1、PCR基本原理變性退火延伸N個循環(huán)第1頁，共82頁。PCR的基本成分模板DNA特異性引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶脫氧核苷三磷酸（dNTP）二價(jià)陽離子（Mg2+/Mn2+）緩沖液（Tris-Cl）一價(jià)陽離子（KCl）2第2頁，共82頁。原理簡單，結(jié)果多變重復(fù)性差假陽性假陰性擴(kuò)增效率低Ct值出現(xiàn)的晚標(biāo)準(zhǔn)曲線線性不佳WHY?第3頁，共82頁。組分量很重要相互制約的平衡之道4Mg2+TaqKCl引物模板產(chǎn)物dNTPEDTA腐殖質(zhì)鹽離子鹽離子模板引物復(fù)合物活性構(gòu)象螯合螯合螯合BufferDDTTween甘油第4頁，共82頁。反應(yīng)溫度時間很重要動態(tài)競爭的過程引物與引物，引物與模板的不同部位都會有一定的結(jié)合力，只

2、是大小有差異，取決于溫度與濃度DNA聚合酶與引物，與雙鏈DNA（模板和產(chǎn)物），與模板引物復(fù)合體都能結(jié)合，只是與后者結(jié)合力更強(qiáng)DNA聚合酶與DNA的結(jié)合是動態(tài)的，在不斷的結(jié)合與分離DNA分子之間的結(jié)合，以及聚合酶與DNA分子之間的結(jié)合發(fā)生的溫度范圍很廣，并非只有退火的時候才發(fā)生。溫度和時間決定了哪個產(chǎn)物能勝出第5頁，共82頁。原理簡單，控制不易成分控制體積控制溫度控制時間控制6第6頁，共82頁。成分控制核酸抽提試劑引物合成可能有雜質(zhì)商品化的PCR試劑盒未標(biāo)明成分7第7頁，共82頁。體積控制移液器吸頭操作手法8第8頁，共82頁。溫度及時間控制 滯后效應(yīng)9金屬底座散熱器耗材導(dǎo)熱膜反應(yīng)試劑半導(dǎo)體溫度探

3、頭第9頁，共82頁。面對困難如何調(diào)整優(yōu)化10試劑儀器耗材人模板序列模板引物二級結(jié)構(gòu)GC含量完整度抑制劑二聚體錯配讓廠商去優(yōu)化吧第10頁，共82頁。熒光定量PCR（QPCR）是咋回事？PCR全部循環(huán)跑完再檢測一次產(chǎn)物量，在電泳儀上分離后，用EB等染料染色，在紫外燈下檢測。通過熒光分子標(biāo)記，QPCR每跑一個循環(huán)都檢測一次產(chǎn)物量，無需任何分離，在QPCR儀內(nèi)直接檢測。一個PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測只得到一個數(shù)據(jù)，只能粗略判斷終產(chǎn)物的量。一個單色QPCR跑40個循環(huán)可以檢測到40個數(shù)據(jù)，可以更精確的推斷出DNA的量。第11頁，共82頁。熒光分子簡介熒光是一種光致冷發(fā)光現(xiàn)象。熒光分子經(jīng)某種波長的入射光（通常是紫

4、外線或X射線）照射，吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出出射光（通常波長比入射光的的波長長，在可見光波段）；而且一旦停止入射光，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。具有這種性質(zhì)的出射光就被稱之為熒光。12熒光分子的性質(zhì)(激發(fā)和發(fā)射波長、強(qiáng)度、壽命、偏振等)可隨所處環(huán)境的性質(zhì)，如極性、折射率、黏度等改變而靈敏地改變。第12頁，共82頁。非特異性熒光染料：1、 SYBR Green 特異性熒光探針： 2、TaqMan（Taqman-MGB) 3、Molecular Beacon 4、LNA probes 5、Scorpions primers 6、FRET probe 7、Allglo探針 8、蝎形引物

5、（Scorpion primer）：熒光標(biāo)記引物 9、Amplifluor：熒光標(biāo)記引物QPCR用什么熒光分子，怎么用？SYBR Green，F(xiàn)AM，HEX，VIC，TET，JOE，CY3，TAMRA，NED，ROX，CY5，LC-Red等等第13頁，共82頁。 實(shí)時熒光定量PCR 方法 1 SYBR Green 法(EVA Green)Excites at 497 nm and emits at 520 nm.第14頁，共82頁。SYBR Green 染料工作原理 SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位 SYBR Green 只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光 變性時，DNA雙鏈分開

6、，無熒光 復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA， SYBR Green 發(fā) 熒光，在此階段采集熒光信號。第15頁，共82頁。SYBR Green 法 優(yōu)缺點(diǎn) 對DNA模板沒有選擇性 -適用于任何DNA 使用方便 -不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針 非常靈敏 便宜優(yōu) 點(diǎn) 容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性 但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件 對引物特異性要求較高缺 點(diǎn)第16頁，共82頁。實(shí)時熒光定量PCR方法2TaqMan法TaqMan-水解型雜交探針與目標(biāo)序列互補(bǔ) 5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher, Q) 探針完整，R所發(fā)射的熒光

7、能量被Q基團(tuán)吸收 ，無熒光， R與Q分開，發(fā)熒光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針第17頁，共82頁。實(shí)時熒光定量PCR方法2TaqMan-MGB法TaqMan-水解型雜交探針熒光素非熒光淬滅基團(tuán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)MGB(Minor Groove Binder)將探針的Tm值提高10因此，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計(jì)得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計(jì)的成功率大為提高。TaqMan MGB探針對于富含A/T的模板可以區(qū)分得更為理想。第18頁，共82頁。 TaqMan法 工作原理每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點(diǎn)檢測熒光第19頁，共82頁。Taq

8、man法 優(yōu)缺點(diǎn)對目標(biāo)序列的高特異性-陰性結(jié)果確定設(shè)計(jì)相對簡單-與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)重復(fù)性比較好優(yōu) 點(diǎn)只適合一個特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)難度大不易找到本底低的探針缺 點(diǎn)第20頁，共82頁。SYBR Green 法PCR反應(yīng)的建立反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化:避免非特異產(chǎn)品SYBR Green 使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測Primer：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn)MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物反應(yīng)Buffer 體系的優(yōu)化反應(yīng)溫度和時間參數(shù):由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同EVA Green、LC Green第2

9、1頁，共82頁。SYBR Green 法 應(yīng)用范圍 起始模板的測定 基因型的分析融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，對常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義，如對primer的評價(jià)；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物。HRM第22頁，共82頁。TaqMan 法 PCR反應(yīng)的建立1、引物、探針的設(shè)計(jì)：探針優(yōu)先于引物 有軟件可以輔助設(shè)計(jì)：Primer5、beacon design、Primer Express 探針Tm為68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能會淬滅熒光素， 引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段400 bp，引物Tm為59-60 2、反應(yīng)參數(shù)的確定（使用梯度功能） 一般為：94 ，10-20S

10、60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度 72 ，45 S，3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值 引物濃度：50-900nM 探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同第23頁，共82頁。Taqman法 應(yīng)用范圍 起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 產(chǎn)物鑒定 SNP（單核苷酸多態(tài)性）分析第24頁，共82頁。實(shí)時熒光定量PCR 方法 3- Molecular beacon 法(分子信標(biāo))環(huán)莖熒光素 淬滅劑標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針 環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對序列組成發(fā)夾型雜交探針第25頁，共82頁。Molecular

11、 beacon (分子信標(biāo))工作原理探針游離時，呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，不能檢測到熒光互補(bǔ)序列出現(xiàn)時，探針與DNA結(jié)合，探針轉(zhuǎn)變成開放的線性結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生可被檢測的熒光。第26頁，共82頁。Molecular beacon (分子信標(biāo)) 應(yīng)用范圍 起始模板的定量 基因型分析 產(chǎn)物鑒定 SNP（單核苷酸多態(tài)性）分析第27頁，共82頁。Molecular beacon (分子信標(biāo)) 優(yōu)缺點(diǎn)高特異性：對目標(biāo)序列 檢測SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu) 點(diǎn) 只能用于一個特定目標(biāo) 設(shè)計(jì)困難 價(jià)格比較高缺 點(diǎn)第28頁，共82頁。實(shí)時熒光定量PCR 其他方法LNA probes- Locked Nucleic Acids碳

12、環(huán)引入亞甲基橋，提高Tm的作用Scorpions primers 第29頁，共82頁。實(shí)時熒光定量PCR 其他方法FRET probeAllglo探針蝎形引物（Scorpion primer）：熒光標(biāo)記引物Amplifluor：熒光標(biāo)記引物其他第30頁，共82頁。QPCR能定什么東西的量，怎么定？絕對定量：用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，推算未知的樣本中基因的拷貝數(shù)或濃度。相對定量：樣本中目標(biāo)序列相對于另一參照樣本的量的變化。常用于比較樣本中基因表達(dá)水平的高低變化，得到的結(jié)果是百分比。SNP基因分析其他31第31頁，共82頁。實(shí)時熒光定量PCR 原理 擴(kuò)增曲線熒光基團(tuán)熒光檢測元件擴(kuò)增曲線圖： 橫坐

13、標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度 每個循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號的收集第32頁，共82頁。一個極具重現(xiàn)性的參數(shù)Ct值Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定； Ct值則極具重現(xiàn)性第33頁，共82頁。什么是Ct值，如何確定？Cycle of thresholdPCR反應(yīng)管中的熒光信號達(dá)到特定值（threshold，閾值）時候的所需要的循環(huán)數(shù)。不同的數(shù)據(jù)分析方法（樣點(diǎn)擬合法/基線閾值法，最大二階導(dǎo)數(shù)法）得到的Ct值不同，一般選用前者。34第34頁，共82頁。 實(shí)時熒光定量PCR 原理Ct值Ct值的定義-樣點(diǎn)擬合法（基線閾值法）： PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定

14、的域值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t) value 第35頁，共82頁。實(shí)時熒光定量PCR 原理熒光閾值熒光信號閾值 （threshold ）： 前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值 熒光域值的缺省設(shè)置是315個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍 手動設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99 真正的信號:熒光信號超過域值第36頁，共82頁。 實(shí)時熒光定量PCR 原理Ct值Ct值的定義-最大二階導(dǎo)數(shù)法： PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號變化最大時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次

15、數(shù)。重復(fù)性好，但對曲線要求高。第37頁，共82頁。確定未知樣品的 C(t)值 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量Sample 模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小 Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量25有了Ct值，怎么定量？絕對定量第38頁，共82頁。實(shí)時熒光定量PCR法-標(biāo)準(zhǔn)樣品絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品： 已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)錄的RNA（假病毒） 用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品如何設(shè)定？1.含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒或cDNA2.紫外分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)測定濃度3.根據(jù)

16、質(zhì)粒或cDNA分子量換算成拷貝數(shù)，做系列稀釋第39頁，共82頁。相對定量相對定量中的內(nèi)標(biāo)（看家基因）內(nèi)標(biāo)通常是-actin、GAPDH基因等看家基因在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定， 受環(huán)境因素影響小內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量Ct, Ct法目的基因、看家基因?qū)Ρ葮颖尽⒋郎y樣本第40頁，共82頁。科研中的應(yīng)用：核酸濃度定量環(huán)境微生物的監(jiān)測轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的檢測基因轉(zhuǎn)錄的檢測第41頁，共82頁。醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用：對病原DNA的檢測染色體病的診斷基因病的診斷藥效考核腫瘤研究第42頁，共82頁。影響定量PCR結(jié)果的因素起始材料模板DNAPCR擴(kuò)增熒光檢測數(shù)據(jù)處理結(jié)果分析核酸抽

17、提，反轉(zhuǎn)試劑人為操作影響儀器，耗材，試劑軟件第43頁，共82頁。儀器之間的差異44第44頁，共82頁。儀器因素不同品牌的儀器之間有什么區(qū)別加熱（不同半導(dǎo)體之間的差異）導(dǎo)熱（底座材料的差異）散熱（散熱片的材質(zhì)，形狀，大小，風(fēng)扇的大小，轉(zhuǎn)速，壽命）功率升降溫的速度，策略電源，電流電壓的穩(wěn)定性光學(xué)信號檢測的實(shí)現(xiàn)方式不同第45頁，共82頁。軟件差異數(shù)據(jù)處理算法不一樣分析方法不一樣第46頁，共82頁。實(shí)驗(yàn)參數(shù)的影響溫度循環(huán)參數(shù)的影響熒光增益值的影響背景校準(zhǔn)參數(shù)的影響第47頁，共82頁。不同品牌試劑之間的差異酶的活性（擴(kuò)增效率不一樣）熒光分子質(zhì)量（發(fā)光強(qiáng)度不一樣）組分不同（適用的模板不一樣，擴(kuò)增效率不一樣

18、）純度優(yōu)化程度第48頁，共82頁。不同耗材之間的差異板生產(chǎn)廠家的模具精度，穩(wěn)定性，批間差（影響加熱或熒光采集）適應(yīng)的機(jī)型不一樣膜透明度（影響熒光信號采集）穩(wěn)定性，耐熱性，粘度（液體蒸發(fā)）移液器槍頭模具精度不夠，氣密性不一致（影響加樣一致性）第49頁，共82頁。常見的一些96孔PCR板50第50頁，共82頁。模板的影響起始材料的質(zhì)量核酸抽提方案的選擇抽提試劑的選擇反轉(zhuǎn)錄試劑的選擇第51頁，共82頁。人的因素加樣的準(zhǔn)確性樣品是否混勻膜是否封的嚴(yán)實(shí)第52頁，共82頁。多因素影響的煩惱dNTP，Buffer，酶，引物，模板，H2O，Mg2+儀器，軟件，電腦，板材，管，膜移液器，槍頭第53頁，共82頁。

19、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)缺乏給用戶增添了大量麻煩耗材和儀器不兼容試劑在某個機(jī)型上效果不好試劑和耗材配合不好各種產(chǎn)品品種繁多，生產(chǎn)廠家繁多廠家只管自己的產(chǎn)品達(dá)到好的效果，很難考慮下游實(shí)驗(yàn)的效果54第54頁，共82頁。PCR，不只是溫度循環(huán)！55用戶要考慮的東西太多了！第55頁，共82頁。一攬子解決方案56試劑儀器耗材來自同一個廠商的產(chǎn)品會做好各種兼容性測試，保證了實(shí)驗(yàn)效果用戶不再是小白鼠第56頁，共82頁。一攬子解決方案的便利省時省力省錢把時間和精力花在科學(xué)問題上早出結(jié)果，早發(fā)文章出好結(jié)果，發(fā)大文章57第57頁，共82頁。良好的習(xí)慣試劑擺放前后一致的加樣方式時刻觀察各個試劑組分的配置濃度要合適第58頁，共82頁

20、。良好的實(shí)驗(yàn)環(huán)境59第59頁，共82頁。標(biāo)準(zhǔn)PCR實(shí)驗(yàn)室布局圖三區(qū)分隔布局-加強(qiáng)防污染第60頁，共82頁。良好的實(shí)驗(yàn)環(huán)境PCR操作柜第61頁，共82頁。氣溶膠污染的案例藥廠學(xué)校第62頁，共82頁。儀器使用及維護(hù)定量PCR價(jià)值高，人人都要使用維護(hù)困難定量PCR是一種高精密的電子機(jī)械產(chǎn)品機(jī)器內(nèi)有電子元器件也有機(jī)械運(yùn)動部件有精密的溫控系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)怎樣的使用和維護(hù)才能保證儀器的使用壽命及檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性？第63頁，共82頁。儀器使用及維護(hù)儀器放置對環(huán)境的要求防水防塵潔凈空間防電磁干擾周圍不能有大型設(shè)備防電網(wǎng)波動-使用UPS避光不能放在有光線變化的環(huán)境下通風(fēng)給儀器一定的生存空間電腦專用的電腦、防病毒第

21、64頁，共82頁。儀器使用及維護(hù)儀器使用的要求儀器安裝必須按照使用說明書進(jìn)行升降溫速度最高速度與平均速度極限溫度能不用就不用開機(jī)時間使用結(jié)束后及時關(guān)機(jī)，保護(hù)光電系統(tǒng)使用高質(zhì)量的定量PCR管（必須是底部透明）第65頁，共82頁。儀器使用及維護(hù)儀器實(shí)驗(yàn)做不出來的可能原因機(jī)器壞了試劑壞了操作失誤模板壞了儀器間差異環(huán)境的差異第66頁，共82頁。儀器使用及維護(hù)儀器維護(hù)的要求儀器的清潔防污染模塊的清潔減小本底差異長期不用定期用可靠的試劑做儀器性能測試（均一性檢測），如果差異偏大就要咨詢廠家第67頁，共82頁。第68頁，共82頁。占地面積 26，000 M2擁有一萬級的凈空房、大型超凈實(shí)驗(yàn)室、GMP試劑車間

22、、中心實(shí)驗(yàn)室等一流的環(huán)境和設(shè)備。建筑面積 16，000 M2第69頁，共82頁。中國最大的生命科學(xué)儀器生產(chǎn)廠家亞洲最大的PCR儀專業(yè)生產(chǎn)基地A REMARKABLE SUCCESS STORY讓我們從這里 開啟一段博日之旅博日科技第70頁，共82頁。有 序?qū)?注嚴(yán) 格博日制造公司概況公司概況科學(xué)儀器制造第71頁，共82頁。產(chǎn)品策劃產(chǎn)品設(shè)計(jì)產(chǎn)品調(diào)試產(chǎn)品驗(yàn)證研 發(fā)公司概況公司概況第72頁，共82頁。 公司簡介 07 BIOLOGICAL PIONEER制造優(yōu)勢GMP標(biāo)準(zhǔn)車間1800平方米的GMP標(biāo)準(zhǔn)車間第73頁，共82頁。嚴(yán)格按照國際先進(jìn)的質(zhì)量保證體系運(yùn)行通過德國TUV的ISO9001和EN46001認(rèn)證公司概況公司概況品質(zhì)保證第74頁，共82頁。公司概況1992矚目過去，放眼未來！20121995年 成立 Ferrotec中國集團(tuán)研發(fā)小組1995全球最大的半導(dǎo)體制冷片生產(chǎn)基地！中國 杭州公司概況發(fā)展背景2002年 杭州博日科技有限公司正式成立2002第75頁，共82頁。76 公司概況公司概況發(fā)展背景 2015 立志成為中國生命科學(xué)領(lǐng)域的先鋒初期市場探索階段公司品牌初創(chuàng)階段 199519972000200120082010Ferrotec（中國）研發(fā)小組成立博日科技成立涉