1、精選優質文檔-傾情為你奉上精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業專心-專注-專業精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業納他霉素的發酵生產、分離提純及檢測學院：生命科學學院班級：XXX學號：XXX姓名：XXX摘要 本實驗利用褐黃孢鏈霉菌進行發酵生產納他霉素，通過對褐黃孢鏈霉菌進行孢子和種子液培養以及搖瓶發酵培養，使其產納他霉素，并分離純化得到0.35g/L納他霉素。期間每24h對培養液取樣鏡檢觀察菌體生長，并用分光光度計測定OD值。本實驗表明，隨著培養時間增加，納他霉素的含量逐漸增加，菌體生長，菌絲變長而緊密。關鍵詞 納他霉素 搖瓶發酵 褐黃孢鏈霉菌1 前言納他霉素（Natamycin）

2、是一種多烯大環內酯類抗真菌劑，也稱游鏈霉素或匹馬霉素(Pimaricin)。它是由5個多聚乙酰合成酶基因編碼的多酶體系合成。由于它能夠專性地抑制酵母菌和霉菌，被廣泛應用于食品防腐和真菌引起的疾病的治療。納他霉素是近白色至奶油黃色結晶粉末，幾乎無臭無味，溶點280（分解），分子式C33H47O13，相對分子量665.75，結構式如圖所示。納他霉素是一類兩性物質，分子中有一個堿性基團和一個酸性基團，等電點為6.5。在大多數食品的pH值范圍內，納他霉素是非常穩定的。高溫、紫外線、氧化劑及重金屬等會影響納他霉素低的穩定性。但可以瞬時高溫（溫度可達100）不影響其活性。N-Natamycin(3-N-d

3、imethylaminopropylsuccimido)的活性比較低，可能是對它的化學修飾都會降低其活性，納他霉素是經深層發酵和多步提取工藝精制而成，其制劑通常是50%納他霉素和50%乳糖的混合物。納他霉素的生產菌種主要有Streptomyces chattanovgensis, Streptomyces natulonso, Streptomyces gilvosporeus等3種鏈霉菌。本實驗所用菌種為褐黃孢鏈霉菌（Streptomyces gilvosporeus），孢子絲螺旋形。孢子表面帶刺。在發酵過程中，培養液中各成分的濃度和類型都會影響納他霉素的生物合成，其中碳氮比是最關鍵的因素之

4、一，氮源促進菌體的生長繁殖，同時要在發酵中流加補充適當的碳源(葡萄糖)。納他霉素在以葡萄糖作為碳源時產量最高，這是因為葡萄糖能滲入納他霉素的分子中去。有資料表明，氮源的類型對菌體生長和納他霉素的產量有較大影響，菌體細胞生長最好的氮源是酵母抽提物，而納他霉素產生的最佳氮源是牛肉浸出物。納他霉素是26種多烯烴大環內酯類抗真菌劑的一種，多烯是一平面大環內酯環狀結構（圖1），納他霉素分子的疏水部分即大環內酯的雙鍵部分以范德華力和真菌細胞質膜上的甾醇分子結合，形成抗生素甾醇復合物，破壞細胞質膜的滲透性；分子的親水部分即大環內酯的多醇部分則在膜上形成水孔，損傷膜的通透性，從而引起菌內氨基酸、電解質等重要物

5、質滲出而死亡。但有些微生物如細菌的細胞壁及細胞質膜不存在這些類甾醇化合物，所以納他霉素對細菌沒有作用。圖1納他霉素的分子結構2 材料與方法2.1材料搖床（HYG-B全溫度搖瓶柜）、真空干燥箱（型號：DZX-6090）、顯微鏡、離心機、生化培養箱、紫外分光光度計、褐黃孢鏈霉素、酵母提取粉、麥芽提取粉、葡萄糖、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉、大豆分離蛋白、麥芽糊精、酵母提取粉、乙醇、甲醇、20%NaOH、抗氧化劑BHA、1,2丙二醇、納他霉素標準品、250ml三角瓶等等2.2方法2.2.1培養基制備2.2.1.1斜面孢子培養2.2.1.1.1孢子培養基酵母提取粉4g/L，麥芽提取粉10g/L，葡萄糖4g/L

6、，瓊脂20g/L，pH7.02.2.1.1.2孢子斜面制備按斜面孢子培養基配方稱好原料，用融化瓊脂溶解，定容，用20%氫氧化鉀調pH，121滅菌15min，擺斜面冷卻后置于37培養1-2天，備用。用斜面轉管接種，25培養10天，待孢子長滿后，放置冰箱5天以上再用。涂片觀察孢子形態，并顯微拍照。2.2.1.2搖瓶種子培養2.2.1.2.1搖瓶種子培養基葡萄糖15g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉10g/L、pH7.02.2.1.2.2搖瓶種子制備按搖瓶種子培養基配方稱好原料，用水溶解，定容，調pH，分裝（250ml裝50ml），121滅菌15分鐘。待培養基冷卻后，刮取孢子接種搖瓶，每支斜面接種5瓶

7、搖瓶。，29，200rpm振蕩培養24小時。無菌取樣，涂片觀察種子菌球形態，并顯微拍照。2.2.1.3搖瓶發酵培養2.2.1.3.1搖瓶發酵培養基大豆分離蛋白19.5g/L、麥芽糊精50g/L、酵母提取粉4g/L、葡萄糖6g/L、pH7.02.2.1.3.2 搖瓶發酵按搖瓶發酵培養基配方稱好原料，用水溶解，定容，調pH，分裝（250mL裝40mL），121滅菌25分鐘。待培養基冷卻后，取搖瓶種子1ml接種，29，200rpm振蕩培養120168hr。每隔24hr無菌取樣，涂片觀察菌球形態，并顯微拍照。2.2.2 制作標準曲線取50mg的納他霉素，溶于100mL丙二醇，得濃度為500g/mL的納

8、他霉素原液。按表8-1制作曲線，橫坐標為納他霉素工作溶液濃度，縱坐標為OD303nm。注意給出回歸方程（y=kx+b）和相關系數（R2），如果相關系數0.99，要求重做標準曲線。產物濃度計算公式為：納他霉素含量（mg/L）=X100n其中：X為將所測樣品的OD303nm作為y值，代入回歸方程中求出的相應的x值。100為樣品處理時2次稀釋倍數之積。如果所得樣品OD303nm超出標準曲線范圍為，則稀釋n倍后再次測定。表1 納他霉素標準曲線工作表管號123456工作溶液濃度（g/mL）01.252.53.7556.25納他霉素原液（mL）添加量00.0250.050.0750.10.125水（mL）

9、109.9759.959.9259.99.8752.2.3 納他霉素的提取與檢測納他霉素不溶于水，因此它在發酵液中呈晶體狀。納他霉素晶體有針型的，圓盤型的等等。它們都是在發酵過程中形成，直徑一般在0.520nm。從接種后第48h開始，每隔24h從每瓶發酵液中取0.5mL的發酵液，混合均勻，取混合后的發酵液0.5mL，加4.5mL的丙二醇（此過程樣品稀釋了10倍），在搖床上震蕩1小時，12000rpm離心10min，取0.5mL上清液，加4.5ml蒸餾水（此過程樣品再次稀釋了10倍），搖勻，在紫外分光光度計303nm測定光密度。如果吸光度太大，需要再稀釋一次，計算結果時記得乘以此稀釋倍數。剩余的

10、混合后的發酵液平批分成2份，分別用于測定還原糖和氨氮。2.2.4 納他霉素的分離純化2.2.4.1 發酵液6000rpm離心10min。離心前發酵液的體積與離心后上清液的體積之差即為濕菌泥的體積。2.2.4.2 濕菌泥加2倍體積 95%乙醇，20%氫氧化鈉調pH1010.5，邊加邊攪拌0.5hr（注意一定要調過pH后再計時），以便納他霉素充分溶解。2.2.4.3 6000rpm離心10min，保留上清液。2.2.4.4 用1N鹽酸調pH6.5，靜置3hr以上（或冰箱過夜），以便納他霉素在等電點處沉淀析出。 6000rpm離心10min，保留沉淀（產物）。 55真空干燥2hr，稱重。3結果與分析

11、3.1 發酵過程褐黃孢鏈霉菌形態的變化 圖2 刮菌鏡檢 10X圖為在斜面培養基培養7天，將斜面孢子接種到種子培養基前（種子培養0 h）的孢子形態,由圖可看出孢子呈圓球狀。 圖3 種子培養基培養24h（發酵液培養0 h） 油鏡由上圖可知，種子培養基培養24 h（發酵液培養0 h）時，菌絲十分完整，菌絲比較長，菌體密集，由此推測該菌體生長較旺盛，故可轉于發酵培養基中培養。 圖4 發酵液培養24h 油鏡 圖5 發酵液培養48h 10X由圖4和圖5觀察菌落的形態可知，由于轉入到發酵培養基中時間不長，可能由于不適應等原因，菌體生長比較緩慢，菌絲不是很長。 圖6 發酵液培養72h 油鏡 圖7 發酵液培養9

12、6h 油鏡由圖6和圖7可看出，在發酵培養72h和96h時，在油鏡下觀察到菌體的菌絲較長且較密集，可以看到圓形的孢子，但視野主要是菌體的菌絲。隨著時間的增長，菌絲密度越來越大，菌絲越來越長。圖8 發酵液培養120h 油鏡 圖8為發酵培養120h在油鏡下觀察的菌體情況，可以看到菌體減少，大量菌絲斷裂且有較多圓形孢子，這是因為菌絲已經開始老化，此時，納他霉素的含量也有所增長。3.2 納他霉素的檢測3.2.1 納他霉素的標準曲線表2 納他霉素標準曲線表管號1234567工作溶液濃度（g/mL）01.252.53.7556.257.5納他霉素原液（mL）添加量00.0250.050.0750.10.12

13、50.15水（mL）109.9759.959.9259.99.8759.85OD303CK0.0920.1950.310.4010.5010.645圖9 納他霉素標準曲線3.2.2 納他霉素的檢測表3 納他霉素含量隨時間變化表培養時間/h24487296120稀釋倍數100100100200200OD值0.2970.5310.6250.4500.556納他霉素濃度（g/L）0.0740.1300.153 0.2220.273圖10 納他霉素濃度隨發酵時間變化圖分析：由表3和圖10可知，納他霉素的濃度隨發酵時間增加而增加，且接近線性關系。3.3納他霉素的分離純化離心前發酵液體積/mL300離心后

14、上清液體積/mL256濕菌泥體積/cm244干菌泥與離心瓶/g40.44瓶子的重量/g40.33納他霉素干重/g0.11由此分析：由120h測得的納他霉素的濃度為0.273g/L，而本實驗中分離純化得到的納他霉素的含量為0.110.3=0.35g/L0.273g/L,其中0.35g/L較0.273g/L遲一周測量，因此可推測出，此后一周發酵液培養中，納他霉素含量有所增長，約0.35-0.273=0.077g/L本實驗中，本小組在分離純化過程中，納他霉素損失十分小，實驗非常成功！4討論在本實驗中，我們嘗試了通過搖瓶發酵生產納他霉素，加深了我們對好氧發酵過程中菌體生長與次級代謝產物積累的關系的認識

15、，也積累代謝調控發酵及相關產品分離純化和分析檢測的經驗，這些是我們之前都沒有接觸過的。我們小組的實驗中，在發酵液培養期間，我們在培養時間為0h到120h中，每天都用顯微鏡觀察菌體生長情況，隨著菌體生長，菌體逐漸老化，孢子的數量也逐漸增多，菌絲開始斷裂，代謝產物的含量也越來越大（在本實驗中，稍顯出指數增長的趨勢），讓我們更加深刻地了解菌體生產與次級代謝產物積累的關系。在剛開始，雖然我們以前有用過顯微鏡進行鏡檢操作，但是很多操作要點都忘記了，因此，老師讓我們嘗試鏡檢時，我們很多人都沒有成功，后來經過多次的探索。我慢慢摸索到了竅門：1、取菌體的時候要記得打散，不然視野看上去會一片紅。2、染色時間不能

16、太長，否則顯微鏡下看到視野也會看到紅色一片。3、蓋蓋玻片的時候，載玻片應該保持濕潤并把蓋玻片輕輕地放在載玻片上，否則蓋玻片會貼不牢固或者有氣泡。4、用酒精燈烘干時間不能太長，否則載玻片會焦等等。另外，在次級代謝產物的分離純化中，我們小組最終得到了0.35g/L的納他霉素。據了解和比較，在搖瓶水平下，能達到這個值已經是很不錯了，這樣好的實驗結果有賴于小組每一位成員的嚴謹的實驗態度和相互之間的融洽的配合與合作，更要感謝為我們準備實驗用品和一切事項的李老師和循循善誘給我們教導的雷德柱老師！萬分感謝！5.思考題5.1 種子液菌球與發酵液菌球在形態上有什么區別？為什么會有這種區別？種子液菌球的菌絲較發酵

17、液菌球的菌絲短，其孢子呈圓形，為鏈狀。整個菌球形狀比較松散。而發酵液菌球的菌絲比較長，菌球大而緊密。造成這種區別的原因是：種子液與發酵液的營養成分不同，可能是發酵液中的營養成分使其逐漸形成形態上的差異。5.2納他霉素的分離純化中需要兩次調節pH值，其目的和作用分別是什么？第一次調pH值：濕菌泥加2倍體積95%的乙醇，20%氫氧化鈉，pH調至10-10.5，其目的是使納他霉素充分溶解。第二次調pH值：用鹽酸調至pH6.5，其目的是使納他霉素在等電點出沉淀洗出。5.3各時期取樣觀察到的菌絲形態、還原糖含量、氨基氮含量和產物產量之間有什么關聯性？菌體適應發酵液的環境后，隨著適應時間增加，菌體逐漸生長，菌絲逐漸增長且變成菌絲球，其次級代謝產物如還原糖含量、氨