1、用為免疫動物產生抗體的抗原物質如果是人工合成的。質地比較純，免疫動物后可獲得質量好的抗血清。如果以從組織中提取的物質作為抗原，必須經過純化，保證提取物的純凈，才能獲得質量好的抗血清。某些物質的分子量比較小，抗原性弱，屬于半抗原，不易使動物產生抗體，必須把這些半抗原連接到大分子 物質（載體）上，形成較為理想的免疫原，既能減少免疫注射的次數，又可節約抗原，產生良好的免疫效 應，獲得高質量的抗體。（一）載體用為作為載體的物質較多，下列幾類可供選擇。蛋白質類載體：人血清白蛋白（HSA）、牛血清白蛋白（BSA）、兔血清白蛋白（RSA）、牛甲狀腺 球蛋白（TG）、血藍蛋白（Hemocyanin）以及人、牛

2、和雞 丫球蛋白等均可作為載體。這些載體免疫活性較 強，有商品供應，容易獲得，即使自選提取，操作也較方便。常用 的有TG、BSA、HAS等，以TG為好。多肽聚合物，人工合成的多聚賴氨酸、多聚谷氨酸、多聚混合氨基酸等，可與半抗原結合，所形成的免疫原可獲高滴度、高親合度的抗血清。大分子有機化合物和某些粉末，如聚乙烯叱咯酮、竣甲基纖維素、聚甲基丙酸酯微粒、乳膠和炭末等， 可吸附半抗原，也可用來作為載體，但用這類載體合成的免疫原免疫動物，所獲抗血清的質量不穩定。載體，尤其是大分子物質本身就是一種抗原，它們進行體內，可發揮致敏作用，激活免疫系統，從而 使半抗原也可以使機體產生優質的抗體。因此，如果把半抗原

3、與無免疫原性的載體結合，就不能使機體產 生抗體。另外，半抗原與載體結合后，可適當延遲其降解和排出體外，從而可以發揮更久的作用。（二）偶聯劑半抗原和載體聯接，操作比較簡單，在一般實驗室中都可進行。但對反應條件有一定的要求：在反應過程中半抗原的免疫活性不發生改變，也不應引起載體變性到不溶解的程度。常用的方法是利用偶聯劑把 半抗原和載體聯接起來。用作偶聯劑的有碳化二亞胺類、戊二醛、二異氟酸化合物和二鹵化二硝基苯等。 這些偶聯劑使半抗原與載體在 -COOH、-NH2或-SH等基團部位發生結合。碳化二亞胺偶聯過程示意如下：由反應過程可見，碳化二亞胺的偶聯作用即可以在NH2部位發生，也可發生在竣基部位。戊

4、二醛所起的偶合作用與碳化二亞胺有所不同，戊二醛的兩個醛基分別與載體和半抗原的-NH2結合。它起一種橋梁”作用，而把載體與半抗原聯接在一起，其反應過程為：在免疫原的制備中，應根據不同的半抗原選用偶聯劑。（三）制備過程以制備催產素（OT）免疫原為例：（1） ImgOT,溶解于1ml雙蒸儲水或 0.25%醋酸溶液中。10mgTG溶解于1ml 0.1mol/LPBS（pH7.5）或 蒸儲水內。（2）把OT溶液與TG溶液振蕩混勻。（3）邊攪拌邊滴加入0.25%戊二醛1ml。加畢后再攪拌510min,在室溫下繼續反應 23h,就可供 免疫動物用。免疫原以新制備的為好，如果一次制備了較多的免疫原，也可保存在

5、-40C的低溫冰箱內備用。抗原的制備除完整的細胞可作為抗原外，各種不同的細胞內存在的各種分子量不同的物質，也都具有全抗原或半抗原的性質，某種抗原物質可能是某一類細胞所特有的，可作為這種細胞的一個標志。由于細胞存在著許多性質不同的抗原物質，有時要從這眾多的物質中提取、純化某種抗原物質， 以供科學研究之用。、抗原的提取抗原的制備是一件十分細致的工作，要制備一個高純度的抗原，需要付出艱巨的努力，制備工作涉及物理學、化學和生理學等許多領域的知識。根據物理或化學特性建立起來的分離、純化方法的主要原理不外乎科二個方面：利用混合物中幾個組分分配率的差別將他們分配到可用機械方法分離的兩或幾個物相中，如鹽析、有

6、機溶劑抽提、層析和結晶等；把混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于不同的區域而達到分離的目的，如電泳、超速離心和超濾等。由于組織細胞內存著許多分子結構和理化性質不同的抗原物質，其分離方法也不一樣， 就是同一類大分子物質，因選材不同，所使用的方法也很大差別。因此很難有一個通用的標準方法供提取任何生物活性物質使用，所以在提取前必須針對所欲提取的物質，充分查閱文獻資料， 選用合適的方法。如果要提取一個結構及性質未知的抗原物質，更需要經過各種方法的比較探索，才能找到一些工作規律和獲得預期的效果。抗原物質的制備，大概要經過如下過程：材料的選擇和預處理；細胞的粉碎（細胞器的分離）。提取；純

7、化；濃縮或干燥，保存。現分別簡述如下。（一）材料的選擇及預處理選擇什么材料主要根據實驗目的而定。通常選含量高、工藝簡便、成本低的材料。材料選定后，通常要進行預處理， 剔除結締組織、脂肪組織等，把組織塊剪碎。若取材后不立即進行提取， 則應冷凍保存，動物組織更要深低溫保存。某些容易失活的物質，一般宜采用新鮮材料。（二）細胞的粉碎除了提取體液、組織間液內的多肽、蛋白質、酶不需粉碎細胞外，凡要提取組織內、細胞膜 上及胞內的生物活性物質，都必須把組織和細胞粉碎，使活性物質充分釋放到溶液內。不同的組織，細胞的破碎難易不一，因此所使用的粉碎方法也不完全相同。如腦、胰、肝等比較軟嫩的組 織，用普通勻漿器研磨就

8、行，肌肉、心臟等則需絞碎后再作勻漿。現漿常用的細胞粉碎方法介紹如后。.物理法（1）高速組織搗碎機：通常由調速器、支架、馬達、帶桿刀葉、有機玻璃筒等組成。把材 料放于筒內（約占筒內容積的1/3）固定筒蓋，開動馬達，調速器由慢逐漸增至所需速度。此法適用于內臟組織。（2）玻璃勻漿器：由一個內壁經過磨砂的玻璃管和一根一端為球狀（球面經過磨砂）玻璃研桿組成。把絞碎的組織置于管內， 加適量溶液，插入研桿，用手或電動轉動研桿， 并上下移動。 用此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機高， 對大分子的破壞也少。是粉碎少量軟嫩材料（腦、胰、 肝等）時常用的方法。（3）超聲波處理法：多用于軟嫩組織，根據不同組織采用不同頻

9、率，處理1015min,超聲波處理時溶液溫度升高，使不耐熱的物質失活，使用時為防止溫度升高，除間歇開機外，還需人工降溫，避免溶液內存在氣泡。核酸及某些酶對超聲波很敏感，要慎用。(4)反復凍融法：把待碎樣品冷卻到零下1520。C,凍固后取出，緩慢解凍，如此反復操作，可使大部分動物性細胞及胞內的顆粒破碎，但也可使生物活性物質失活。(5)冷熱交替法：把材料投入 90o C左右水中維持數分鐘后取出投入冰浴內，可使大部分 細胞破碎。可用于提取蛋白質和核酸。.化學和生物化學法(1)自溶法：把新鮮材料置于一定的pH和適宜的溫度下，利用組織細胞自身的酶系統把組織破壞，使細胞內容物釋放出來。動物材料的自溶溫度選

10、在 04C,需加少量防腐劑，自溶 時間較長，不易控制，不常用。(2)溶菌酶處理法：多用于破壞大腸桿菌等微生物的細胞壁。在每毫升含2億個細胞的懸液中加100ag至1mg溶菌酶，37C,保溫10min,細胞就破壞了。此外，蝸牛酶、纖維素酶也 被選作破碎細菌細胞之用。(3)表面活性劑處理法：較常用的有十二烷基磺酸鈉、氯化十二烷基口比咤、去氧膽酸鈉等。(三)抗原的提取提取、抽提、萃取這 3個詞的含義基本相同。但一般說來，提取是指在分離純化前期，將經 過處理或粉碎了的細胞置于一定條件和溶劑中，讓被提取物充分地釋放出來的過程，而抽提則是貫穿于分離純化的整個過程中，如在制備核酸過程中，用氯仿反復提取蛋白液，

11、用苯酚反復抽提分離DNA和RNA。影響提取的因素主要來自被提取物在提取的溶劑中的溶解度大小以及它由固 相擴散到液相的難易。 一個物質在某一溶劑中的溶解度大小和該物質的分子結構及使用的溶劑的 理化性質有關。一般說來，極性物質易溶于極性溶劑，非極性物質易溶于非極性大分子的等電點遠的pH值使溶解度增加。因此，在不同的抗原提取過程中，所選用的溶劑的性質、pH值、離子強度、抽提溫度、介電常數等因素是提取成敗的重要因素。要達到分離提純的目的，必須靈活地應用這些因素。現將蛋白質、核酸、多肽等抗原(半抗原)的提取方法概要敘述于下。.蛋白質和酶的提取蛋白質是由許多氨基酸連接而成的高分子物質，分子量從數千至百萬。

12、數以千計的蛋白質，按它們的功能可分成兩大類，一類是活性蛋白，包括酶、激素蛋白、 受體蛋白、運動蛋白、運輸和貯存蛋白、防御蛋白等等，另一類是非活性蛋白，如膠原蛋白、角 蛋白等，不同的蛋白質由于其結構的差異，它們溶解度也各不相同。大部分蛋白質都可溶于水、 稀鹽、稀酸或稀堿溶液，少數與脂類結合的蛋白質則溶于有機溶劑乙醇、丙酮、丁醇等。這對選 擇撮蛋白質的溶劑具有重要意義。(1)水溶液提取：由于蛋白質大部分溶于水、稀酸和稀堿溶液，因此提取蛋白質以水溶液 為主，其中尤以稀鹽液和緩沖液對蛋白質穩定性好，溶解度大，氫是最常用的溶劑。應注意下列幾點：鹽濃度，常用等滲溶液，尤以0.020.05mol/L磷酸鹽緩

13、沖液或碳酸鹽緩沖液、0.15mol/L氯化鈉溶液應用較多。如酵母脫氫酶以0.66mol/L磷酸氫二鈉溶液提取，6-磷酸葡萄糖脫氫酶以0.1mol/L碳酸氫鈉液提取，脫氧核糖核蛋白在低鹽溶液中溶解度小，就要用1mol/L以上的氯化鈉液提取，而某些脂肪酶，用水提取比低鹽溶液提取效果更好。 pH值的選擇對蛋白質提取頗 為重要，因為蛋白質的溶解度和穩定性與pH值關系很大。提取液的pH值首先要保證在蛋白質穩定的范疇內，通常在等電點的兩側，堿性蛋白如細胞色素C和溶菌酶選在偏酸一側，酸性蛋白如肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶應選在偏堿一側。溫度：為防止活性蛋白變性、降解而失活， 溫度通常選在5 c以下。對少數耐溫

14、的蛋白質和酶，可適當提高溫度，使雜蛋白變性分離，有利于提純，如胃蛋白酶、酵母醇脫氫酶以及許多多肽激素可選擇3750c條件下提取，效果比低溫提取更好。（2）有機溶劑提取：一些不溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液的蛋白質和酶，常用不同比例 的有機溶劑來提取。如用 70%80%乙醇提取萩蛋白；用 60%70%的酸性乙醇提取胰島素，既 可抑制水解酶對胰島素的破壞，又可除去大量雜蛋白，用丁醇提取某些附于微粒體和線粒體的酶， 一些與脂質結合牢固的蛋白質和酶以丁醇提取，效果較好。我國生化工作者曾用此法成功地提取了琥珀酸脫氫酶和堿性磷酸脂酶。丁醇提取法對pH及溫度的選擇范圍較廣（Ph310）,溫度由零下2c40 c

15、均可。.核酸的提取核酸分為兩大類：一類為核糖核酸（ RNA）,另一類為脫氧核糖核酸（DND ）。核酸的分子量極大，人數萬致億萬。核酸是兩性化合物，在一定的等電點。溶于水，其水溶液呈酸性， 不溶于乙醇等有機溶劑。細胞內的核酸常和蛋白質結合成核蛋白。核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白在不同濃度的電解質溶液中的溶解度有顯著區別，有一定濃度范圍的氯化鈉溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度隨著氯化鈉濃度增加而逐漸下降，當氯化鈉濃度為 0.14mol/L時，其溶解度僅為水中溶解度的1/100,但當氯化鈉濃度再增加時，脫氧核糖核蛋白的溶解度重新增加，氯化鈉濃度增加到 0.5mol/L時，其溶解度與水中溶解度相似，當氯化鈉

16、濃度增加到1mol/L時，它的溶解度比在水中大2倍。核糖核蛋白在 0.14mol/L氯化鈉溶液中仍有相當大的溶解度，因此常用0.14mol/L氯化鈉溶液提取核糖核蛋白，而提取脫氧核糖核蛋白時，則用1mol/L氯化鈉溶液。兩種核糖核蛋白的溶解度與溶液的pH也有關。當pH為4.2時，脫氧糖核蛋白的溶解度最低，而pH為2.02.5時，核糖核蛋白的溶解度最低。所以調節氯化鈉溶液的濃度和pH值，可使核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白分離開來。RNA的提取：RNA在細胞中主要有三種類型，即 rRNA （核微粒核糖核酸）、tRNA（轉移核糖核酸）和mRNA （信使核糖核酸）。mRNA代謝極不穩定，提取時要求條件較嚴

17、格；tRNA當細胞破碎后，用酸處理得到 “pH5沉淀，即可從中分離tRNA ; rRNA占全部RNA的80% 以上，比較穩定，一般提取的大分子RNA主要為此部分。核內 rRNA常先將細胞核分離后，再進行提取，可避免其他細胞組分RNA的干擾。RNA的提取，通常是用 0.14mol/L氯化鈉溶液將組織做勻漿并反復提取細胞質中的核糖核 蛋白，而留下含有 DNA的細胞核物質，然后用10%醋酸調至pH4.2沉淀，離心棄去上清液，先用0.5mol/L氯化鈉溶液，后用水洗滌沉淀，將核糖核蛋白后溶解于0.5mol/L碳酸氫鈉溶液中，離心，取上清液，調 pH至4.2,沉淀以0.5mol/L氯化鈉溶液洗滌，再一次

18、除去脫氧核糖核蛋白。 核糖核蛋白中的蛋白質可用含有少量辛醇的氯仿抽提除去，核酸留在碳酸氫鈉水溶液中，加入乙醇，RNA即以鈉鹽形式沉淀出來。提取RNA另一類方法，不須事先用0.14mol/L氯化鈉提取核糖核蛋白，而一步將RNA的蛋白質分開，并同時把 RNA抽提出來，此類方法是在破碎細胞做成勻漿時，加入去污劑十二烷基 磺酸鈉或二甲苯磺酸鈉；而現在最常用的方法是直接加入含水苯酚與勻漿一起振蕩，DNA和蛋白質沉淀于酚層中，水層中含RNA和多糖，然后用乙醇使 RNA沉淀，四種物質一步便可初步分離開。苯酚法是目前提取不降解的RNA最有效的方法，其應用舉例如下：肝月rRNA的提取：按肝重（鮮）加入 10倍容積苯酚-甲酚混合液（500g苯酚及70ml n-甲 酚于50ml蒸播水中，另加入 0.5g 8-羥基唾咻配成）及 10倍容積的0.5%蔡-1, 5-二磺酸水溶液 （g/V）做勻漿后在 20c攪拌20min。肝臟細胞核內 mRNA的提取：先分離細胞核，再將核懸浮于3倍容積的0.5%pH6.5的蔡二磺酸水溶液（g/V）中勻漿后加入等量 90% （g/V）苯酚水溶液（內含 0.1%8-羥基唾咻）在2c振 蕩提取30min。酵母tRNA的提取：100g酵母（濕重）加入 200ml水，300ml 90%苯酚水溶液，振蕩 2h,4 c 冰箱中過液，使之提取完全。以上介紹了用冷酚法提取各種RNA的一