1、項目名稱：惡性腫瘤發生、發展的細胞表觀遺傳機制首席科學家：尚永豐北京大學起止年限：2011.1至2015.8依托部門：教育部二、預期目標總體目標：本項目瞄準表觀遺傳學研究的前沿，整合國內優秀研究人員，系統深入地開展惡性腫瘤發生發展及侵襲轉移的表觀遺傳學研究。本項目的總體目標如下：闡明表觀遺傳關鍵機制即DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA對基因表達調控的影響；明確表觀遺傳調控在乳腺癌、肺癌發生發展及侵襲轉移中的作用；揭示EMT過程中的表觀遺傳學變化及細胞重編程機制；闡明細胞微環境在腫瘤轉移中的作用及機制；整合各種信息數據，描繪乳腺癌、肺癌發生發展及侵襲轉移的分子調控網絡。通過本項目的實施，建立

2、和完善表觀遺傳學研究的新的技術體系，實現我國在生命科學及醫學研究領域的理論創新，為惡性腫瘤預警、診斷、治療和藥物篩選提供新思路、新途徑和新靶標，發現幾個潛在的可以用于乳腺癌、肺癌診斷的分子標志物及藥物治療的分子靶標，并在本項目的實施過程中建立一支具有國際競爭力的研究團隊。五年預期目標：1、發現一批新的組蛋白修飾因子，探明組蛋白修飾與DNA甲基化之間相互作用的分子機制，篩選一批腫瘤相關ncRNA,鑒定一批具有潛在臨床應用價值的腫瘤診斷及治療的新的ncRNA分子靶標；鑒定一批新的EMT關鍵調控因子；發現針對轉移型乳腺癌、肺癌的新的有效治療靶點。2、建立一整套適應于惡性腫瘤表觀遺傳學研究的技術平臺和

3、技術體系。3、培養一批中青年學術帶頭人和學術骨干；培養研究生（含碩、博）50名以上、博士后12名以上。4、在國際一流雜志（IF10）發表論文8篇以上，在有影響力的雜志（IF5）上發表論文25篇以上。三、研究方案本項目分為六個課題，將全面系統地研究乳腺癌和肺癌發生發展及侵襲轉移的表觀遺傳機制，為乳腺癌和肺癌的預防、診斷、治療提供分子標志及藥物靶標。前三課題分別從DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA三個不同角度，分析腫瘤發生發展及侵襲轉移中表觀遺傳學改變，研究其相互之間的作用關系及分子調控機理；第四課題將對腫瘤轉移過程中非常重要的現象即上皮間質轉換的細胞重編程機制進行探討；第五課題從腫瘤微環境的

4、角度，探討腫瘤微環境中基質細胞及細胞因子對腫瘤細胞生物學行為尤其是侵襲轉移的影響；第六課題整合所有的信息，描繪乳腺癌和肺癌發生發展及侵襲轉移的分子調控網絡。六個部分各有側重，又緊密銜接，團結合作，互相促進。課題一：dna甲基化變化在惡性腫瘤發生發展及侵襲轉移中的作用本研究將篩選腫瘤細胞中高甲基化并失活的基因并分析其啟動子區域組蛋白的修飾狀況，探討DNA甲基化與組蛋白修飾的先后關系。篩選出影響DNA甲基化酶和DNA結合的關鍵性因子或蛋白朋確相關關鍵性因子或蛋白與DNA甲基化酶及DNA結合蛋白作用的分子機制，進一步明確特定基因發生DNA甲基化的分子機制，進而揭示組蛋白修飾與DNA甲基化相互作用的分

5、子機制。另外在腫瘤組織，CBX7等PcG蛋白的正常組合關系被破壞，并且這種PcG蛋白組合紊亂與腫瘤相關基因失活之間可能存在因果關系。本研究還將以多種器官的正常組織和腫瘤組織為對象，了解正常組織細胞中PcG蛋白的正常組合關系，研究這種正常組合關系破壞與腫瘤發生的關系及其與腫瘤相關基因組蛋白修飾、核小體定位和DNA甲基化發生的關系。表觀遺傳重編程不僅在體細胞去分化和獲得多能“干性”方面發揮關鍵性作用，也是細胞癌變過程中獲得無限增殖和侵襲/轉移能力的物質基礎。本研究將在開展腫瘤轉移相關DNA甲基化組學研究的基礎上，篩選并鑒定出影響腫瘤細胞轉移能力的關鍵性DNA甲基化變化位點及其網絡，了解其在癌細胞獲

6、得轉移能力重編程過程中作用，建立預測惡性腫瘤轉移能力的表觀遺傳分子分型體系。總體研究方案如下：篩選影響DNMT和DNA結合及組蛋口修飾的關鍵蛋口探討關鍵蛋白活性和探明關鍵蛋白與DNMT和DNA8=明晰特異基因發生DNA甲基化的分子機制和組蛋白修飾調控建立腫瘤轉移能力的DNA甲基驗證研究：大樣本患者隨訪、模式動物課題負責人：朱衛國，北京大學學術骨干：鄧大君，北京大學伍會健，大連理工大學生命科學與技術學院課題二：組蛋白修飾異常在惡性腫瘤發生發展及侵襲轉移中的作用本課題將常規方法和高通量技術相結合，從篩選乳腺癌和肺癌中新的組蛋白修飾調控因子及其復合物出發，逐步揭示所獲得的候選基因對于組蛋白修飾的作用

7、和調控機理，并進一步闡明這些基因在調控腫瘤發生發展及侵襲轉移中的作用及其機制。將以功能基因組學和蛋白質組學的方法篩選乳腺癌和肺癌中發生突變或者表達異常的組蛋白修飾酶以及轉錄因子，同時針對MLL1等相關的甲基化酶復合物組分，LSD1等去甲基化酶、EYA去磷酸化酶和磷酸化激酶、轉錄因子Smad4和ER及其轉錄輔助因子等，篩選新的組蛋白修飾基因或miRNA，利用各種蛋白質間相互作用方法驗證篩選獲得的組蛋白修飾復合物中各成員間的相互作用。利用基因過量表達和敲低/敲除技術、基因突變技術、組蛋白甲基化、磷酸化和乙酰化分析、ChIP-seq等技術檢測分離的組蛋白修飾因子對組蛋白修飾和基因表達的影響及其在基因

8、表達調控中的分子機制。在此基礎上，利用動物模型和臨床標本對組蛋白修飾候選因子在腫瘤發生發展及侵襲轉移中的作用做深入分析。總體研究方案如下：組蛋白修飾異常機制與腫瘤發生發展甲基化酶、磷酸酶、Smad4和ER轉錄因子等高通量芯片、酵母雙雜交、免疫沉淀-質譜篩選新的組蛋白3修飾復合物/因子r相互作用組蛋白修飾靶基因表達建立腫瘤發生發展侵襲轉移相關的組蛋白課題負責人：葉棋濃，軍事醫學科學院生物工程研究所學術骨干：楊曉，軍事醫學科學院生物工程研究所課題三：非編碼RNA在惡性腫瘤發生發展及侵襲轉移中的作用研究ncRNA作用機制的一個關鍵就是鑒定與之相互作用的靶分子，特別是蛋白分子。本課題將以乳腺癌細胞系、

9、腫瘤組織、腫瘤啟動細胞為模型，利用自主建立的RNA-SELEX-seq技術平臺系統地發現和鑒定與腫瘤相關蛋白(特別是其中的轉錄因子和表觀修飾酶)發生相互作用的ncRNA；還將采用不同大小的ncRNA的cDNA文庫(size-fractionedRNAlibrary)鑒定腫瘤啟動細胞特異的ncRNAo采用球囊形成實驗、二維平皿及三維Matrigel培養以及免疫缺陷鼠體內種植和腫瘤組織等研究體系，系統深入地研究ncRNA和蛋白間的相互作用、它們所構成的結構網絡、調控網絡、以及這些相互作用的生理功能，剖析ncRNA調控網絡在腫瘤發生發展進程中的作用與意義。與此同時，選擇其中一些有重要功能的ncRNA

10、，結合大量的腫瘤患者的標本及臨床資料，研究將其作為藥靶或生物標記物的可能性。非編碼RNA與腫瘤發生發展研究腫瘤相關蛋白結合的ncRNA的研究課題負責人：宋旭，四川大學學術骨干：宋爾衛，中山大學RNA-SELEX-seq技Size-fractionedRNA術平臺鑒定與腫瘤library鑒定腫瘤啟動李沁桐，四川大學課題四：上皮間質轉換的機理及惡性腫瘤侵襲轉移的細胞重編程機制以乳腺癌細胞系、腫瘤組織及癌旁正常組織為模型，探討EMT的細胞重編程作用機理及其在乳腺癌轉移及化療藥物耐受中的作用。選取永生化的正常乳腺細胞系（如MCF-10A）,ER陽性低轉移性細胞系（如MCF-7,T47-D等），ER陰性

11、高轉移細胞系（如MDA-MB-231,SUM1315等），以及ER陽性但對三苯氧胺耐藥的BT-474細胞等為主要細胞模型，并通過lentivirus介導的shRNA抑制或過表達E-cadherin在這些細胞系中分別誘導或抑制EMT表型。比較不同細胞系在EMT前后其基因表達譜變化，用MeDIP-seq法比較基因組范圍內DNA甲基化變化情況，并用ChIP-seq法比較與轉錄相關的主要的組蛋白修飾標志如激活性的組蛋白乙酰化、H3K4甲基化，抑制性的H3K9，H3K27,H4K20甲基化等在全基因組范圍內的分布變化規律。在此基礎上，對差異表達的新基因及特異性組蛋白修飾酶在EMT以及在乳腺癌轉移及藥物耐

12、受中的作用做深入分析。同時，選取兩種以上高轉移性細胞系，以TGFP或TNFa刺激細胞或穩定轉染p-catenin分別激活TGFp.NFkB以及Wnt信號通路誘導EMT。用基因表達譜、蛋白質譜及全蛋白磷酸化譜分析在三種條件下共同變化的靶基因及蛋白分子。這些共同通路分子是各信號通路間的交互作用節點及潛在的EMT關鍵調控因子，對它們的作用機理進行進一步細胞及分子水平上的分析。建立可誘導表達熒光標記的E-cadherin或其它EMT誘導因子的穩定轉染細胞系，以在細胞及分子水平上實時觀察細胞內外環境的改變對EMT及細胞轉移能力的影響。總體研究方案如下：上皮誨質轉換的機理及表觀遺傳機制以TGF卩或TNFa

13、刺激細胞或穩定轉染p-catenin分別誘導癌細胞發生EMT建立低轉移性、高轉移性乳腺癌細胞系及人工改變E-cadherin水平誘導或抑制EMT后的蛋白質譜差異磷酸化修飾蛋白質組學差異基因表達譜差異MeDIP-seq檢測DNA甲基化變化ChIP-seq檢測主要轉錄相關組蛋白修飾功能域分析；質譜檢測并驗證相互作用蛋白；靶基因檢測與已病毒介導的穩定過表達及shRNA抑制候選基因后，細胞表型及小鼠乳腺差異表達基因總體特征分析匚二新基因功能分析及特異性組蛋白修飾酶在匸EMT中的作用尋找高轉移性乳腺癌及對現有化療藥物不敏課題負責人：尚永豐，北京大學醫學部學術骨干：梁靜，北京大學醫學部張華，中國航天員科研

14、訓練中心課題五：細胞微環境與腫瘤的發生發展及侵襲轉移以乳腺癌為模型，分別從腫瘤細胞微環境中的腫瘤相關成纖維細胞、浸潤的免疫細胞（腫瘤相關性巨噬細胞）和基質分子（細胞因子TGF0）入手，研究腫瘤微環境對腫瘤細胞生物學行為尤其是侵襲轉移的影響。分離乳腺良性增生患者及各種不同類型不同分期的乳腺癌患者組織微環境中的成纖維細胞及腫瘤相關性巨噬細胞，分析miRNA及mRNA的表達譜；研究這些差異表達的基因或miRNA對成纖維細胞及腫瘤細胞侵襲轉移能力的影響；建立三維細胞培養模型，將腫瘤細胞與基質細胞共培養，盡量模擬體內環境，并應用免疫分子及免疫細胞缺陷小鼠構建小鼠骨髓嵌合體動物模型，研究這些差異表達的基因

15、或miRNA對共培養后腫瘤細胞侵襲轉移能力的影響；采用基因工程小鼠模型，從分子、細胞、動物三個層面研究TGF卩信號通路在腫瘤微環境中與REGy蛋白酶體激活因子、p53等重要腫瘤因子動態相互作用及其動態調控的分子機制。在解析這些調控機制的生理病理意義的基礎上，通過腫瘤模型研究進一步闡明腫瘤微環境中重要生物學因子對腫瘤發生發展的決定性作用。具體方案如下：細胞微環境與腫瘤發展及侵襲轉移基質細胞、細胞因子在腫瘤發生發展中的作用正常乳腺組織及不同類型的乳腺癌組LTGFR信號通路ZREGv-蛋匸耳酶體動物水平腫瘤相關成纖E細胞原代培養腫瘤相關性t巨噬細胞分子、細胞水平纖*yI八一/j|/H-i|-|r=m

16、RNA及miRNA表達譜分析基因敲除1TSmad2亞等建立基質細胞與免疫缺陷基因/miRNA位基因表達腫瘤細胞的三維小鼠骨髓嵌合體闡明REGy-蛋白酶體與TGF卩信號明確基質細胞的基因/miRNA對腫瘤轉移的影響建立腫瘤與細胞微環境網絡體系課題負責人：劉芝華，中國醫學科學院腫瘤研究所學術骨干：李曉濤，華東師范大學生命科學研究所曲春楓，中國醫學科學院腫瘤研究所課題六：惡性腫瘤發生發展及侵襲轉移的分子調控網絡利用腫瘤基因表達和表觀遺傳學數據，采用計算生物學方法推測在惡性腫瘤、干細胞中發生變化的表觀遺傳學調控網絡。為了更深入地研究腫瘤發生發展過程的分子調控網絡，還需要從以下幾個方面進一步發展基于貝葉

17、斯網絡的因果推斷方法。（1）考慮到實驗方法與手段的多樣性，需要開發能夠自動整合并利用多個異質實驗數據的因果推斷方法。這部分工作涉及去除反映單個數據源自身特征的背景信號，子網絡的拼接與集成，觀測型實驗數據與（基因敲除、RNA沉默等）干預型實驗數據的因果信息集成等多個問題；（2）通過開發根據數據特征自適應地調整網絡正則化參數的學習算法等方式，以解決如何在具有較高噪聲和不精確性的系統生物學實驗數據中進行可靠因果推斷的實際問題。對于大規模因果推斷問題，使用現有的貝葉斯因果推斷方法，還面臨有限的數據資源與急劇增大的網絡搜索空間的矛盾。為了保證學習結果的魯棒性，我們擬開發一系列能保持因果關系的特征選擇方法

18、來解決這個問題。（3）不同系統生物學因素之間的上下游作用關系可能會隨腫瘤發生與發展的過程而動態地發生變化，為此我們擬開發能夠正確推斷這種動態關系的貝葉斯網絡學習算法。因為腫瘤細胞有很多具有干細胞特性，且目前所掌握的胚胎干細胞數據比腫瘤數據更豐富也更系統,我們將在惡性腫瘤與干細胞中分別預測基因表達與表觀調控網絡，并進一步比較其異同。通過干擾預測的上游調控節點后以ChlP-PCR和ChlP-seq技術對下游節點進行檢測，對以上預測模型中的關鍵調控關系進行驗證。為了通過實驗驗證貝葉斯網絡模型推測出來的因果關系，我們將把它們作為遺傳學的上下游關系處理。這樣就可以人為地提高或降低上游事件的水平，例如，轉

19、錄因子結合或者其他組蛋白修飾水平，而后觀察下游事件，如基因表達，或者組蛋白或DNA修飾的水平的變化，來證實我們所預測的因果關系。以組蛋白甲基化修飾作用為例，甲基化轉移酶和去甲基化酶是可用于干擾網絡中的特定節點。譬如我們要證實H3K27me3抑制基因表達這一關系，我們可以通過抑制正常細胞或者癌細胞的組蛋白甲基化轉移酶或者去甲基化酶來調節H3K27me3水平，從而觀察下游基因表達水平的變化（圖2）。實際上，一些已報道的因果關系正是利用上述方法和遺傳突變在模式生物或細胞實驗中發現的。驗證轉錄因子對某種組蛋白修飾的作用可以通過過表達或者RNAi轉錄因子來直接觀察到。我們將通過過表達或者RNAi分別上調

20、或者下調轉錄因子，然后利用ChIP-qPCR技術檢測一些已知的修飾位點或者利用ChIP-seq技術在全基因水平檢測轉錄因子對全基因組范圍內組蛋白修飾的影響。基因表達圖2：如何通過干擾上游調控節點并以ChIP-PCR和ChIP-seq技術檢測下游基因驗證預測模型中的關鍵調控關系具體方案如下：惡性腫高通量數據的整合與網絡的計算預測瘤J汰冷居=的蟲白砧夂壬擊知in滯睦勞枚祐關鍵轉錄因子與基因的調控關系7子的ChTP實驗1/1ingJ、:子4絕緣子的基因組分布H表觀遺傳因子的基因組分布轉錄因子的目標基因表達譜差異惡性腫瘤發病因素預測的因果網多因素SNP與GWAS分析：鑒定腫瘤發病相關的重要基因突變染色

21、質空間形態與DNA、組蛋白修飾關鍵轉錄因子與目標基因的調控網絡RNAi與基因敲除研究：驗證腫瘤發病相關轉錄因子與基因的影響范圍課題負責人：韓敬東，中國科學院遺傳與發育生物學研究所學術骨干：吳旻，武漢大學生命科學學院四、年度計劃研究內容預期目標1）多種手段研究肺癌細胞腫瘤抑制1）找出有代表性的腫瘤抑制基因，基因甲基化狀況，開展腫瘤轉移分析甲基化譜，篩選出一組腫瘤相關DNA甲基化標志物研究；開轉移相關DNA甲基化標志物；掌展PcG蛋白表達變異與腫瘤抑制握腫瘤組織中多種PcG蛋白表達基因表觀遺傳失活關系研究；變異規律；2）利用高通量芯片、ChlP-Chip、2）獲得新的組蛋白修飾組分；ChlP-se

22、q、酵母雙雜交、免疫沉3）篩選出一批腫瘤相關的ncRNA；第淀結合質譜等技術，針對TGFp并確定ncRNA及相關蛋白的表達和雌激素信號通路相關因子，如譜；轉錄因子Smad4、ER及其轉錄輔4）優化EMT表型誘導條件，完成基助因子，篩選新的組蛋白修飾基因表達譜及MeDIP-seq,年因或miRNA;ChIP-seq法比較DNA甲基化及主3）利用RNA-SELEX-seq等技術平臺要組蛋白修飾譜變化實驗；系統篩選鑒定與腫瘤相關蛋白相5）發現與腫瘤發生發展和轉移相關的不同間質細胞的表型特征，以互作用的ncRNA;檢測ncRNA的及一些重要的免疫相關蛋白、間表達譜；質細胞中miRNA及mRNA的表達改

23、變；4）誘導或抑制EMT表型。比較不同6）建立能夠自動整合并利用多個異細胞系在EMT前后其基因表達譜質實驗數據，適用于大規模高噪聲的組學數據的因果推斷方法，變化，用MeDIP-seq法比較基因并開發為計算軟件。研究內容預期目標組范圍內DNA甲基化變化情況，并用ChlP-seq法比較與轉錄相關的主要的組蛋白修飾標志如激活性的組蛋白乙酰化、H3K4甲基化，抑制性的H3K9,H3K27,H4K20甲基化等在全基因組范圍內的分布變化規律。5）分離乳腺良性增生患者及乳腺癌患者微環境中的成纖維細胞、浸潤巨噬細胞、浸潤的單核巨噬細胞，分析miRNA及mRNA的表達譜，研究不同類型的乳腺癌以及不同侵襲轉移能力

24、的乳腺癌中上皮細胞與間質細胞的表達譜差異；6）開發能夠自動整合并利用多個異質實驗數據的因果推斷方法。包括去除反映單個數據源自身特征的背景信號，子網絡的拼接與集成，觀測型實驗數據與（基因敲除、RNA沉默等）干預型實驗數據的因果信息集成等多個問題。研究內容預期目標1）分析圍繞甲基化基因啟動子周圍1）探明組蛋白修飾與甲基化DNA之的組蛋白修飾狀況，開展核小體間的關聯性，證明核小體在DNA在DNA甲基化擴展過程中的作用甲基化擴展過程中的作用；研究；開展腫瘤轉移相關甲基化2）明確組蛋白修飾復合物中各成員標志物多中心驗證研究；間的相互作用及其相互作用方2）利用免疫共沉淀、GST式；pull-down、細胞

25、內共定位等蛋白3）初步確定ncRNA的作用靶點，特質間相互作用技術驗證篩選獲得別是與蛋白的相互作用；第的組蛋白修飾復合物中各成員間4）發現一些新的潛在EMT調控因的相互作用，定位相互作用的結子；二構域/區域。5）發現幾個間質細胞來源的與腫瘤3）研究篩選到的ncRNA與蛋白質、發生發展和轉移密切相關的新的年DNA或RNA等生物大分子的相互分子；作用；6）建立能夠自動進行因果關系的特4）對克隆得到的新的潛在EMT調控征選擇方法并開發為計算軟件。因子用分子生物學及細胞生物學探索推斷腫瘤發生與發展動態關的手段進行功能分析；系的方法；5）通過基因過表達或敲降的方法，7）發表5-6篇IF5的研究論文，1-

26、2研究差異表達的基因或miRNA對篇IF10的研究論文。申請專利成纖維細胞、巨噬細胞及腫瘤細胞的生物學行為的影響，尤其是1-2項。研究內容預期目標腫瘤細胞侵襲轉移能力的影響；6）對于大規模因果推斷問題，使用現有的貝葉斯因果推斷方法，還面臨有限的數據資源與急劇增大的網絡搜索空間的矛盾。為了保證學習結果的魯棒性，我們擬開發一系列能保持因果關系的特征選擇方法來解決這個問題。1）研究影響DNA甲基化和組蛋白修飾1）初步論證連接DNA甲基化與組蛋白的關鍵酶，找出連接甲基化與組蛋修飾的關鍵蛋白和酶。聯系得到一白的蛋白。在不同病變人體組織中組能夠準確預測腫瘤轉移能力的第腫瘤轉移相關基因DNA甲基化形DNA甲

27、基化標志物；成、擴展和維持規律研究；2）明確組蛋白修飾候選因子對組蛋三2）利用基因過量表達和敲低/敲除技白修飾和基因表達的影響；術、組蛋白修飾等分析技術檢測組3）發現腫瘤相關蛋白與ncRNA間相互年蛋白修飾因子對組蛋白修飾的影作用對基因轉錄的調控作用及具響及不同修飾間的相互影響。檢測體的分子機制；組蛋白修飾候選因子對TGFB、雌激4）建立單核巨噬細胞特定基因敲除素信號通路等相關的下游靶基因或過表達的小鼠乳腺癌模型；研究內容預期目標表達的影響。確定組蛋白修飾復合物中各成員間物理上的相互作用與功能上的相互作用的關系；）研究ncRNA在表觀遺傳修飾和轉錄水平上對基因轉錄的調控作用；以及ncRNA相關

28、的信號調控通路；）對克隆得到的新的潛在EMT調控因子用分子生物學及細胞生物學的手段進行功能分析；5）發展三維細胞培養模式，將腫瘤細胞與基質細胞共培養，盡量模擬體內環境，研究這些差異表達的基因或miRNA對共培養后腫瘤細胞侵襲轉移能力的影響，探討改變細胞微環境對腫瘤侵襲轉移的影響；6）在惡性腫瘤與干細胞中分別預測基因表達與表觀調控網絡，并進一步比較其異同。進一步通過自動文獻檢索來檢驗網絡的準確性。5）發現惡性腫瘤與干細胞中分別預測基因表達與表觀調控網絡，的異同；6）發表5-6篇IF5的研究論文，1-2篇IF10的研究論文。申請專利1-2項。研究內容預期目標1）研究DNA甲基化與組蛋白修飾的1）確

29、定影響DNA甲基化與組蛋白修先后及其相互影響的機制，開展飾的蛋白作用機制，確定DNA甲腫瘤轉移相關甲基化標志物生物基化標志物影響腫瘤轉移相關的學功能基礎研究；機制；2）以過量表達、RNA干擾和染色體2）確定組蛋白修飾候選因子在基因免疫沉淀等技術手段增加或者降表達調控中的分子機制；低組蛋白修飾候選因子在細胞內3）發現腫瘤相關蛋白與ncRNA間的的含量，檢測候選因子對組蛋白相互作用在細胞生長、分化、腫第修飾復合物中各成分的轉錄和蛋瘤發生發展及侵襲轉移中的作白質穩定性的影響、對組蛋白修用；四飾酶在靶基因序列上募集的影響4）原位ATC腫瘤異種移植模型的腫和對組蛋白修飾酶活性的影響；瘤轉移機制研究取得重

30、大進展；年3）利用細胞模型和裸鼠動物模型系5）驗證并估算得到貝葉斯網絡的預統研究ncRNA在腫瘤發生發展中測準確性；的作用；6）發表5-6篇IF5的研究論文，1-24）繼續進行EMT相關新基因功能分篇IF10的研究論文。申請專利析，并根據分子生物學的研究成果，建立必要的動物模型，研究新的EMT調控分子過表達或基因敲除后對乳腺癌轉移的影響；5）利用小鼠骨髓嵌合體和乳腺癌動1-2項。研究內容預期目標物模型，研究腫瘤相關間質細胞對腫瘤細胞的發展與轉移能力的影響。繼續研究化學致癌劑在腫瘤易發及對照小鼠中誘導特定的癌癥模型并研究其病理生理特征以及相關分子機制。原位ATC腫瘤異種移植模型的腫瘤轉移機制研究

31、；6）通過干擾預測的上游調控節點后以ChlP-PCR和ChlP-seq技術對下游節點進行檢測，對貝葉斯網絡模型推測出的關鍵調控關系進行驗證。1）探討表觀遺傳調控的新機制，建1）開發出1-2個預測腫瘤轉移能力第立測定腫瘤轉移能力的DNA甲基的DNA甲基化標志物診斷試劑化分型；進行DNA甲基化標志物盒;rrrlJ五診斷試劑盒開發；2）確定組蛋白修飾候選因子在腫瘤2）利用基因過量表達和敲低/敲除發生發展及侵襲轉移中的作用；年技術，在體外細胞水平和體內小3）提出ncRNA作用機制的新假說，鼠腫瘤模型中檢測篩選到的候選探討在細胞中是否存在一個通過研究內容預期目標分子對腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲、轉移以及E

32、MT的影響，檢測候選分子對細胞惡性轉化的能力。利用小鼠基因敲除模型，檢測組蛋白修飾因子及其調節的靶分子在體內組織水平上的改變模式，利用免疫組織化學等技術檢測某些候選分子及相應的組蛋白修飾在腫瘤發生發展及侵襲轉移中的臨床意義；3）系統深入地研究ncRNA和蛋白間的相互作用、它們所構成的結構網絡、調控網絡、以及這些相互作用的生理功能，剖析ncRNA調控網絡在腫瘤發生發展進程中的作用與意義；4）繼續進行功能分析實驗，并在乳腺癌腫瘤病人標本中驗證研究所得的EMT關鍵分子與腫瘤治療反應及預后的關系，篩選有診斷意RNA-蛋白相互作用而構成的結構網絡和信息調控網絡。為腫瘤診斷與治療提供新的理論基礎和ncRN

33、A分子靶標；4）篩選出1-2個對乳腺癌治療及預后具有診斷意義的分子標志；5）闡述在腫瘤微環境中，間質細胞及分子對腫瘤發生發展及侵襲轉移影響及作用的分子機制，從間質細胞角度尋找阻斷腫瘤侵襲轉移的靶分子；6）進一步驗證并估算貝葉斯網絡的預測準確性。并基于新的ChlP-seq數據得到改進的貝葉斯網絡模型。7）發表5-6篇IF5的研究論文，1-2篇IF10的研究論文，申請專利1-2項。義的分子標志；研究內容預期目標5）通過體內外實驗，闡明在腫瘤微環境中，促進單核細胞浸潤和分化發育成為不同類型巨噬細胞的調控因素，及不同微環境下不同的巨噬細胞亞群影響乳腺細胞以及乳腺腫瘤細胞增殖和行為特征機制；6）利用Ch

34、lP-seq技術在全基因水平檢測轉錄因子對全基因組范圍內組蛋白修飾的影響。并在加入新的ChIP-seq數據后重建并改進貝葉斯網絡模型。一、研究內容主要研究內容1、表觀遺傳重編程不僅在體細胞去分化和獲得多能“干性”方面發揮關鍵性作用，也是細胞癌變過程中獲得無限增殖和侵襲/轉移能力的物質基礎。本項目擬在開展轉移相關DNA甲基化組學研究的基礎上，篩選并鑒定出影響乳腺癌細胞轉移能力的關鍵性DNA甲基化變化位點及其網絡，了解其在乳腺癌細胞獲得轉移能力重編程過程中作用，建立預測乳腺癌等惡性腫瘤轉移能力的表觀遺傳分子分型體系。以腫瘤高甲基化基因1(Hic1)為目標，以III類組蛋白去乙酰化酶SIRT1為對象

35、，探討SIRT1作為組蛋白去乙酰化酶對組蛋白修飾及其對DNA甲基化酶和DNA結合蛋白相關因子的作用，篩選影響DNA甲基化酶和DNA結合蛋白的關鍵性因子明確相關關鍵性因子與DNA甲基化酶和DNA結合蛋白作用的分子機制進一步闡明Hicl基因發生DNA甲基化的分子機制，進而揭示組蛋白修飾和DNA甲基化的相互作用關系。探討逆轉DNA甲基化在腫瘤治療中的臨床應用價值，在明確“腫瘤組織DNA異常甲基化-基因表達變異-腫瘤細胞轉移功能”關系的基礎上，確定乳腺癌和肺癌轉移能力的關鍵性DNA甲基化變異位點及其網絡，建立腫瘤轉移能力的DNA甲基化分型體系，并結合大樣本腫瘤患者隨訪以及模式動物進行驗證研究。2、探討

36、組蛋白修飾如何影響基因的轉錄及這種調控形式如何影響惡性腫瘤發生發展及侵襲轉移。包括新的組蛋白修飾復合物的發現和作用機制的探討；研究不同組蛋白修飾之間的相互影響，特定的組蛋白修飾與特定的基因轉錄激活或抑制的關系，組蛋白修飾和轉錄因子/轉錄輔助因子的組裝，組蛋白修飾復合物的調控，組蛋白修飾在腫瘤發生發展及侵襲轉移中的作用和機制；篩選組蛋白修飾復合物成分，包括MLL1等相關的甲基化酶復合物成分、組蛋白磷酸化酶、TGF卩和雌激素信號途徑相關的組蛋白修飾因子等；驗證組蛋白修飾復合物中各成員間的相互作用；檢測分離的組蛋白修飾因子對組蛋白修飾的影響及不同修飾間的相互影響；檢測組蛋白修飾因子對靶基因的選擇性和

37、表達的影響，以及組蛋白修飾對Smad、ER等轉錄因子募集到靶基因啟動子上的作用；在細胞水平和小鼠腫瘤模型中檢測篩選到的候選分子在乳腺癌、肺癌等腫瘤發生發展及侵襲轉移中的作用和機制；收集大量臨床標本，結合病理及預后等資料，檢測幾個候選分子及相應的組蛋白修飾在乳腺癌、肺癌等腫瘤發生發展及侵襲轉移中的臨床意義。3、利用課題組前期工作中建立的篩選與目標蛋白相互作用的ncRNA的技術平臺（RNA-SELEX-seq），從腫瘤細胞系和腫瘤組織中篩選鑒定與腫瘤相關蛋白相互作用的ncRNA，研究ncRNA-蛋白質間相互作用的分子基礎、動態時空關系以及功能調控網絡；闡明ncRNA在表觀遺傳修飾和轉錄水平上對基因

38、轉錄的調控作用，深入探討它們在腫瘤發生發展及侵襲轉移中的意義；利用生物信息學和實驗相結合的方法鑒定以ncRNA為軸心，與之相互作用的蛋白質、RNA和DNA，發現ncRNA新的作用機制，探討在細胞中是否存在一個通過RNA-蛋白相互作用而構成的結構網絡和信息調控網絡；在發現和鑒定的腫瘤特異性ncRNA及其相關蛋白的基礎上，用腫瘤啟動細胞模型、腫瘤轉移模型（包括腫瘤細胞EMT模型）以及臨床標本，深入探索具有臨床意義的ncRNA及其相關蛋白在腫瘤發生發展中的作用。4、尋找新的EMT調控因子以及新的EMT相關調控通路，研究建立和維持EMT的信號通路之間的交互作用：一般來說，ER陽性的乳腺癌細胞（如MCF

39、-7細胞）轉移性弱，而ER陰性的乳腺癌細胞（如MDA-MB-231細胞）轉移性強。癌細胞ER表達陽性也是其對三苯氧胺等雌激素拮抗療法有反應性的前提條件。但三苯氧胺對部分ER陽性的乳腺癌細胞治療效果較差。選取正常乳腺癌細胞、乳腺癌低轉移性、高轉移性、耐藥性的代表細胞系進行表達譜分析，檢測它們是否具有EMT相關基因的表達差異。其中差異表達的除已知EMT基因外，未知功能的基因表達產物根據其功能域及蛋白質組學分析（如質譜檢測其相互作用蛋白等方法）可研究其是否為新的EMT相關轉錄因子。基因表達譜差異分析可同樣應用于以lentivirus在低轉移性細胞用shRNA抑制E-cadherin促進其EMT，或高

40、轉移性細胞引入E-cadherin表達后與原有細胞的對比研究中。已發現多種信號通路都與EMT相關。擬選取目前研究較為充分的TGFp通路，以及Wnt和NFkB通路為代表，分別給予乳腺癌細胞相關信號分子刺激誘導EMT，隨后進行基因表達譜、通路特異性蛋白質譜以及高通量的細胞內磷酸化修飾改變等分析，找到這些通路在EMT過程中的共同靶點并闡明其在EMT中如何扮演關鍵角色。建立可誘導表達熒光標記的E-cadherin或其它EMT誘導因子的穩定轉染細胞系，以在細胞及分子水平上實時觀察細胞內外環境的改變對EMT及細胞轉移能力的影響。同時，研究這些分子及相關的通路與乳腺癌病人的轉移、療效、預后及藥物敏感性的關系

41、，探討其臨床應用價值。5、EMT過程中DNA甲基化水平和組蛋白修飾在全基因組范圍內的改變及特異的組蛋白修飾酶如何參與調控EMT：EMT是已分化上皮細胞進行基因表達重編程的生物學行為，勢必有DNA甲基化及多種影響基因轉錄的組蛋白修飾在全基因組范圍內重新分布。利用MeDIP-seq檢測細胞在發生EMT時在全基因組范圍內的DNA甲基化變化規律。同時，針對特異性組蛋白化學修飾如轉錄激活性的組蛋白乙酰化、H3K4甲基化，轉錄抑制性的H3K9，H3K27，H4K20甲基化等，利用其特異性抗體進行ChIP-seq分析，檢測細胞發生EMT時的組蛋白化學修飾變化規律。從以上兩方面的研究出發，進而對潛在EMT關鍵基因進行詳細的生物學功能研究。特異的組蛋白修飾酶可能在EMT調控中扮演關鍵角色。組蛋白H3K27三甲基化酶EZH2在乳腺癌中顯著高表達，并與遠處轉移及較差預后密切相關，提示其在EMT中亦可能扮演關鍵角色。相關課題組之前發現組蛋白H3K4去甲基化酶LSD1在TGF信號通路及乳腺癌轉移中起重要作用。課題將進一步以EZH2及LSD1為研究對象，通過基因組學及質譜分析，研究