1、 基因的圖位克隆 要點1. 克隆基因的意義2. 基因克隆的常用策略及比較3. 圖位克隆的基本程序和以 xa13為例介紹圖位克隆的詳細過程5. 總結及展望1.為什么要克隆基因？ 克隆基因有助于我們解釋基因的生物學功能、調控模式、進化關系等。 在植物中，大部分基因的功能未知。Tabata, S. et al. 2000, Nature 408, 796 - 815應用價值： 第二次綠色革命、預設育種等故事向我們展示了可以通過分子標記輔助，利用基因進行作物的遺傳改良的光明前景。Gurdev S.Khush.2001,Nature 2:845 分子標記輔助選擇的前提是基因的定位或克隆！2.基因克隆的策

2、略: 正向遺傳學與反向遺傳學 反向遺傳學：依賴于從基因組和表達序列標簽測序或基因表達譜等的信息，對候選基因的功能進行干擾，從而證明特定序列所控制的表型。 正向遺傳學：從已有的相對表型的差異開始，去分離引起表型變化的對應核苷酸序列改變。基因克隆的主要方法： T-DNA標簽法：當T-DAN導入植物基因組中，并插入基因的編碼區或重要的調控區，即會發生缺失突變的表型，而且會在插入位點一個標簽。LI Ai-Hong et al. 2006, Acta Genetica Sinica 33 (4)：312318優點：可以高效快速分離引起表型變化的基因。缺點：1. T-DNA標簽法只對特定范圍的植物有效；2

3、. 插入突變往往產生基因功能的完全喪失，因此很難分離植物生長發育過程中的必須基因；3. T-DNA插入只能突變一個基因，假如它是一個基因家族的成員，突變基因喪失的功能會被其它成員補償；4.對于受多基因控制、效應小的基因，T-DNA的插入很難引起表型的改變；4. 很多表型的改變并不一定是由于T-DNA插入引起。Georg J. et al. 2002,Breakthrough Technol.129:440-450Janny L. P. at el.2003.TRENDS in Plant Science l.8:484-491基因的抑制表達：通過降低目的基因在細胞的表達水平，使基因的功能下降甚

4、至消失，來研究基因的功能。基因的超量表達：通過人為的重組DNA手段，在生物體細胞中大量地、持續的表達目的基因，使目標基因的功能得到超常發揮。 優點：目的明確，對由基因家族控制的相關形狀，抑制表達能同時降低此基因家族成員的功能；抑制表達和超表達是研究時空表達的有力工具。缺點：抑制表達和超表達會使相關基因的功能紊亂，常常很難判斷相關表型的改變是由于目標基因還是由于被紊亂的基因引起的。葛莘. 高級植物分子生物學, 2004 另外還有TILLING技術、芯片技術、比較基因組學、生物信息學都被廣泛的應用于基因的克隆。3. 圖位克隆和以 xa13為例介紹圖位克隆的詳細過程原理：在減數分裂時期，同源染色體之

5、間配對，非姊妹染色單體發生交換，與目標基因距離越遠，發生交換的頻率就越大，距離越近，發生交換的頻率就越小（遺傳學第三定律）。（王亞馥，戴灼華. 遺傳學.1999，第三章：60-76）與基因發生最小交換頻率的兩側分子標記，就是與基因最緊密連鎖的分子標記，這兩個分子標記之間的區段就是包含這個基因的目標區段。常用概念：分子標記：基因組特定區域在親本之間有多態性的DNA序列，簡單說，就是這段DNA序列能夠指示基因組特定區域的片段是來自哪個親本標記基因型：指這段DNA序列所來源的親本基因組區段基因基因型：控制目標性狀的DNA區段ZH. H. Ren et al. 2005, Nature genetic

6、s 37: 1141-1146GS3GN1qSH1xa13Fw2.2群體準備：選擇目標性狀差異大并且親緣關系適中的兩個親本構建群體4. 以xa13為例介紹圖位克隆的詳細過程群體準備：選擇目標性狀差異大的兩個親本構建F2群體。 IR24為對PXO99高感的一個親本含有XA13/XA13一對顯性基因，IRBB13為以IR24為背景的 xa13/xa13的近等基因系對PXO99高抗。Zhaohui Chu et al. 2006, Theor Appl Genet 112: 455461步驟第一步:構建分子標記為基礎的遺傳連鎖圖目的：找到與目標基因緊密連鎖的兩個分子標記。方法1：對受到多基因控制的數

7、量性狀基因或想要定位多種性狀的基因，需要構建全基因組的遺傳連鎖圖。方法2：對想要定位一個質量形狀或效應特別大的數量形狀基因，也可以通過BSA法構建局部遺傳連鎖圖 BSA法：在一個利用F2、BC 、RIL、 DH等群體中隨機選擇一定數目的某種表型如抗病的個體，提取DNA,構成一個抗性池；再隨機選擇一定數目的另一種表型如感病的個體，提取DNA組成感病池。這樣，抗病池和感病池基因組除了在抗病性位點有差異(有多態性)，在其它位點都是一樣的(無多態性）。因此，在抗病池和感病池之間有多態性的標記就是與目標基因連鎖的標記。G. Zhang et al等利用IR24和IRBB13雜交，得到的F2分離群體，利用

8、BSA法，找到了一個RAPD標記OPAC05，在抗病池和感病池之間有多態性。從而將 xa13定位于OPAC05附近。 G. Zhang et al. 1996 , Theor Appl Genet 93:65 70利用日本和康奈爾報道的chro8 xa13區段RZ28-RG136之間的8個RFLP和1個STS標記構建了兩個群體遺傳圖。A. C. Sanchez et al. 1999, Theor Appl Genet 98: 1022-1028 后來儲朝暉博士，為了驗證以上的結果，利用極端隱性分組分析法對來自IRBB13和IR24雜交的250株極端抗病F2單株把 xa13 重新定位于S140

9、03和RG163之間，同時一個新發現的CAPS 標記E6a定位于標記RG136和xa13基因之間，從而以Ea6和S14003作為構建物理圖譜的起點。Zhaohui Chu et al. 2006, Theor Appl Genet 112: 455461極端隱性分組分析法： 抗病的單株的基因的基因型為 xa13/xa13，如果在xa13兩側都檢測到有來自IR24的標記基因型，則這個兩個標記就是基因xa13的邊界。第二步：構建包含目標基因的物理圖譜用目標區段內的最緊密連鎖的兩側的分子標記作為探針篩選文庫，再以分離到的克隆的兩端作為探針進一步篩選文庫，如此往復，直到確認克隆之間的重疊關系, 最終構

10、建覆蓋目標基因的兩個標記之間的物理圖譜。目的：通過對確認的克隆測序測序等進一步開發與目標基因連鎖更加緊密的分子標記實現染色體登陸。現在，對于水稻、擬蘭芥等已經測序的植物，無須進行物理圖譜的構建。對其它的沒有完成測序的作物，因為基因組共線性在植物界廣泛存在，物理圖譜的構建也變的容易了。HindIII-digested 21H14 end-labeled, as a probeHindIII-digested 44F8end-labeled, as a probe用RG163的STS R2027S14003 G1149篩選IR64文庫得到四個contigs群，一共11個克隆。分別以克隆42C23的

11、末端序列42C23R為探針和以克隆6B7末端序列6B7F為探針重新篩選文庫分別得到以個新克隆33C7和14L3。R2027和S14003的contig群最大的克隆21H14和44F8探針與得到的這13個克隆雜交，最終結合末端測序把這兩個重疊群連成一體。A. C. Sanchez et al. 1999, Theor Appl Genet 98: 1022-1028分別以 xa13 兩側的分子標記Ea6和S14003為起點，對MH63基因組文庫進行染色體步移，結合BAC指紋圖譜分析獲得5個相互之間重疊非冗余的克隆同時開發了在這個區段開發了大量的分子標記。根據分子標記S14003篩選的明恢63 B

12、AC克隆44F01，與來自 A. C. Sanchez et al構建的水稻品種IR64的兩個BAC克隆21H14和14L03具有相似的DNA指紋圖譜。因為MH63IR64都為感病材料，在 xa13區段應該有很高的同源性，結合重組交換 的信息從而確定的xa13所在的BAC。Zhaohui Chu et al. 2006, Theor Appl Genet 112: 455461包含GS3的物理圖譜 C.C. Fan et al. 2006, TAG 112:1164-1171包含SCK1的物理圖譜 ZH. H. Ren et al. 2005, Nature genetics 37: 1141

13、-1146包含Gn1a的物理圖譜 Motoyuki Ashikari et al. 2005, Science 309: 741-745第三步：精細定位擴大F2群體，用緊密連鎖的兩側質量好的分子標記對3000-10000個單株將基因定位到較小的區段定位到單基因甚至幾百bp。先用目標區段兩側的兩個質量好標記對大群體進行重組單株的鑒定，利用這個區段開發出來的標記，對重組單株進行標記基因型的分析，所有鑒定出的重組單株上收獲的F3代種子，來鑒定基因型是純合的還是雜合的，結合標記基因型和基因的基因型把目標基因定位到更小的區段 利用極端隱性個體計算重組率：c=(N1+N2/2)/N N為純隱性基因型個體總

14、數，N1為標記基因型為純合且此位點來自顯性親本的隱性表型個體總數，N2為標記基因型為雜合的隱性表型個體總數Q. Zhang 1994, PNAS 91:8675-8679A. C. Sanchez et al. 1999, Theor Appl Genet 98: 1022-1028利用末端測序的結果，在原有的兩個標記R2027和S14003附近新開發了42C23R、21H14、6B7F、21H14F四個標記，用第一個群體將 xa13定位于標記R2027和42C23之間，用第二個群體將 xa13定位于21H14和21H14之間。從而最終把xa13 定位到一個克隆21H14上。利用在物理圖譜構建

15、過程中開發的標記，利用第二個群體把 xa13 定位于RP7右側，從而將xa13定位于標記RP7和S14003之間，利用第三個群體把 xa13定位于RP7和ST9的14.3Kb之間。最終把 xa13排除出R2027和RG163之間的區域，即克隆14L03上。利用后代測驗，進一步驗證這一次定位結果的準確性。Total number of recombi- 10 2 0 2 2 8 ation eventsZhaohui Chu et al. 2006, Theor Appl Genet 112: 455461后來又利用在ST9和RP8之間開發的標記ST12，從F2發現了一個重組單株在ST12與 x

16、a13發生了交換。 Xa13被精細定位在RP7和ST12之間的9.2Kb ，基因預測共發現只含有一個基因。Zhaohui Chu et al. 2006, Genes & Dev. 20: 1250-1255 對于QTL基因，為了檢驗目標區段的效應，可以將構建好的NIL種下發展成一個隨機群體，考察表型，看是否符合3：1分離。C.C. Fan et al. 2006, TAG 112:1164-1171 C.C. Fan et al. 2006, TAG 112:1164-1171第四步：功能驗證 證明轉基因 供體親本 在產生的形態學表型 時空表達模式上具有一致性。 例如： 結合候選基因法，1)

17、 通過轉基因（通常將顯性基因轉化突變型材料），抑制或者超表達目標基因，考察目標基因的功能是否與目標形狀相同如：功能互補實驗，RNAi等實驗; 2) 通過比較測序，證明目標形狀變化是由于DNA 序列的變異造成的。被精細定位在RP7和ST12之間9.2Kb的 xa13 ，基因預測共發現只含有一個基因，并且GenBank 中來自IR24和IR64的這一區段有很高的同源性，對這個唯一的候選基因進行功能驗證。 將來自IR64的BAC克隆14L03的9.2Kb的片段轉化IRBB13,在T0代發現，所有含來源于IR64的 Xa13片段的單株，都為高感的；不含來源于IR64的 Xa13片段的單株，都為高抗的。

18、對T0感病的單株來的T1家系分析，基因性和表型完全共分離。T1家系分析Zhaohui Chu et al. 2006, Genes & Dev. 20: 1250-1255Xa13表達水平與抗病性關系A：Xa13抑制表達B：Xa13超表達Xa13時空表達和誘導表達C：Xa13/xa13空間表達模式D： Xa13/xa13在POX99誘導 下時間表達模式結論：表達水平相對低是導致抗病和雄配子育性低下的原因！Zhaohui Chu et al. 2006, Genes & Dev. 20: 1250-1255為了找到導致等位基因功能的變化的根本原因：序列的差異。對除了以前測序的IR24、IR64的

19、Xa13區段，又測了5個感病材料的Xa13區段，組成一個感病組；測了11個抗病材料的 xa13區段，組成一個抗病組。抗病組 Aus274 和 Kalimekri 77-5在xa13區段，與感病組在 Xa13區段編碼的蛋白質一樣。表明編碼區的變異不是導致抗病的根本原因！Zhaohui Chu et al. 2006, Genes & Dev. 20: 1250-1255由于白葉枯病菌株PXO99在相同遺傳背景的近等基因系IR24和IRBB13中能誘導顯性基因Xa13的增強表達，而不能誘導隱性基因xa13的增強表達，這種差異可能是由xa13和Xa13基因啟動子區間的序列差異造成的。所以對啟動子區比

20、較測序。 xa13在啟動子區（-69 bp -86 bp）范圍的突變，包括單堿基的突變，導致了病原PXO99激發xa13基因表達功能的喪失，最終等位基因功能的差異！Zhaohui Chu et al. 2006, Genes & Dev. 20: 1250-1255GS3GN1qSH1xa13Fw2.2親本選擇：選擇目標性狀差異大并且親緣關系適中的兩個親本構建群體原因1：目標性狀差異大方便準確地判斷單株的基因型原因2：親緣太近，很難在一個很小的區段內找到足夠多的分子標記，親緣太遠，發生DNA重組的頻率會變小。G. Jander et al. 2002, Plant Physiol:129 44

21、0-4504. 圖位克隆中注意的問題材料來源： 1) 種質資源庫：谷類作物經過大約10，000年的栽培馴化，有許多的農藝相關形狀被選擇并保留下來，如增加了的籽粒數目，改變了的籽粒形狀，提高了的育性，改變了生長發育特性以適應當地氣候，籽粒顏色，落粒性等。它們之間以及栽培型和野生型存在性狀的相對差異。因為有些農藝形狀相關的基因是由顯性向隱性進化的，因此很難用從突變體庫中獲得回復突變的表型 Saeko Konishi, et al. 2006, Science 312: 1392-1396 2) 人工突變體庫:利用物理、化學、轉座子法、T-DNA插入法等方法可以獲得比自然變異表型更加豐富的突變體。利

22、用物理、化學誘變方法無法獲得突變位點，轉座子法和T-DNA插入法有時看不到共分離。這些有重要表型卻沒有共分離的突變體，都可以利用圖位克隆分離重要的基因。錢前等. 2006, 植物學通報 23 (1): 1132. 人工突變體庫 例如：可以用來克隆自然界存在的有差異的基因，人工誘變的基因（包括復突變基因）通過側翼序列，在突變體庫中找到目標基因被插入的突變體，鑒定目標基因被插入的表型是否改變。利用物理化學誘變產生突變體的優點：不受物種范圍的限制，幾乎適用于任何物種，突變效率更高：對于某些突變致死基因，因插入突變造成基因功能的完全喪失而不能獲得突變株( Lukowitz RJ. 2001, PNAS

23、: 98, 2262-2267) ，理化因素產生的突變改變的往往只是個別氨基酸，突變單株的表型仍然可以在后代中被看到從而可以獲得功能下降的突變表型( Conklin PL. et al. 1999, PNAS: 96, 4189-4203)由于物理化學誘變，可能使編碼蛋白的氨基酸結構產生的變化，從而改變了蛋白質的性質，產生新的基因 群體大小：初步定位通常利用100-250個單株 例如： 精細定位的估算G. Jander et al. 2002, Plant Physiol:129 440-450 說明：番茄隨著基因組測序在一些模式植物中的完成，原來周期長 難度大的圖位克隆，因為物理圖譜和分子標記的存在而成為基因克隆的可取的方法精細群體大小： 理論上，精細定位群體越大，在目標基因兩側都得到一個重組單株的可能性越大，但是群體過大，浪費物力和人力，因此確定一個適當的群體大小非常重要。精細定位群體大小的估算： 假設重組率為一個恒定的量，T 表示目標基因區段兩側兩個緊密連鎖的標記之間的物理距離 ，單位為Kb ，R表示物理距離與遺傳距離的比率，單位為Kb/cM，N為配子的數目（測交數目或者兩倍的F2代單株 ） 在異染色質區或者目標區段內有染色體倒置R值會變大 全基因組的R值是不同的 特定區段的R值已知 仍然可以