNA 提取實驗步驟3沉淀RNA 將離心得到的上清液傾于100mL燒杯中，并置于放有冰塊的250mL燒杯中冷卻，待冷至10o

17、C以下時，用6mol/L HCl小心地調節pH至2.02.5，隨著pH下降，溶液中白色沉淀逐漸增加，至等電點時沉淀量最多（注意嚴格控制pH），調好后繼續于冰水中靜置10min，使沉淀充分，顆粒變大。實驗步驟3沉淀RNA實驗步驟4洗滌和抽濾 上述懸浮液以3500rpm離心10min，得到RNA沉淀，將沉淀物放在10 mL小燒杯內，用95%的乙醇510mL充分攪拌洗滌，在布氏漏斗上用水泵抽氣過濾后，用95%乙醇510mL淋洗3次。 由于RNA不溶于乙醇，洗滌不僅可脫水，使沉淀物疏松，便于過濾、干燥，而且可除去可溶性的脂類及色素等雜質，提高了制品的純度。實驗步驟4洗滌和抽濾實驗步驟5干燥 從布氏漏斗

18、上取下沉淀物，放在表面皿上，鋪成薄層，置于80oC烘箱內干燥（約10min)，將干燥后的RNA制品稱重。6含量測定 將干燥后的RNA產品用500mL容量瓶定容，配制成濃度為4080g/mL的溶液，用蒸餾水作空白，在分光光度計上測定其260nm處的吸光度，如果產物較多超過范圍,可以定容后再稀釋,但是計算時要乘上稀釋倍數實驗步驟5干燥五、結果與計算根據含量測定的結果按下式計算提取率：式中：A260為260nm處的吸光度；L為比色杯光徑（cm）；0.024為1mL溶液含1g RNA的吸光度。按下式計算RNA含量五、結果與計算根據含量測定的結果按下式計算提取率：式中：A2思考題本實驗為什么選擇酵母作為

19、提取RNA的材料？2用濃鹽法提取RNA的原理是什么？3提取制備RNA常用的方法是哪幾種？各自原理？有何優點？4制備RNA應注意哪些問題？思考題本實驗為什么選擇酵母作為提取RNA的材料？實驗四 DNA瓊脂糖凝膠電泳東北大學生命科學與健康學院實驗四 DNA瓊脂糖凝膠電泳東北大學生命科學與健康學院一、目的學習并掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理和基本操作；通過DNA瓊脂糖凝膠電泳可知DNA的純度、含量和相對分子質量。一、目的學習并掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理和基本操作；二、原理瓊脂糖凝膠電泳是分子生物學中最常用DNA分離和鑒定方法，根據不同構像和分子量的DNA在瓊脂糖凝膠中的泳動速度不同進而對DNA進行分離和鑒定

20、。DNA分子在高于其等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。 二、原理瓊脂糖凝膠電泳是分子生物學中最常用DNA分離和鑒定方DNA分子在瓊脂糖凝膠中的泳動速度與電荷、分子大小及構象有關。由于構成DNA的糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此能以同樣的速度向正極移動。泳動速度與DNA分子相對分子質量的對數成反比；DNA分子的構象也影響其遷移速度，同樣相對分子量的DNA，超螺旋共價閉環質粒DNA遷移速度最快，線狀DNA其次，開環DNA最慢。DNA分子在瓊脂糖凝膠中的泳動速度與電荷、分子大小及構象有關瓊脂糖含量/%最佳線性DNA分辨范圍0.5130kb0

21、.70.812kb1.00.5 10kb1.24007000bp1.520030002502000瓊脂糖含量/%最佳線性DNA分辨范圍0.5130kb0.7觀察瓊脂糖凝膠中DNA的最簡便方法是利用熒光染料溴乙錠染色，EB在紫外燈照射下，發出紅色熒光。當DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，加入的EB插入DNA分子中形成熒光結合物，使發射的熒光增強幾十倍，熒光的強度正比于DNA的含量。GoldView是一種可代替溴化乙錠（EB）的新型核酸染料，與核酸結合后能產生很強的熒光信號，其靈敏度與EB相當，在紫外透射光下雙鏈DNA呈現綠色熒光，而且也可用于染RNA。綜上所述，通過DNA瓊脂糖凝膠電泳可知DNA的

22、純度、含量和相對分子質量。觀察瓊脂糖凝膠中DNA的最簡便方法是利用熒光染料溴乙錠染色，三、實驗材料、儀器、試劑實驗材料：質粒DNA，PCR產物儀器：1、Eppendorf管 2、Tip 3、一次性手套 4、移液器 5、錐形瓶 6、量筒 7、微波爐 8、穩壓電泳儀 9、凝膠成像儀 10、水平式電泳槽 11、天平 12、制膠槽 三、實驗材料、儀器、試劑實驗材料：質粒DNA，PCR產物試劑（1）TAE緩沖液40 mM Tris-乙酸鹽，1 mM EDTA (pH8.0)（2）凝膠加樣緩沖液0.2%溴酚藍，50%蔗糖 ：稱取溴酚藍200mg，加重蒸水10mL，在室溫下過夜，待溶解后再稱取蔗糖50g，加

23、重蒸水溶解后移入溴酚藍溶液中，搖勻后加重蒸水定容至100mL，加10 M NaOH 12滴，調至藍色。（3）瓊脂糖 （4） GoldView（5）DNA相對分子質量標準品(DL2000 marker) （6）質粒及PCR產物 試劑（1）TAE緩沖液四、實驗步驟1瓊脂糖凝膠的制備稱取0.25g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入25mL 1TAE緩沖液，置微波爐或水浴鍋中加熱至完全溶化，取出搖勻（看不見顆粒，也可以邊加熱邊搖勻），瓊脂糖終濃度為1%。待瓊脂糖凝膠溶液冷卻至約50oC，再加入GoldView，搖勻。四、實驗步驟1瓊脂糖凝膠的制備實驗步驟2凝膠板的制備(1)將制膠槽置于水平位置。(3)選擇孔徑

24、適宜的梳子，垂直架在有機玻璃內槽的一端，使梳齒距玻璃板之間尚有約1.0mm的距離。(4)將冷到50oC左右的瓊脂糖凝膠，緩緩倒入有機玻璃內槽，厚度適宜(不要有氣泡)。(5)待凝膠凝固后，小心取出梳子，將膠放入電泳槽內，含上樣孔的一端位于負極。(6)加入足夠的TAE電泳緩沖液，使液面略高出凝膠面。實驗步驟2凝膠板的制備實驗步驟3加樣取4L待測質粒DNA， 加1L溴酚藍指示劑，混勻后用移液器將其加入加樣孔(梳孔)，PCR產物直接取8L加入上樣孔，marker 5L加入上樣孔記錄樣品點樣次序與點樣量。4電泳(1)接通電泳槽與電泳儀電源(DNA片段從負極向正極移動)，DNA的遷移速度與電壓成正比。(2

25、)當溴酚藍染料移動到距凝膠前沿約2cm處，停止電泳。實驗步驟3加樣五、結果與計算在紫外燈下觀察凝膠，有DNA處應顯出橘紅色熒光條帶。記錄電泳結果或直接拍照。PCR產物質粒DNA五、結果與計算在紫外燈下觀察凝膠，有DNA處應顯出橘紅色熒光思考題 1制膠過程應注意哪些問題？2結合實驗過程總結點樣的關鍵技術3你在紫外燈下都觀察到什么了?怎么解釋?思考題 1制膠過程應注意哪些問題？東北大學生命科學與健康學院實驗五 用DNS法鑒定蛋白質或多肽的N-端氨基酸東北大學生命科學與健康學院實驗五 用DNS法鑒定蛋白質或多一、目的了解并掌握DNS-氨基酸聚酰胺薄膜層析鑒定蛋白質或多肽的N-端氨基酸。一、目的了解并

26、掌握DNS-氨基酸聚酰胺薄膜層析鑒定蛋白質或多二、原理DNS-Cl在堿性條件下與蛋白質或多肽的N-端氨基結合生成DNS-蛋白質或DNS-多肽，再經酸水解可釋放出DNS-氨基酸，在紫外光照射下，產生強烈的黃色熒光，可用聚酰胺薄膜層析進行鑒定。二、原理DNS-Cl在堿性條件下與蛋白質或多肽的N-端氨基結二、原理DNS-Cl能與蛋白質的側鏈基團巰基、咪唑基、-氨基（epsilon-氨基）和酚羥基反應，前兩者在酸堿條件下均不穩定，酸水解時完全破壞；DNS-賴氨酸和DNS-O-酪氨酸較穩定，同時還有DNS-雙-賴氨酸和DNS-雙-酪氨酸生成，展層后在層析圖譜的位點上，都與DNS-氨基酸有區別。DNS-C

27、l在pH值過高時，水解產生副產物DNS-OH；DNS-Cl過量時，會產生DNS-NH2，在紫外光照射下，DNS-OH和DNS-NH2產生藍色熒光，而DNS-氨基酸產生黃色熒光，能明顯區分。二、原理DNS-Cl能與蛋白質的側鏈基團巰基、咪唑基、-氨三、實驗材料、儀器、試劑儀器：1、層析缸 2、聚酰胺薄膜(7cm7cm) 3、電吹風 4、紫外燈 5、點樣管 6、50mL離心管 7、水浴鍋 三、實驗材料、儀器、試劑儀器：1、層析缸 試劑（1）各種層析純標準氨基酸 （2）DNS-Cl丙酮溶液：稱取25mg DNS-Cl溶于10mL丙酮中，貯于棕色瓶中，1個月內有效。（3）1 M 氫氧化鈉（4）展層劑：

28、()V(甲酸，88%)：V(蒸餾水)=1.5：100 ()V(苯)：(冰醋酸)=9：1 （5）溶解了氨基酸的碳酸氫鈉溶液：稱取2.5mol層析純的氨基酸，溶于0.5mL 0.2M碳酸氫鈉溶液。試劑（1）各種層析純標準氨基酸 四、實驗步驟1DNS-標準氨基酸的制備取2mL溶解了氨基酸的碳酸氫鈉溶液于50mL的大試管中，加入2mL DNS-Cl丙酮溶液，用1M氫氧化鈉溶液調pH至9.09.5，于室溫避光反應24h，貯備于暗處。按后面所述的層析溶劑系統，做DNS-氨基酸的標準圖譜。2樣品的聚酰胺薄膜層析取聚酰胺薄膜(7cm7cm)一張，在距離相鄰邊緣各1.0cm處用鉛筆畫一相交直線，作為點樣原點（毛

29、面）。用點樣管取上述DNS-氨基酸樣品液進行點樣，點樣直徑不超過2mm，可分幾次點完，每次點后用冷風吹干再點下一次，吹干。四、實驗步驟1DNS-標準氨基酸的制備四、實驗步驟3展層光面向外卷曲(兩邊不相接觸)，外扎牛皮筋。直立于盛有20mL展層劑的培養皿中，點樣點置下端，置于展析缸中展層。先放置于展層劑(I)中，到展層劑距頂端約0.3cm時，取出吹風機吹干(充分吹干)，然將膜翻轉90oC后放入展層劑()為第向，到展層劑距頂端約0.3cm時，取出吹干，到紫外燈下照相。四、實驗步驟3展層五、結果與計算在紫外燈下觀察DNS-氨基酸的熒光斑點，對照標準圖譜，在相應位置標出氨基酸名稱。五、結果與計算在紫外

30、燈下觀察DNS-氨基酸的熒光斑點，對照標思考題1DNS化測定N-末端的根據是什么？DNS化的最適pH值是多少？2DNS化的副產物是什么？如何除去？3DNS-Cl除能與-氨基反應外，還能與氨基酸的什么基團發生反應？生成什么產物？4未知樣品（蛋白質或肽）的N-末端氨基酸如何確定？思考題1DNS化測定N-末端的根據是什么？DNS化的最適p實驗六 Folin-酚法測定蛋白質含量東北大學生命科學與健康學院實驗六 Folin-酚法測定蛋白質含量東北大學生命科學與健一、目的掌握Folin-酚法測定蛋白質含量的原理和方法；掌握制作標準曲線的要領和通過標準曲線求樣品溶液中待測定物質含量的方法 。熟悉分光光度計的

31、操作。一、目的掌握Folin-酚法測定蛋白質含量的原理和方法；二、總蛋白測定經典和常見的方法比較方 法靈敏度 優 點缺 點適用范圍 凱氏定氮法0.21.0mg氮準確性好、精密度高、靈敏度高。操作復雜，費時用于標準蛋白質的定值、對其他方法校正等 雙縮脲法120mg特異性高、準確度性好、精密度高、操作簡單方便，顯色穩定。靈敏度低為臨床測定血清總蛋白首選方法。 Lowry法（Folin-酚法）5250ug靈敏度高、達雙縮脲法的100倍。干擾物質多、操作要求嚴格計時適用于測定單一蛋白質及測定蛋白質含量較少的標本如腦脊液紫 外分光光度法50100mg快速簡便、無損樣品靈敏度低、干擾物較多常用于較純的酶和

32、免疫球蛋白測定考馬斯亮藍法（Bradford）15ug靈敏、簡便、快速，干擾因素較少不同蛋白質與染料結合力不一致，對比色杯有吸附作用常用于需求更高呈色靈敏度的蛋白電泳化學比濁法簡便、不需特殊儀器影響濁度大小因素多，如加試劑手法、反應溫度等一般用于測定尿液、腦脊液等蛋白質含量較低的樣品二、總蛋白測定經典和常見的方法比較方 法靈敏度 優 三、原理1921年，Folin首創，利用蛋白質分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚基）還原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍色反應。1951年，Lowry對此法進行了改進，先于標本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應，提高了靈敏度。三、原理1921年，Folin首創，利用蛋白質分子中

33、酪氨酸和三、原理Folin-酚試劑法包括兩步反應：第一步：雙縮脲反應蛋白質肽鍵與銅離子形成絡合物蛋白質分子含有大量彼此相連的肽鍵（-CO-NH-），同樣能在堿性條件下與Cu2+發生雙縮脲反應，生成的紫紅色絡合物（蛋白質- Cu2+復合物）。且在540nm處的吸光度與蛋白質的含量在5120g/L范圍內有良好的線性關系。 三、原理Folin-酚試劑法包括兩步反應：三、原理第二步：絡合物將磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin試劑）還原，產生深藍色的磷鉬藍和磷鎢藍混合物；Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩定，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易被酚類化合物還原而呈藍色反應(鉬藍和鎢藍的混合物)。由于蛋白質中含有帶酚羥基

34、的酪氨酸( Tyr ) ，故有此顯色反應。即蛋白質- Cu2+復合物中所含的酪氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍色的化合物。顏色深淺與蛋白質含量成線性關系（正比）。故與同樣處理的蛋白質標準液比色即可求出蛋白質的含量。Folin試劑顯色反應由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用。此外，不同蛋白質因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯以強度稍有不同。三、原理第二步：絡合物將磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin試劑）四、實驗材料、儀器、試劑實驗材料：綠豆芽儀器：1、分光光度計 2、離心機3、分析天平 4、容量瓶（50mL）5、量筒 6、移液管（1mL、5mL

35、）四、實驗材料、儀器、試劑實驗材料：綠豆芽試劑（1）0.5M NaOH（2）試劑甲 （堿性硫酸銅溶液）（A）稱取10g Na2CO3，2g NaOH和0.25g酒石酸鉀鈉，溶解后用蒸餾水定容至500mL。（B）稱取0.5g CuSO45H2O，溶解后用蒸餾水定容至100mL。每次使用前將（A）液50份與（B）液1份，混合，即為試劑甲，其有效期為1天，過期失效。試劑（1）0.5M NaOH試劑（3）試劑乙 （Folin-酚試劑）將100g鎢酸鈉(Na2WO42H2O)、25g鉬酸鈉(Na2MoO42H2O)、700mL蒸餾水、50mL 85%磷酸及100mL濃鹽酸置于1500mL磨口圓底燒瓶中，

36、混勻后，接上磨口冷凝管，回流10h。再加入硫酸鋰150g，蒸餾水50mL及液溴數滴，開口煮沸15min，驅除過量的溴(在通風櫥內進行)。冷卻，稀釋至1000mL，過濾，濾液呈微綠色，貯于棕色瓶中，放置于冰箱中。試劑（3）試劑乙 （Folin-酚試劑）試劑（4）牛血清白蛋白溶液標準液（250g/mL）在分析天平上精確稱取25mg結晶牛血清白蛋白，倒入小燒杯內，用少量蒸餾水溶解后轉入100mL容量瓶中，燒杯內的殘液用少量蒸餾水沖洗數次，沖洗液一并倒入容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，則配成250g/mL的牛血清白蛋白溶液。試劑（4）牛血清白蛋白溶液標準液（250g/mL）五、實驗步驟綠豆芽中蛋白

37、的提取及測定：（1）準確稱取綠豆芽1g，放入研缽中，加蒸餾水2mL，研磨。將勻漿轉入離心管，并用6mL蒸餾水分次洗滌研缽，并入離心管，4,000 rpm離心20min，將上清液轉入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，作為待測液備用。（2）取普通試管2支，各加入待測溶液1mL，分別加入試劑甲（堿性硫酸銅溶液）5mL，混勻后放置10min，再各加試劑乙（Folin-酚試劑）0.5mL，迅速混勻，室溫放置30min，于650nm波長下測定吸光度，并記錄結果。五、實驗步驟綠豆芽中蛋白的提取及測定：五、實驗步驟標準曲線制作：取6支普通試管，按表9-1加入標準濃度的牛血清蛋白溶液和蒸餾水，配成一系列不同

38、濃度的牛血清白蛋白溶液，然后各加試劑甲（堿性硫酸銅溶液） 5mL，混合后在室溫下放置10min，再各加0.5mL試劑乙（Folin-酚試劑），立即混合均勻。30min后，以不含蛋白質的1號試管為對照，用分光光度計于650nm波長下測定各試管中溶液的吸光度值并記錄結果。以牛血清白蛋白含量（g）為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。表9-1 牛血清白蛋白含量標準曲線試 劑管 號123456250 g/mL牛血清白蛋白 (mL)00.20.40.60.81蒸餾水 (mL)1.0 0.80.60.40.20蛋白質含量 (g)050100150200250五、實驗步驟標準曲線制作：取6支普通試管，按表

39、9-1加入標準六、注意事項 IFolin-酚試劑在酸性條件下較穩定，而堿性硫酸銅試劑是在堿性條件下與蛋白質作用生成堿性的銅-蛋白質溶液。故當Folin-酚試劑加到堿性的銅-蛋白質溶液中后，必須立即混勻（加一管混勻一管），使還原反應發生在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前。六、注意事項 IFolin-酚試劑在酸性條件下較穩定，而堿性七、結果與計算實驗數據記錄表用各管平均A值（吸光度）繪制標準曲線圖測定次數各管A值（吸光度）123456123平均值七、結果與計算實驗數據記錄表用各管平均A值（吸光度）繪制七、結果與計算計算出兩重復樣品吸光度的平均值，根據未知樣品溶液的吸光度值，在繪制好的標準曲線圖中計算出

40、樣品溶液中的蛋白質含量；再按下列公式計算樣品中蛋白質的百分含量。七、結果與計算計算出兩重復樣品吸光度的平均值，根據未知樣品溶九、思考題1Folin-酚法的原理是什么？2有哪些因素可干擾Folin-酚法測定蛋白質含量？3為什么Folin-酚試劑乙要迅速混勻？4實驗過程中那些環節應該特別注意？九、思考題1Folin-酚法的原理是什么？實驗七 用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質的分子量東北大學生命科學與健康學院實驗七 用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質的分子量東一、目的掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定分子量的原理;學會安裝和使用垂直板型凝膠電泳裝置;應用垂直型、SDS不連續系統凝膠電

41、泳法、測定蛋白質的分子量。一、目的掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定分子量的原理;二、原理十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法 (SDS) 是一種基于蛋白質在電場驅動下，具有不同的移動能力進而對其進行分離的技術，與蛋白質多肽鏈的長度或分子量相關。 影響帶電粒子電泳的內在因素有三點：分子所帶凈電荷、分子量大小和分子的形狀。十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)，是一種很強的陰離子表面活性劑，SDS以其疏水基和蛋白質分子的疏水區相結合，形成牢固的帶負電荷的SDS-蛋白質復合物；SDS和蛋白質的結合是高密度的，其重量比通常為1.41，這種高密度結合，遠遠超過了蛋白質

42、原有的凈電荷，從而消除了由于蛋白質所帶凈電荷的不同而對電泳遷移率產生的影響。二、原理十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法 (SDS-PAG二、原理由于SDS-蛋白質的復合物具有均一的電荷密度和荷質比，目前認為，SDS-蛋白質復合物具有扁平，緊密的橢圓形或棒狀結構，棒的短軸是恒定的，數量級在18左右，與蛋白質的種類無關，棒的長軸是變化的，而長軸的變化正比于蛋白質的分子量，因此SDS和蛋白質結合后所形成SDS-蛋白質復合物，消除了由于天然蛋白質形狀的不同而對電泳遷移率的影響。由于SDS和蛋白質的結合，消除了分子自身凈電荷及分子形狀兩個因素的影響，使其電泳遷移率在外界條件固定的情況下，僅取決于蛋白質分

43、子量的大小，因而可通過與已知分子量的蛋白質分子遷移率進行比較，求出未知蛋白質的分子量。二、原理由于SDS-蛋白質的復合物具有均一的電荷密度和荷質比二、原理常用的凝膠SDS系統由濃縮凝膠和分離膠構成，濃縮膠其丙烯酰胺濃度為4-5%，分離膠濃度為8%-15%，濃縮膠的目的是讓樣品在濃縮層和分離層的界面壓縮到一個超薄的區域（1-100nm），然后在進入分離膠對蛋白進行分離。壓縮原理：由于濃縮膠pH是6.8較低，甘氨酸在這里呈兩性離子狀態存在，所以這一層的離子強度較低，因此電阻較高，進而形成高電場力，使蛋白質的在堆集層的遷移速率高于分離層。同時由于濃縮膠孔徑大，對一般蛋白質的遷移速率不造成影響； 因此

44、當蛋白質到達堆積層和分離層邊界時，分離層孔徑小，首先到達邊界的蛋白質速率便減慢，而后來的蛋白質仍然保持高速率遷移，便使得蛋白質在邊界處堆積濃縮。二、原理常用的凝膠SDS系統由濃縮凝膠和分離膠構成三、實驗材料、儀器、試劑實驗材料：蛋白質儀器：1、垂直板電泳槽一套 2、穩流穩壓電泳儀 3、移液器 4、水浴鍋 5、 燒杯三、實驗材料、儀器、試劑實驗材料：蛋白質試劑（1）丙烯酰胺(Acr)凝膠貯液：22.2g Acr，0.6g甲叉雙丙烯酰胺，加水溶解并定容到100mL，過濾后避光保存，4oC下可貯藏1-2個月。（2）10%的SDS溶液 （3）10%的過硫酸銨溶液（4）四甲基乙二胺(TEMED)溶液（5

45、）分離膠緩沖液：1.5mol/L pH8.8的Tris-鹽酸緩沖液，將18.15g Tris用水溶解后，用6mol/L的鹽酸調至pH8.8定容到100mL。（6）濃縮膠緩沖液：0.5mol/L pH6.8的Tris-鹽酸緩沖液，將6g Tris溶解后，用6mol/L的鹽酸調至pH6.8，然后定容到100mL。試劑（1）丙烯酰胺(Acr)凝膠貯液：22.2g Acr，0試劑（7）電極緩沖液：將6g Tris，28.8g甘氨酸和1g SDS加水溶解后，定容到1000mL，pH應為8.3。（8）樣品緩沖液(2x)：將1g SDS，2mL -硫基乙醇，5mL甘油，1.0 mL 0.1%溴酚蘭和1mL試

46、劑6，用水溶解并稀釋到50 mL。（9）0.1%溴酚蘭溶液（10）已知分子量的標準蛋白（marker)（11）未知分子量的蛋白質樣品 （12）考馬斯亮蘭染色液，稱取0.25g考馬斯亮蘭R250加入45mL甲醇，10mL冰醋酸和45mL水。（13）脫色液：37.5mL冰醋酸，25mL甲醇加水到500mL。試劑（7）電極緩沖液：將6g Tris，28.8g甘氨酸和1四、實驗步驟1電泳槽的安裝：玻璃板先用洗液浸泡，洗滌干凈，然后用水沖洗去除洗滌劑，再用蒸餾水沖洗，直立干燥。將干燥的玻璃板裝入制膠架中，再插入三角形支架，安放在制膠底座上，將制膠底座上的旋鈕旋到相應的位置（1.5 mm厚的膠旋到1.5，

47、1 mm厚的膠旋到1.0)。2. 樣品處理：蛋白液：樣品緩沖液（v:v)=1:1混勻，總體積1mL。在沸水浴中加熱3-5min，蛋白質在SDS和-硫基乙醇的作用下，變性，變成緊密的棒狀SDS-蛋白質復合物。四、實驗步驟1電泳槽的安裝：玻璃板先用洗液浸泡，洗滌干凈，凝膠制備：分離膠：按表12-1的配比制備分離膠(10%)。將Acr、水、tris緩沖液(pH8.8)、SDS，過硫酸銨和TEMED按表中的順序和量加入到燒杯中，并混勻，混勻后將凝膠液沿玻壁緩緩地注入凝膠板中，注膠過程應防止氣泡的產生，膠液加到距玻璃板頂部1.5-2cm處，立即用移液槍緩慢水平注入蒸餾水（或者異丙醇)。靜置30min后，

48、去掉水層，并用濾紙吸干水滴。濃縮膠：按照表12-1的配方制備濃縮膠。將Acr、水、tris緩沖液(pH6.8)、SDS，過硫酸銨和TEMED按表中的順序和量比例加入到燒杯中，混勻，將膠液注入已吸去上層水的分離膠上，注滿，然后立即將梳子插入凝膠板中，靜置約30min后，小心地取出梳子。旋開旋鈕，將制膠架從底座中取出，整個裝置放入電泳槽中，向兩槽內注入電泳緩沖液。凝膠制備：生物化學試驗課件生物化學試驗課件點樣： 用微量注射器分別吸取marker 10L, 樣品20L ，分別注入到濃縮膠的上樣孔中。電泳：接通電源，立即電泳。紅色電源線接入正極，黑色電源線插入負極，濃縮膠電壓80v，當溴酚藍遷移到界面

49、時，電壓換為140v，繼續電泳，直到溴酚藍到達凝膠底部，停止電泳。染色：將凝膠板從電泳槽中取出，去掉濃縮膠，剝下凝膠，利用自來水簡單沖洗凝膠后，將凝膠放入染液中，于30oC下染色約30min，以凝膠整體變藍為宜。脫色：染色后的凝膠用水沖洗去表面的染料，放入脫色液中，于37oC下脫色，脫色約需24h以上，其間要常更換脫色液。點樣： 用微量注射器分別吸取marker 10L, 樣品2五、結果與計算與標準蛋白分子量相比較，大約算出未知樣品的分子量。電泳后凝膠染色后凝膠五、結果與計算與標準蛋白分子量相比較，大約算出未知樣品的分子1SDSPAGE測定蛋白質分子量的原理是什么？2本實驗是否需在低溫下進行？

50、3樣品溶解液中各種試劑的作用是什么？4影響實驗誤差可能的原因是什么？根據你的實驗進行分析。思考題：1SDSPAGE測定蛋白質分子量的原理是什么？思考題：實驗八 硝酸還原酶活性的測定東北大學生命科學與健康學院實驗八 硝酸還原酶活性的測定東北大學生命科學與健康學院一、目的硝酸還原酶是植物中硝酸鹽同化步驟的第一個酶，也是限速酶，處于植物氮代謝的關鍵位置，它與作物吸收利用氮肥有關，對農作物產量和品質有重要影響，因而硝酸還原酶活力被當作植物營養或農田施肥的指標之一，也可作為品種選育的指標之一。通過本實驗可以初步掌握測定硝酸還原酶活性的原理和方法。一、目的硝酸還原酶是植物中硝酸鹽同化步驟的第一個酶，也是限

51、速二、原理硝酸還原酶可將NO3還原成NO2，NO2的生成量與硝酸還原酶NR活性相關。NO2含量可用磺胺顯色法測定，即在酸性條件下NO2與對-氨基苯磺酰胺發生重氮化反應，生成的重氮化合物又與N-萘基乙二胺鹽酸鹽生成紅色偶氮化合物，可在540nm下比色測定。紅色偶氮化合物二、原理硝酸還原酶可將NO3還原成NO2，NO2的生成二、原理硝酸還原酶活性一般采用活體法或離體法測定。離體法需將材料磨成勻漿，經過濾或離心除去殘渣，以上清液為NR粗酶液進行測定，由于研磨中NADH受損失，必須外加NADH方可測定。活體法直接用鮮活組織進行測定，環境中的NO3進入細胞后，被NR還原成NO2 ， NO2又擴散到細胞外

52、并在溶液中積累，測定溶液中NO2的含量即可得知NR活性的大小，活體法不破壞細胞原有的酶反應系統，NADH可由代反應不斷生成，無需外加。活體法簡便、快速，不需要貴重儀器設備及低溫條件，但重復性欠佳，應做一定數量的重復。本實驗采用活體法。二、原理硝酸還原酶活性一般采用活體法或離體法測定。離體法需將三、實驗材料、儀器、試劑實驗材料： 植物的葉、莖、根、發芽種子、離體的胚、培養細胞等，均可作提取硝酸還原酶NR的材料。本實驗選用發芽56天的小麥幼苗葉片。取樣前須將幼苗移入0.05M KNO3溶液中（pH約6.0）誘導24h，并在取樣前照光3h，切勿在暗期中取樣。儀器：1、紫外分光光度計 2、真空泵和真空

53、干燥器 3、恒溫水浴 4、刻度吸管（0.5mL，1mL ，2mL ） 5、天平 6、離心機三、實驗材料、儀器、試劑實驗材料：試劑（1）0.1M KNO3：稱取3.03g KNO3溶于300mL 0.1M pH7.5的磷酸緩沖液中。（2）1%磺胺：稱取1g磺胺（NH2C6H4SO2NH2），溶于100mL 3M HCl中。（3）0.02%N-1-萘乙二胺鹽酸鹽：取0.02g N-1萘乙二胺鹽酸鹽（C12H14N22HCl）溶于100mL 蒸餾水中，盛于棕色瓶避光保存。（4）30%三氯乙酸：30g三氯乙酸溶于100mL 蒸餾水中。（5）NaNO2標準液：精確稱取1g NaNO2用蒸餾水溶解后定容至

54、1000mL，然后吸取5mL，再用蒸餾水稀釋成1000mL，即為濃度5g/ml的NaNO2標準液。試劑（1）0.1M KNO3：稱取3.03g KNO3溶于3四、實驗步驟1活體法測定硝酸還原酶活性將小麥幼苗葉片洗凈、擦干，剪成0.5cm的段，稱取鮮樣4份，每份1g，分別放入4個編號的試管。1號管先加1.0mL 30%三氯乙酸，再向各管分別加入9.0mL 0.1M KNO3溶液，混勻，放入真空干燥器，抽氣、放氣數次，以排出組織間隙的氣體，使底物溶液進入組織，當所有的葉片都浸入溶液之后，將試管置暗處25oC下保溫30min，取出試管，向2號管各加1mL 30%三氯乙酸終止酶促反應。吸取2mL上清液

55、于另一試管，各加2mL 1% N-1-萘乙二胺鹽酸鹽溶液，1%磺胺2mL ，室溫顯色20min后，540nm波長下測定，用2、3、4號管吸光度平均值與1號管（對照）吸光度之差，在標準曲線上查出相應的NaNO2含量（g），然后代入公式計算。四、實驗步驟1活體法測定硝酸還原酶活性2標準曲線的制作取8支干凈試管，編號，按表14-1所示試劑：表14-1 NO2含量標準曲線試 劑管 號123456NaNO2標準液(mL)00.40.81.21.62.0蒸餾水(mL)2.01.61.20.80.40每個試管中NaNO2含量(g)0246810搖勻1%磺胺(mL)222222N萘乙二胺鹽酸鹽(mL)2222

56、22搖勻，室溫下放置20min后，在540mm波長下測定。以NaNO2含量（g）為橫座標，吸光度值為縱座標，繪出標準曲線。2標準曲線的制作表14-1 NO2含量標準曲線管 五、結果與計算實驗數據記錄表用各管平均A值（吸光度）繪制標準曲線圖測定次數各管A值（吸光度）123456123平均值五、結果與計算實驗數據記錄表用各管平均A值（吸光度）繪制五、結果與計算把在標準曲線上查得的NaNO2含量代入正式計算硝酸還原酶活性：NR活性NaNO2 (g)/鮮重(g)小時式中稀釋倍數對于活體法，指酶促反應液體積（10 mL）與顯色取用體積（2mL）之比，即等于5。附注：（1）無機磷對硝酸還原酶活力有促進作用

57、，因此常用磷酸緩沖液。（2）活體法酶促反應在暗條件下進行，以防光照下葉綠體形成還原型鐵氧還蛋白，促使亞硝酸還原酶把NO2還原成NH3。（3）提取緩沖液中加入半胱氨酸為的是保護酶分子中的巰基使之不易失活。五、結果與計算把在標準曲線上查得的NaNO2含量代入正式計算1測定硝酸還原酶依據的原理什么？2測定硝酸還原酶的材料為什么要提前一天施用一定量的硝態氮肥，并且取樣應該在晴天進行？3測定硝酸還原酶活性的離體法和活體法各有何特點？4提取緩沖液中為什么加入半胱氨酸？思考題：1測定硝酸還原酶依據的原理什么？思考題：實驗九 凝膠層析法分離提取1,5-二磷酸核酮糖羧化酶東北大學生命科學與健康學院實驗九 凝膠層

58、析法分離提取1,5-二磷酸核酮糖羧化酶東北一、目的掌握凝膠層析法原理；學習用凝膠層析法分離提取1,5-二磷核酮糖羧化酶的操作方法和實驗技術。一、目的掌握凝膠層析法原理；二、原理 凝膠層析，又叫分子篩層析，是一種液相層析，機理是分子篩效應。凝膠層析是指混合物（溶液）隨流動相流經裝有凝膠作為固定相的層析柱時，混合物中各種物質因分子大小不同而被分離的技術。其中的流動相一般是緩沖液或其它特定的溶液，固定相是一類具有三維空間多孔網狀結構的物質，如葡萄糖凝膠、瓊脂糖凝膠等。適用于蛋白質純化，蛋白的濃縮和脫鹽，被廣泛用于蛋白質的分離純化中。二、原理 凝膠層析，又叫分子篩層析，是一種液相層析，機理是分二、原理

59、 分離原理：當含有各種物質的樣品溶液緩慢流經凝膠析柱時，各物質在柱內同進行著兩種不同的運動，垂直向下的移動和無定向的擴散運動。大分子物質由于直徑很大，隨洗脫溶液一起移動，所以向下移動的速度較快；較小分子量的物質既可以在凝膠顆粒間隙中擴散，還會進入到凝膠顆粒的微孔中進行擴散，因此使得小分子物質的下移速度落后于大分子物質，從而使得樣品的物質按分子量的大到小順序流出柱外而得到分離。分離效果常用洗脫曲線表示。二、原理 分離原理：當含有各種物質的樣品溶液緩慢流經凝膠析柱二、原理本實驗中采用的葡聚糖凝膠，是凝膠層析法中使用最廣泛的一類層析凝膠，商品名稱：Sephadex。其基本骨架是葡聚糖，它是由右旋葡萄

60、糖殘基通過1，6糖苷鍵連接而成，葡聚糖分子之間通過醚橋（甘油基）交聯形成三維空間網狀結構；不溶于水，親水性很強，由于它的分子中存在許多羥基，在水中吸水形成凝膠并劇烈膨脹，從而能起分子篩的作用，以此來分離不同分子量的物質。本實驗用凝膠層析法分離提純1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶，該酶是光合作用中的重要酶系，其分子量約為5105-6105，由大小兩種亞基組成，在葉綠體中1,5-二磷核酮糖羧化酶（RuBp羧化酶）含量很多，約占葉綠體間質蛋白的50%以上。二、原理本實驗中采用的葡聚糖凝膠，是凝膠層析法中使用最廣泛的三、實驗材料、儀器、試劑實驗材料：菠菜葉 儀器：1、Sephadex凝膠層析柱1套 2、組