1、nn曲霉發酵生產纖維素酶試驗一、試驗目的1、了解纖維素酶的生產工藝和原理2、把握液體發酵和固體發酵工藝3、學會DNS法測定還原糖含量的方法和原理二、試驗原理纖維素酶可以用于一切含纖維素的生物質的降解，具有寬闊的應用前景。高 產纖維素酶的微生物主要有木霉屬、曲霉屬、根霉屬，黑曲霉所產的纖維素酶中 8 -葡萄糖甘酶活力高，能避開酶解產物纖維二糖的阻遏作用，而且平安無毒， 故而成為生產纖維素酶的主要菌種之一。纖維素酶是誘導酶，故發酵生產時需有 纖維素物質作誘導劑。以竣甲基纖維素鈉作底物，用發酵所得纖維素酶對底物進行酶解，測定酶解 液中的還原糖含量（以葡萄糖計），可以計算酶活力凹凸。還原糖與DNS反響

2、形 成棕色物質，顏色深淺與糖含量成正比。三、材料與試劑配制1、生產菌種：黑曲霉2、斜面（活化）培育基：酵母膏0.4%,蛋白豚0.6肌可溶性淀粉1%, 葡萄糖0.9%,馬玲薯浸出液7%,瓊脂2%,陳海水（或人工海水）配制，。3 人工海水：NaCl = 24 g/L ;MgSO4 7H2 0 = 7. 0 g/L ;NH4N03 = 1 g/L ;KC1 =0. 7 g/ L ; NaH2P04 = 2. 0 g/ L ; Na2HP04 =3.0 g/ L , pH7. 4。4、微量元素液： FeS04 7H2O 5. Omg/L , MnS04 H20 1. 6mg/L , ZnSO. 7H2

3、0 1.4mg/L, CoCl2 2. Omg/L,加蒸偏水 200nli 使之溶解。5、液體發酵產酶培育基：款皮作碳源3 g,氯化錢或硫酸錢作無機氮 源1 g,蛋白陳0.05g作有機氮源，人工海水100 ml （含1%微量元素液），自 然pH值。6、固體發酵產酶培育基：秋皮：稻草粉=2： 1作碳源5 g,人工海水12 ml (含1%微量元素液，1%氯化鏤或硫酸鏤，0.05%蛋白月東)，自然pH值。7、6%DNS試劑：稱取酒石酸鉀鈉182g溶于500nli水中，加熱溶解，于熱溶液中依次加入3, 5-二硝基水楊酸6g, 20. 8gNaOH, 5g苯酚，5g無水亞硫酸鈉, 加熱攪拌溶解，冷卻后定

4、容至1000mL儲存在棕色瓶中放置一周后使用。(提前 配制)8、0. 1 mol/L檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液(pH 4.8)0.lmol/L檸檬酸鈉溶液100mL:稱2.941克檸檬酸鈉(檸檬酸鈉的分子量為294.12),約20L蒸儲水溶解后，轉入100mL溶量瓶，定容至刻度。0. lmol/L檸檬酸溶液100mL:稱2. 101克檸檬酸(檸檬酸的分子量為210. 14),約20L蒸儲水溶解后，轉入100mL溶量瓶，定容至刻度。pH4. 8的檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液100mL:量取0. lmol/L檸檬酸鈉溶液 54mL和0. lmol/L檸檬酸溶液46mL混合搖勻。9、1%CMC-Na 溶液稱取

5、1. 0克竣甲基纖維素納，用pH 4. 8的檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液加熱溶解。10、Img. mL-1標準葡萄糖溶液lmg/mL葡萄糖溶液250mL:精確稱取無水葡萄糖250mg,溶解定容到250ml。四、主要儀器恒溫培育箱，搖床培育箱，可見光分光光度計、冷凍離心機、電子天公平。五、試驗步驟1、培育基配制分別按上述方法配制液體發酵培育基和固體發酵培育基，121C滅菌20分鐘。2、胞子懸液的制備將斜面培育基上的曲霉抱子用少量無菌人工海水洗下，采用玻璃珠在磁力攪 拌下攪拌1520分鐘，充分打散抱子，稀釋成5x107個/ml左右的抱子懸液。3、液體發酵產酶試驗按6% (v/v )接種量將濃度約為5義1

6、0 7個/ml的菌株胞子懸液接入已滅菌的液體發酵培育基（150 ml錐瓶裝液100 ml）,于35, 180r/min條件下搖 床培育5天。發酵液4、5000 r/min離心15 min,上清液稀釋5倍，測定發 酵液中的酶活力。4、體發酵產酶試驗100 ml三角燒瓶裝5g已滅菌的固體發酵培育基，按1:3（v/w）接種量將濃度 約為5義10 7個的菌株抱子懸液，于35c恒溫培育箱中培育，接種48小時后隔 天翻曲一次，第四或第五天補充無菌水保持基質水分。培育5天后，取發酵成熟 曲1g,加蒸儲水10ml,攪拌勻稱，30,浸提lh,雙層紗布過濾，濾液經4, 5000rmp離心15min,上清為粗酶液。

7、測定時適當分級稀釋，使OD54O在0. 21. 0范 圍。5、酶活力測定及酶活力定義（1）葡萄糖標準曲線繪制精確稱取無水葡萄糖250mg，溶解定容到250mlo分別吸取此液1.0, 2. 0, 3.0, 4. 0, 5.0 ml至5個25ml的比色管中,用蒸儲水定容到25nli （即 加水 24, 23, 22, 21, 20ml）再分別吸取上溶液各2. 5ml于比色管中（糖液分別含糖量為 0. 1,0. 2,0. 3, 0. 4, 0. 5mg）,各加 2. 5mlDNS 試劑,煮沸 5min。（比照管 2. 5ml 水 代替糖液，冷卻，測定0D54。表1葡萄糖標準曲線繪制加樣表管號1234

8、56蒸儲水（mL）2.5一一標準葡萄糖2.52.52.52.52.5(mL)DNS (mL)2.52.52.52.52.52.5含糖量（mg）00.10.20.30.40.5OD540以糖含量為橫坐標，Am為縱坐標，（或反過來）繪制標準曲線。（1）內切葡聚糖酶（CMCase）酶活：取適當稀釋的酶液0. 5 ml,加入2. 0 ml 1% (W/V)的CMC-Na溶液(溶于0. Imol/L檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液,pH 4. 8), 60反響30 min,加入2. 5 ml DNS終止反響，沸水浴顯色5 min,測定OD54O。 以滅活酶液作比照。比照組：取適當稀釋的酶液0.5 ml,加入2.

9、5 ml DNS 60反響30 min, 加入2.0 ml 1% (W/V)的CMC-Na溶液(溶于0. 1 mol/L檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖 液，pH 4. 8),沸水浴顯色5 min,測定OD540o(2)濾紙酶(FPA)酶活：取50 mg (IX 6 cm)新華濾紙，加入酶液0.5 ml, 再加入pH 4. 8的檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液2. 0 ml, 60反響30min,其它同前。比照組：取適當稀釋的酶液0.5 ml, 60反響30min,加入2. 5 ml DNS、2.0 mlpH 4. 8的檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液、50 mg (IX 6 cm)新華濾紙，沸水浴5min, 測定0D540

10、o酶活力定義：在上述反響條件下，每分鐘催化底物水解生成1 Mmol葡萄糖 所需的酶量為1個酶活力單位(U)。酶活力二mz、式中卜為由標準曲線查得或回歸方程算得的還30 x0.5x 180原糖含量，mgo六、數據處理.試驗紀錄(1)菌體每天的生長狀況：第一天黑曲霉沒多大的變化，其次天時黑曲霉 已擴散快速，開頭變白，第三天培育基上已經有一層白色的菌落，第四天菌落由 白色已經漸漸的變成鮮黃色，第五天培育基上的菌落已經變成了黑色厚絨狀。(2)酶活的測定的試驗數據紀錄：CMCase 酶活：液體發酵產酶的測量數據如表1：平均比照組(5400. 0000. 0000. 0000. 000試驗組0D5400.

11、 2210. 2210. 2210. 221固體發酵產酶的測量數據如表2：*-平均比照組0D5400. 0000. 0000. 0000. 000試驗組0D5400. 4010. 4010. 4000. 401FPA酶活:vi液體發酵產酶的測量數據如表3：.平均比照組OD54o0. 0000. 0000. 0000. 000試驗組od54O0. 2360. 2350. 2360. 2362固體發酵產酶的測量數據如表4：.平均比照組OD5400. 0000. 0000. 0000. 000試驗組OD54O0. 5480. 5480. 5480. 548表5葡萄糖標準曲線繪制加樣表管號123456

12、蒸儲水(mL)2. 5標準葡萄糖(mL)2. 52. 52. 52. 52.5DNS (mL)2.52. 52.52.52. 52.5含糖量(mg)00. 10.20.30.40. 5OD540 /測量次數0. 0000.0110. 1950. 3830. 5630. 8920. 0000.0110. 1940. 3830. 5630. 906*0. 0000.0110. 1950. 3830. 5640. 907平均0. 0000.0110. 1950. 3830. 5630. 902葡萄糖稀釋兩倍后的含糖量:試管號123456含糖量 (mg)00.050.10.150.20.2500. 0

13、50. 10. 150.20.25含糖量(mg)酶活力二Ax5xl00030 x0.5x180依據上表數據，以糖含量為橫坐標，A54。為縱坐標可繪制以下標準曲線:標準曲線0000. 9000. 8000. 7000. 600.5000. 4000. 3000. 2000. 1000. 000.酶活測定結果(1)內切葡聚糖酶(CMCase)酶活：液體發酵產酶的酶活力計算:且依據標準葡萄糖標準曲線及表1的數據可以得到，A=0. lOlmg 所以酶活力*器U黑=87(U/m】)固體發酵產酶的酶活力計算: 同理可得,A=0. 155mg船、工為Ax5xl000 0.155x5x1000 Q 0rlem、所以,酶活力=2. 870 (U/g)30 x0.05x18030 x0.05x180(2)濾紙酶酶活測定的計算：液體發酵產酶的酶活力計算: 同理可得,A=0. llmg所以，酶活力二一X5X1000 R. 203(u/ml)30 x0.5x180固體發酵產酶的酶活力計算：同理可得,A=0. 19mg所以，酶活力:一* 5x1000 =3. 518 (U/g)30 x0.05x180.結果分析和爭論由以上計算可得，本次試驗測得的酶活力較低。而導致消失這樣結果偏差的 緣由有一下幾點：接種培育階段：.在接種期間對于無菌環境的試