1、2022液體活檢在癌癥篩查（全文）癌癥目前已成為我國居民的首要死亡原因,且其發病率和死亡率還在 不斷攀升。據國際癌癥研究機構數據顯示：我國2020年有約457萬 例新發癌癥病例和300萬例癌癥死亡病例，分別占全球新發癌癥病例 的24%和癌癥死亡病例的30%。并且,我國癌癥的整體5年生存率與 美國相比有較大差距（40%比67% ）,主要原因是我國大局部癌癥患 者在確診時已屬中晚期，預后較差。以肺癌為例，低劑量螺旋CT （low-dose computed tomography , LDCT ）的推廣使美國肺癌高 風險人群肺癌死亡率降低了 20% ,全因死亡率降低了 6.7% ;也使我 國高風險人

2、群中肺癌的檢出率提升了 4倍左右（1.5%比0.3% ）。由 此可見，早篩、早診、早治是提高癌癥患者生存率的關鍵。從衛生經濟學的角度來看，癌癥早期發現可帶來經濟效益。廣州市結 直腸癌經濟負擔調查顯示，不同分期結直腸癌患者的醫療費用水平差 異存在統計學意義（A0.001 ）:癌前病變的費用最低，IV期平均費用是I期的2.7倍，癌癥篩查可以提高早期患者比例，降低醫療費用。2020年,國家癌癥中心對結直腸癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、食管癌和胃癌等6種常見癌癥現有篩查方式的衛生經濟性進行了系統評價，結果顯示：以每挽救一個生命年的增量本錢計算，食管癌篩查最為經濟有效，其次分別為結直腸癌、有效，其次分別為結直

3、腸癌、胃癌和乳腺癌。癌細胞在生長、壞死、凋亡的過程中，會釋放一些癌癥信號到體液（包括血液、尿液等）中，通過檢測體液中的癌信號可以早期發現癌癥。但同樣發現其檢出癌前病變的效能缺乏，靈敏度僅為33.3%。相較于 獨立的甲基化位點，基于多靶點甲基化檢測的機器學習模型在多項研 究中展現出更高的靈敏度(83.6%87.9% )和相似的特異度(83.3%91.9% )。其他結直腸癌血液標志物包括血清蛋白與多糖、血清miRNA和cfDNA片段圖譜等，但尚缺乏前瞻性研究驗證。總體 來說，現有液體活檢標志物在進行結直腸癌早篩中已取得較大突破, 但在識別癌前病變方面尚待改善。(三)肝癌、胰腺癌美國國家綜合癌癥網絡

4、(national comprehensive cancer network , NCCN )指南推薦肝癌發病風險升高的人群(如肝硬化、慢性乙肝等) 每6個月進行一次超聲檢查，可同時進行甲胎蛋白(alpha fetoprotein , AFP )檢測。然而超聲檢查在肝癌早期缺乏良好的靈敏度，僅憑AFP 檢測易造成漏診和誤診。傳統血清學檢測還包括甲胎蛋白異質體3與 異常凝血酶原等，但單獨檢測效能缺乏，需三項聯合或結合B超。多項泛癌種研究說明，與其他腫瘤相比，早期肝癌cfDNA釋放入血信 號最強，這使得cfDNA成為早期肝癌篩查潛在的理想選擇。2017年 Xu等篩選出10個甲基化標志物建立肝癌的綜

5、合診斷模型，該模型可 有效區分肝癌和健康人群，靈敏度為83.3% ,特異度為90.5% ,且診 斷早期肝癌效能優于AFP。考慮到區分肝病患者對于肝癌早篩的重要性，Luo等基于cfDNA甲基化標志物建立的模型可有效區分肝癌、肝 硬化和健康人群，靈敏度為83.6%，特異度為96.0% ,有助于實現肝癌高危人群的早預警、早診斷和早治療。5-羥甲基胞口密咤與基因調控 和腫瘤發病機制密切相關，通過將5-羥甲基胞口密碇與末端序列、片段 分布和核小體印跡特征相結合構建的肝癌診斷模型，靈敏度和特異度 分別為95.4%和98.0% ,對于極早期和早期肝癌的篩查靈敏度相比AFP同期提升了 3倍，比異常凝血酶原提高

6、了 70%o除了 cfDNA ,血 清miRNA作為診斷肝臟疾病潛在的生物標志物一直很受關注，Zhou 等篩選出 7 個 miRNA 組合 miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、 miR-26a、miR-27a和miR-801），區分肝癌患者與健康人群的靈敏度到達83.2% ,特異度為93.9% ;基于此結果,團隊自主研發了全球 首個7種微小核糖核酸肝癌檢測試劑盒，并于2017年獲得國家藥 品監督管理局的三類器械注冊證和生產許可證。液體活檢相關的標志 物在肝癌早期篩查展現出了較好的靈敏度和特異度，但目前仍缺乏無 病癥高危人群前瞻性的數據。FDA于2021年4月授予Blu

7、estar Genomics公司無創胰腺癌早篩突 破性醫療器械”認定，該產品通過檢測cfDNA上羥甲基胞口密碇的變化, 用于在新發糖尿病患者中篩查胰腺癌。除cfDNA外，Schultz等發現 聯合不同的循環血miRNA構建檢測模型,靈敏度可達85.0%，特異 度到達64.3%85.4%。此外，循環外泌體在胰腺癌早篩中的潛在作用 已成為另一研究熱點。Yang等鑒定了基于循環外泌體的蛋白標志物譜, 包括 G6?、EpCAM、MUC-1、GPC-1 MV72,檢測胰腺癌的靈 敏度和特異度分別為86.4%和81.0% ,目前此種篩查方法的缺乏在于 缺乏高特異度的鑒別方法將循環外泌體別離。除了血液，胰液

8、和唾液 等其他液體樣本在胰腺癌的早篩中也發揮著重要作用。(四)乳腺癌早期乳腺癌患者血漿cfDNA中可以檢測到存在于組織中的突變。Zhang等基于靶向二代測序技術對乳腺癌患者血漿樣本進行ctDNA 突變檢測，I田期患者的檢出率為69.2%76.7%。當與影像學檢查 結合后，整體靈敏度并未有顯著提升，僅為74.2%。突變作為乳腺癌 早篩標志物結果不夠理想，局部原因可能來自于血液中ctDNA突變豐 度低而導致的檢測受限。而血液中cfDNA甲基化位點豐富，Liu等基 于全基因組亞硫酸鹽測序技術，構建了基于cfDNA甲基化評分的早期 乳腺癌診斷模型，能有效診斷早期乳腺癌，曲線下面積(area under

9、 curve , AUC )為0.81。將模型與影像學檢測結合后，診斷效能得到 進一步提升(AUC = 0.93 )，靈敏度和特異度分別為91.7%和88.0%。 多個miRNA聯合可以進一步提高模型診斷效能，Chan等發現血清 miR-L miR-92a、miR-133a和miR-133b分別具有較高的乳腺癌 診斷效能(AUC = 0.780.87 ),而其中兩項結合建立的乳腺癌診斷模 型AUC可提高到0.900.91。2021年11月，分子腫瘤學機構Datar Cancer Genetics宣布FDA授予其基于血液CTC的檢測產品突破性 醫療器械認定，或可用于乳腺癌早篩。未來，液體活檢多組

10、學如何 整合不同生物標志物的優勢，與目前的標準護理模式結合進一步提升 乳腺癌早篩的效能，值得深入探索。(五)婦科腫瘤高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus , HPV )感染是宮頸 癌最主要的致病因素。國際癌癥研究機構專家認為HPV核酸檢測是其 首選的篩查方式。目前還可基于外周血和尿液等樣本對HPV的信使 RNA或蛋白進行檢測，且對宮頸癌以及子宮頸鱗狀上皮內病變 (cervical intraepithelial neoplasia , CIN )均有一定的檢出率。3351丫檢測試齊1盒是FDA批準的首個用于HPV一線初篩的產品， 檢出CIN3 +的靈敏度達92.0%

11、,高于液基細胞學檢查的53.3%。除了 HPV感染外，宮頸癌的發生還與關鍵基因突變(如PIK3CA、力53和 KRAS需)及甲基化異常密切相關，這些可作為潛在有效的宮頸癌或癌 前病變篩查標志物。約翰霍普金斯大學癌癥中心開發出一項針對卵巢癌和子宮內膜癌的篩 查技術，該技術使用多重聚合酶鏈式反響(polymerase chain reaction , PCR )聯合檢測常規巴氏涂片檢查的宮頸液樣本中18個基 因的突變情況及染色體非整倍數的變異情況，檢出子宮內膜癌和卵巢 癌的靈敏度分別為81%和33% ,特異度約為99%。被檢出的患者中 有78%的子宮內膜癌患者和34%的卵巢癌患者處于癌癥早期。針對

12、突變的卵巢癌高風險人群NCCN指南推薦在適當年齡 進行預防性輸卵管卵巢切除術；針對一般風險人群，尚無任何指南或 專業機構推薦進行卵巢癌常規篩查。有研究說明，采用靶向亞硫酸氫 鹽測序技術構建的3個DNA甲基化血清標志物組合可在臨床診斷前 兩年檢測到卵巢癌，靈敏度和特異度分別為57.9%和88.1% ,篩查早 期卵巢癌靈敏度優于糖類抗原125( carbohydrate antigen ,CA125 ) (57.9%比42.1% )，但特異度較低(88.1%比95.5% )。此外， Kandimalla等發現采用miRNA聯合模型篩查卵巢癌優于單獨使用 CA125 ,并在回顧性(I期患者中AUC=

13、0.96，總AUC = 0.89 )和前 瞻性隊列(AUC = 0.92 )中均得到很好地驗證。值得關注的是，獲FDA 批準的0VA1早篩試劑盒基于CA125在內的5種術前血清標志物構 建了卵巢惡性腫瘤風險評分，以此確定在術前需要轉診至婦科腫瘤專 家的患者，但尚未有指南推薦作為卵巢癌篩查或獨立診斷工具。(六)泌尿系統腫瘤腎細胞癌約占腎癌的80% ,死亡率高，有50%60%的患者在確診前 無明顯病癥，目前臨床上并無有效的篩查手段，因此液體活檢在腎細 胞癌早篩中的探索越來越受到研究者們的關注。Nuzzo等利用cfDNA 甲基化免疫共沉淀測序準確地區分了腎細胞癌患者和無癌對照組 (AUC = 0.9

14、9 )。為了證實cfDNA甲基化免疫共沉淀測序對尿液的作 用，研究者對受試者的尿液cfDNA進行了相同方法的分析，平均AUC 為 0.86。膀胱癌的常見臨床病癥是肉眼血尿,局部患者僅表現為顯微鏡下血尿 及刺激性排尿，臨床上需要進行膀胱鏡及必要的影像學檢查確診。目 前基于尿液和血液的生物標志物可以作為膀胱鏡檢查的有效補充手段。 Chen等基于兩個尿液DNA甲基化位點建立并驗證了區分膀胱癌患者 的模型,靈敏度和特異度分別為90.0%和83.1%0該方法在靈敏度上 同尿液細胞學和熒光原位雜交檢測(fluorescence in situ hybridization ,FISH )方法相比得到大幅提高

15、，特別在早期膀胱癌中， 靈敏度為64.5%，而尿液細胞學和FISH檢測方法僅為11.8%和15.8%O 除了 cfDNA , Shimizu 等發現了 4 個血液 miRNA 位點(miR-137、 miR-124-2. miR-124-3和miR-9-3)可以較好地區分膀胱癌，靈敏 度和特異度分別為82.0%和91.0%。前列腺癌篩查中國專家共識(2021年版)中建議對身體狀況良好， 且預期壽命10年以上的男性開展前列腺特異度抗原(prostate-specific antigen , PSA )篩查。PSA 雖然降低了前列腺 癌的死亡率，但是不能區分良性和低級別的腫瘤，會導致過度診斷。 2

16、015年，Gronberg等利用臨床變量(年齡和前列腺活檢)、血漿蛋 白濃度(PSA、游離PSA、人激肽釋放酶2、陽微精蛋白和生長分化 因子-15 )以及源自單核甘酸多態性的多基因風險評分對前列腺癌進行 篩查，該模型AUC顯著優于單獨使用PSA篩查（0.74比0.56 ）;且 在高危受試者中，該方法比PSA降低了 44%的良性疾病活檢次數以及 32%的總活檢次數，并且不影響前列腺癌的檢出率。另一方面,液體 活檢在前列腺癌篩查中的應用也在不斷嘗試商業化，一種基于尿液外 泌體基因表達的檢測方法開發用于鑒別高級別、低級別和良性前列腺 癌，進一步改善了適用人群高級別前列腺癌的識別效能，減少了不必 要的

17、活檢次數。（七）血液腫瘤血液腫瘤早期預后優于中晚期，如非霍奇金淋巴瘤I期患者5年生存 率約90% ,而IV期患者僅約60% ,同時，Li等發現利用M蛋白篩查 出的骨髓瘤患者預后優于病癥驅動的患者（3年總生存率：76.9%比 46.6% ）,以上均提示血液腫瘤早篩的必要性。2021 年,Gupta 等設計了基于 MYD88、TERT啟動子、IDH 1/2、H3F3A 和8抬尸突變的快速多重基因分型檢測方法，幫助診斷和鑒別診斷原 發性中樞神經系統淋巴瘤和其他神經系統腫瘤，靈敏度為57.6%，特 異度為100%。另外，多項研究發現循環miRNA可作為血液腫瘤診斷 的潛在生物標志物。2020年Ann

18、O/?co/公布了一項基于cfDNA甲基化技術的泛癌種早篩 的研究。在99.3%特異度下，I期淋巴瘤的靈敏度接近60% , H-IV 期均超過75%0在另一項獨立驗證研究中，在99.5%特異度下，漿細 胞腫瘤的靈敏度為72.3%0基于回顧性研究的良好結果，GRAIL公司 進一步啟動了首個基于泛癌種早期檢測的前瞻干預性研究，在準確檢 測出的29例癌癥患者中，有12例為血液腫瘤患者，值得關注的是, I口期淋巴瘤的檢出率更高。針對血液腫瘤早篩技術的探索與開發是目前臨床需要重視的問題，特 別是在淋巴瘤和漿細胞腫瘤中，現有泛癌種的數據提示我們基于 cfDNA甲基化建立早篩模型的可行性，但由于樣本量有限且

19、單癌種需 要進一步考慮靈敏度和特異度的選擇，因此還需要在更多的臨床研究 中獲得驗證。（八）其他癌種EB病毒相關標志物是目前臨床應用最廣泛的鼻咽癌篩查診斷標志物。 一項前瞻性研究利用血漿EB病毒DNA載量對鼻咽癌患者進行監測， 最終發現的I期和口期患者占比達71% ,顯著優于歷史隊列，靈敏度 和特異度分別為97.1%和98.6% , PPV和NPV分另為11.0%和 100.0%。止匕外，多項研究說明EB病毒編碼的miR-BARTs相堇成為 鼻咽癌新的診斷標志物，但仍需大樣本研究驗證，并制定相應的判定 標準。目前，如何更精準地鎖定發病高風險人群提高篩查方法的PPV , 是鼻咽癌二級預防亟待解決的

20、問題。近期，中山大學腫瘤防治中心的 研究團隊提出的鼻咽癌發病風險預測綜合模型聯合現有的EB病毒抗 體篩查，將PPV由原先的4.7%提高至43.2% ,解決了現有篩查方法 效能低而無法在人群大規模應用的瓶頸。睪丸生殖細胞腫瘤篩查常用的血清蛋白標志物AFP、人絨毛膜促性腺 激素和乳酸脫氫酶診斷效能不理想，僅在26%47%的患者中出現升 高，且特異度有限。多項研究說明，基于miRNA的生物標志物，特 別是miR-371a-3p ,檢測效能明顯優于傳統血清蛋白標志物，診斷靈 敏度、特異度和PPV均大于90%。另一項研究同樣說明血漿miR371 表達對于預測活動性生殖細胞惡性腫瘤具有高特異度和高PPV

21、(100% ),檢測效能(AUC=0.97 )優于血清蛋白標志物 (AUC = 0.630.75 )和CT ( AUC = 0.77 ) o因止匕，未來可考慮建立 miRNA技術的國際化標準并引入6/R3ZZ作為生殖細胞腫瘤篩查的分 子標志物。顱內腫瘤確實診主要依賴于侵入性手術獲得的組織標本，非侵入性的 診斷方式可防止不必要的手術風險和患者焦慮。Nassiri等證實了血漿 DNA甲基化信號可以很好地區分腦膠質瘤和其他顱內腫瘤以及健康 受試者(AUC = 0.99 );同時，甲基化分類器在突變型和野生型 腦膠質瘤、低級別以及高級別腦膠質瘤中均展現了出色的診斷效能 (AUC0.98 )。由此可見，

22、液體活檢技術或可作為顱內腫瘤標準診 療流程的補充，輔助診斷可能不需要手術干預或手術風險大于獲益的 人群，以減少侵入性診斷操作帶來的損傷風險。另外，對于需要手術 的腫瘤，術前輔助診斷的信息可幫助優化手術方案及平安性。總之，液體活檢的開展與探索將填補此類惡性程度高且目前沒有推薦 篩查方式癌癥的空白，未來更多大規模前瞻性研究有望提高這類癌癥 的早期篩查效能，進一步改善患者預后、提高生存率。三、液體活檢在多癌種篩查的進展NCCN指南推薦的篩查方式主要針對單癌種，且大局部癌種沒有推薦 的篩查方式，而多癌種篩查更符合民眾需求。以吸煙為例，一位60歲 有吸煙史的女性做四種癌癥篩查（LDCT、腸鏡、乳腺鋁靶、

23、宮頸液基 細胞學涂片）的累計假陽性率可高達43% ,因此，同時做幾個風險因 素相關的單癌種篩查不但會造成較高的累計假陽性率，并且屢次篩查 也會加重經濟負擔。止匕外，現階段早篩技術亟需在高度準確敏感的檢 測和大規模篩查之間取得平衡，相較于單癌種早篩技術，多癌種篩查 技術可以同時檢測多種癌癥，并提供準確的組織溯源結果，以限制評 估無病癥患者的范圍、本錢和復雜性，被認為是下一代癌癥早篩技術 的突破口，受到科學界和產業界的廣泛關注。多癌種研究的技術壁壘更高，理想的多癌種篩查技術需要同時滿足以 下幾個條件：（1 ）高特異度，防止過度診斷和過度治療，減少受檢者 作為體外診斷的重要分支，液體活檢還具有快速便

24、捷且侵入性小等優 點。隨著液體活檢技術的開展，癌癥的早篩、早診也產生了諸多突破 性進展。本文主要就液體活檢在癌癥早篩、早診技術的開展現狀加以 綜述，并對未來癌癥診療新格局進行展望。一、現有癌癥早篩手段的局限性盡管早篩、早診可以顯著提高早期癌癥檢出率，降低癌癥相關死亡率； 但受限于當前檢測技術等諸多因素，目前大局部癌癥沒有推薦的篩查 方法。美國癌癥研究所只推薦對肺癌、結直腸癌、乳腺癌和宮頸癌進 行篩查，獲得推薦的篩查手段也只能做單一癌種篩查，靈敏度和特異 度也不夠理想。而且由于局部篩查方式存在侵入性、操作不便、有輻 射性等問題，導致民眾對于篩查的依從性很低。LDCT是肺癌常規篩查手段，美國肺癌篩

25、查工程數據顯示，LDCT篩查工/口期肺癌的檢出率約70% ,但同時也帶來了較高的假陽性率。腸鏡 檢查是結直腸癌診斷的金標準，腸鏡篩查可以降低56%的結直腸癌發 病風險以及57%的死亡風險；但由于腸鏡操作復雜（需要良好的腸道 準備、完整的盲腸插鏡率和足夠的退鏡時間），以及存在穿孔、出血 等無法忽視的并發癥，導致臨床依從性很低。中國醫學科學院腫瘤醫 院2019年發起的一項研究顯示，在結直腸癌高風險人群中，僅有約 14%人群同意接受腸鏡檢查。乳腺鋁靶（X線）篩查乳腺癌在特異度 不必要的精神焦慮和隨訪負擔；（2 ）高靈敏度，降低漏檢率，減少進 展至晚期的患者人數；（3 ）組織溯源準確性，準確告知腫瘤發

26、生的具 體器官，精準指導后續的臨床檢查方案；（4）高性價比，使篩查的成 本可以控制，便于大范圍推廣使用；（5）侵入性小，便于操作，從而 能夠提高民眾篩查的依從性，易于推廣。液體活檢作為體外診斷的一 個重要手段，具有快速便捷、侵入性小等優點，為多癌種篩查提供了 極具潛力的途徑。腫瘤細胞通過壞死、凋亡、分泌等形式，向外周血釋放cfDNA、miRNA、 外泌體、CTC等信號，隨著測序技術的開展，借助高靈敏度的高通量 測序等技術，可以對血液中的這些腫瘤信號進行捕捉、檢測。而機器 學習技術的引入,進一步提高了腫瘤信號檢測的靈敏度。目前國內外多家研究機構正在開展基于血液液體活檢檢測技術的多癌 種篩查的研究

27、。Liu等開展了一項前瞻性、多中心、病例對照、觀察性 的縱向隨訪研究，循環游離基因組圖譜（circulating cell-free genome atlas , CCGA ）,旨在開發并驗證通過一管血實現多種癌癥 的早期檢測（multi-cancer early detection , MCED ）和組織溯源， CCGA在北美142個醫療中心共招募了 15 254例受試者（8 584例 癌癥受試者，6 670例非癌癥受試者），分為三個子研究CCGA-1.CCGA-2和CCGA-3O其中CCGA-1為原理發現階段，納入分析訓練 集樣本1 785例，驗證集樣本1 015例，同時對三種不同的基因組

28、測序方法進行了全面比擬，結果顯示全基因組重亞硫酸氫鹽測序（whole genome bisulfite sequencing , WGBS ）檢測 cfDNA 甲基化模式的 性能，分別優于全基因組測序檢測拷貝數變異和靶向測序檢測單核苜 酸變異/插入/缺失；在組織溯源上，甲基化優于另外兩種方法學。最 終確定了基于cfDNA甲基化的多癌種篩查技術路線。CCGA-2為試劑 研發和機器學習模型構建、初步驗證階段，納入分析訓練集樣本3 133 例，驗證集樣本1 354例，利用WGBS對血漿cfDNA進行分析，靶 向位點組合涵蓋了超過10萬個信號豐富的甲基化區域。通過機器學習 建立了多癌種篩查模型并進行初

29、步驗證，可以同時檢測50種癌癥， 整體特異度為99.3% ,靈敏度為54.9%，組織溯源準確性為93%。 CCGA-3為大規模的臨床驗證階段，共納入分析4 077個樣本，其中 癌癥患者2 823例，非癌癥人群1 254例，主要目的是對模型進一步 優化后在一個獨立的驗證集中進行驗證，結果發現在超過50種癌癥類 型中檢測到癌癥信號的特異度為99.5%，總體靈敏度為51.5% ,且靈 敏度隨分期升高（IIV期靈敏度分別為16.8%、40.4%. 77.0%和 90.1% ）0組織溯源預測真陽性的總體準確率為88.7%。在12種預先 指定的癌癥（約占美國每年癌癥死亡人數的2/3 ）中Im期的靈敏度 為

30、67.6% ;在腫瘤高危人群5079歲的受試者中，研究團隊預測了該 模型的PPV和NPV分別為44.4%和99.4%0這些結果支持了這種以 血液為基礎的MCED篩查作為現有單癌種篩查的補充的可能性，對整 個行業具有重要參考意義，但CCGA系列研究也具有一定的局限性： 如果在癌癥患者進行活檢后采集血液樣本，與活檢前相比，可能會增加血液中cfDNA的比例；另外CCGA是一項病例對照研究，可能不 能完全反映該試驗在人群篩查條件下的表現。在后續進行的前瞻干預 性研究PATHFINDER中，為了評估該模型的效能，招募了來自美國7 家臨床機構的6 662例2 50歲的受試者,并根據是否有吸煙史、腫瘤 史、

31、腫瘤家族史區分為高風險和一般風險組，進行MCED篩查，研究 中期結果顯示，該模型的PPV為44.6% ,其中高風險組和一般風險組 分別為57.1%和30.0% ,模型預測首發或次發組織來源的準確性為 96.3% ,中位觀測時間到確診為50 d0 PATHFINDER參與者的隨訪將繼續進行，并將確定所有參與者在首次抽血后12個月內的癌癥診斷發 生率，屆時將評估MCED測試的特異度和NPVO與CCGA的發現一 致，在PATHFINDER的中期分析中，MCED測試可以在廣泛的癌癥 類型中檢測到癌癥信號，且具有較高的平安性，這些結果支持了 MCED在臨床實施的可行性。CCGA系列研究主要基于cfDNA

32、甲基化檢測，其他技術類型以及基于液體活檢的多組學研究也在紛紛開展。液體活檢的多組學研究也在紛紛開展。Cristiano等基于cfDNA全基因組片段化譜，開發了一個人工智能平臺DELFI ,用以評估整個基因 組中cfDNA的片段化模式，研究納入6種癌癥類型（乳腺癌、結直腸 癌、肺癌、卵巢癌、胃癌和膽管癌），結果發現該模型識別癌癥患者 的靈敏度為82%，特異度為98%，組織溯源準確性為61% ;止匕外， 研究者將DELFI聯合cfDNA突變做了進一步探索，在特異度98%的 情況下，靈敏度提高到91%0除此之外，Cohen等開發了名為CancerSEEK的血液測試,研究納入1 817例受試者（1 0

33、05例IIH 期癌癥患者；812例健康對照），將cfDNA突變檢測與血清蛋白生物 標志物結合起來，檢測8種癌癥（卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食 管癌、結直腸癌、肺癌和乳腺癌）的整體特異度99%,整體靈敏度為 70% , I期靈敏度為43% ,組織溯源的準確性為63% ;鑒于驅動基因 突變通常不是組織特異的，絕大多數組織來源的信息來自血清蛋白標 志物。該團隊還曾開展過一項研究DETECT-A ,這是全球首個萬人泛 癌早篩干預性前瞻性臨床試驗，研究對象為10 006例未發現癌癥的女 性，年齡6575歲，評估基線檢測cfDNA突變（16個基因）與蛋白 標志物（9個）聯合PET-CT成像檢測用于癌癥篩

34、查的平安性和可行性； 結果顯示隨訪12個月，總計發現96例癌癥患者，血液檢測聯合含 PET-CT在內的影像學檢查發現26例癌癥患者，特異度為99.6% ,靈 敏度為27.1% , PPV為40.6% , NPV為99.3%0這一結果提示在無癥 狀人群中進行血液檢測是可行的，可以作為常規癌癥篩查手段的有效 補充。但與CCGA的甲基化泛癌檢測效能相比，突變聯合蛋白的檢測 結果就稍遜一籌。考慮到不同種族間存在甲基化特征差異，在中國人群中，cfDNA的甲 基化檢測能否應用于泛癌種的早期檢出以及組織溯源的準確性還需要 進一步的臨床研究驗證。因此，在中國大規模群體中開展基于液體活 檢多組學的前瞻性、多中心

35、的多癌種篩查研究意義重大。基于單鏈建 庫技術的cfDNA甲基化檢測技術平臺ELSA-seq ,不僅可實現超低量DNA的穩定建庫，并通過專利算法進行信息學多重降噪，通過機器學 習精準捕捉腫瘤信號，在同一組樣本中，比代表液體活檢最高靈敏度 的二代測序（next-generation sequencing , NGS ）和微滴式數字 PCR,靈敏度高出10倍以上。基于ELSA-seq甲基化檢測平臺，復旦 大學附屬中山醫院開展了一項針對6癌種早篩的病例對照研究 THUNDER ,評估了基于cfDNA甲基化測序技術在多癌種篩查中的應 用；該研究納入1 108例受試者（625例癌癥受試者和483例非癌癥受

36、試者），檢測了國內6種高發癌癥（肺癌、食管癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌和結直腸癌）驗證集模型的特異度為98.3%，靈敏度為80.6% ,組織溯源的準確性為82%O這項6癌種早篩研究，初步證實cfDNA甲基化檢測在中國人群中作為泛癌種早篩的可行性（圖4）。技術類別及趣癌腫模型效能循環腫fB* 外邇體-微小RM 宏白標名物 仍不髀DM癌癥槍泅機學習、ffliRM*CCCA3靈敏度：51. M）,7. ceNA甲苗化序技木特B度：W.S%rKf 50粗稅測源準性：88.0*1口 .CancerSEEKcfDNA突交量白及生瞥具度：7O 標志物雄測技術特異度：99%4巢礁、葉H口等、 位稅冽源準確性：63

37、、*,站直JK癌、肺癌網乳腺再THUNDE8efDNA甲露化制序技術 靈敏度：8a 6% 卡罐.*#.特異度：98.3*貨艙有、H齦/和；fl蛆快測源日性：82%DEIFIcfDNA片段槍費技術乳嬸癌.卵累癌.W靈敏度：82依罪度：98蛆蝸測源準性：61、DETECT A艮敏度：27.1、必卜 cfDM突受十蛋白項特異度：99. 6.紀魁娘句陽W值”影像學椅謝技術陰性懵謝值：99.31見PATHF1XDER cfDNA甲基化費序技術陽性filH值：44.6M (kRita： 97.lt;VR 30.0) 組步測源準性:85.at；注:cfDNA 為細胞游離 DNA ; CCGA3、Cancer

38、SEEK. THUNDER、DELIFI x DETECT-A. PATHFINDER均為多癌種研究名稱圖4液體活檢在多癌種篩查的進展、液體活檢的局限性和開展展望隨著各界對癌癥早篩的關注逐漸升溫，基于液體活檢的癌癥早篩相關 技術的開發也取得了一定程度上的突破，不但使得一管血進行癌癥精 準早篩成為可能，而且使得一管血同時進行多癌種篩查成為可能。但 是，目前液體活檢所面臨的挑戰也不容忽視：（1）靈敏度、特異度等 癌癥早篩關鍵技術指標仍有待提升。ctDNA是壞死或凋亡的腫瘤細胞 釋放到外周血中的腫瘤DNA片段，但是由于在癌癥早期，腫瘤ctDNA 在血液中含量非常低，如何通過液體活檢技術捕捉血液中含量

39、極低的 腫瘤信號成為技術開發的關鍵，針對本文提及的癌癥早篩受到早期腫 瘤信號相對較低限制的問題，目前認為通過超高深度的測序可以提高 不同癌癥類型檢測的靈敏度，通過該方法檢測限（limit of detection , LOD ）可低至0.001%。止匕外，通過選擇測序ctDNA片段的大小和基 于單鏈建庫也是提高ctDNA檢測靈敏度的有效方法。（2 ）不同癌種 早篩產品的核心評估指標應有所側重。靈敏度和特異度是評估癌癥早 篩產品性能最重要的核心指標，靈敏度和特異度此消彼長，難以同時 滿足較高的水平。同時，不同類型腫瘤血液中ctDNA的濃度也有所不 同，例如，肝癌、膽管癌、食管癌和卵巢癌釋放入血的

40、ctDNA信號較 多，而前列腺癌和乳腺癌那么可能釋放入血信號較少，這就導致針對不 同癌種的早篩技術的靈敏度也應該有所不同。因此，需要在開發癌癥 早篩產品時同步考慮不同癌種的血液ctDNA濃度、惰性或侵襲程度和 后續臨床診斷路徑，從而對靈敏度和特異度這兩個指標進行綜合評估, 有所側重，尋找最正確平衡點。例如對于后續有低傷害性臨床確診路徑 的癌種，提升靈敏度更為重要，為此可以容忍低特異度,目的是盡量 減少漏診；而對于后續沒有成熟的臨床確診路徑且相對惰性的癌種， 那么需要保證較高的特異度，為此可以容忍低靈敏度，目的是盡量減少 誤診。（3 ）泛癌種早篩模型需要靈活的針對泛癌種和單癌種的混合模 型。目前

41、，癌癥早篩產品既包括針對特定潛在高危人群的單癌種早篩 產品，也包括針對一般風險人群的泛癌種早篩產品，但是泛癌種早篩 的應用場景實際上包括單癌種早篩的應用場景，這就需要在泛癌種模 型開發時同時兼顧適合泛癌種和單癌種的混合模型，從而滿足那些擁 有遺傳性腫瘤基因突變的人群或者有某種癌癥家族史的人群想做單癌 種篩查的需求，也在一定程度上解決了短期內泛癌種產品只針對高端 消費人群的限制。（4 ）目前早篩產品的價格仍然較高，普通群眾難以 承受。這在一定程度上壓制了民眾做癌癥早篩的需求，限制了癌癥早 篩在中國的普及。因此，如何控制本錢和促進醫保的逐漸覆蓋是降低 癌癥早篩單次檢測價格的重要因素，也是未來亟待解

42、決的問題，隨著 技術的開展，測序本錢的降低，預計在不久的未來，早篩產品價格將 顯著減低，使廣大民眾能夠接受。（5 ）普通人群以及臨床醫生對癌癥 早篩的必要性以及目前癌癥早篩產品都了解缺乏，這極大限制了癌癥 早篩產品的市場推廣。有必要借助各媒體渠道，通過宣傳更多腫瘤早 篩的成功案例來提高民眾對腫瘤早篩的認知和了解，從而提高民眾做 癌癥早篩的意識和接受度；另外還需通過學術會議推廣等形式推動將 腫瘤早篩產品納入指南等途徑來提高臨床醫生對腫瘤早篩產品的認可 度。但是長期來看，隨著基于基因組、轉錄組、表觀遺傳組、蛋白組等多 組學的“下一代聯合型液體活檢技術的成熟，cfDNA甲基化聯合 ctDNA突變、m

43、iRNA表達和血清腫瘤標志物或可使靈敏度和特異度 等癌癥早篩關鍵技術性能指標得到極大提高，從而降低漏診和誤診的 概率；由于不同組織具有獨特的DNA甲基化模式，器官特異性強，因 此基于甲基化可以進行癌癥的組織溯源，進而為下一步的針對性的臨 床檢查指明方向。同時，隨著測序本錢的不斷下降和醫保的逐漸覆蓋， 有望降低癌癥早篩的單次檢測價格；止匕外，通過政府、企業、媒體等 多方持續的市場教育，癌癥早篩理念在普通群眾中會逐漸得到廣泛普 及。相信不久的將來，癌癥早篩技術將會改變中國腫瘤診療的格局，癌癥 早篩特別是泛癌種早篩可以幫助醫院和醫生在早期發現更多的患者； 基于泛癌種早篩的結果，患者可以被精確導流至各

44、個首診科室進行下 一步精確檢查，同時還可以接受多學科團隊的協同診療。在診療過程 中，還可以通過NGS伴隨診斷對患者進行精準治療、精準復發監測， 或精準靶向到新藥的臨床研究中，使患者接受全面而先進的診療,以 獲得最大的生存質量。在這個新的格局下，醫院或者醫聯體機構成功 打造了患者診療全流程的閉環，使各個學科充分整合，極大改善腫瘤 患者的預后。在這個閉環中，泛癌種早期篩查是源頭和突破口，對促 進我國癌癥的早診早治、提高患者生存率、降低死亡率，減輕社會負 擔等，都具有重要的臨床意義和社會價值。96%時,靈敏度可到達80%。乳腺鋁靶聯合乳腺超聲篩查可到達96.2% 的靈敏度和92.6%的特異度。我國乳

45、腺癌易感人群接受X線篩查的比 例約為50% ,而在歐盟國家，篩查率約為95% ,顯著高于我國。中國 乳腺癌篩查指南推薦的乳腺B超篩查，我國3569歲女性的篩查率僅 為22.5%0止匕外，每年接受乳腺X線篩查可能存在誘發惡性腫瘤的風 險，據估計，一生中乳腺X線輻射誘發惡性腫瘤導致的女性死亡率為 16/10萬。宮頸液基細胞學涂片篩查宮頸癌的性能優于巴氏涂片，但 靈敏度依然較低，在特異度96.3%時，靈敏度僅為53.0%。相比單癌種特殊的篩查手段,血清腫瘤標志物篩查是另一種廣泛用于 單癌種或多癌種篩查的手段。有文獻報道癌胚抗原(carcinoembryonic antigen ,CEA 在結腸癌中的

46、靈敏度為 40.5% , 特異度為95.4% ;在胃癌中的靈敏度為19.8% ,特異度為95%0但 CEA在肺癌、乳腺癌等腫瘤以及一些良性疾病中也有高表達。糖類抗 原 19.9 ( carbohydrate antigen 19.9 , CA19.9 )在中國胃癌人群中 靈敏度為10.3% ,特異度為95% ;在胰腺癌中靈敏度為64% ,特異度 為99%其他如肝、肺部以及婦科等良性疾病中也可見CA19.9升高。 綜上可見,血清腫瘤標志物靈敏度及特異度均不高，常常在腫瘤進展 到一定階段才發生指標升高，且在局部良性病變中也同樣會發現相似 的變化，通過血清腫瘤標志物的單獨升高無法提示腫瘤來源，因此無

47、 法作為臨床常規篩查手段推廣(圖1)。呦心血清腫瘤部位標志物Pro-SFTPBCYFRA21-1肺 A CEACA125CEACA15.3AFP肝AFP-UPIVKA 川CA125HE4卵巢CA72.4CA15.3f INMP22膀胱75 BTA靈敏度 (%)11222122273816253737603777816756316964特異度廠 1 n部位膽囊胃J KF血清腫瘤 標志物一CA199CEACEACA19.9CA724CA19.9CA125CEACA199PSAAFP即HCGLDH靈敏度乞 6)。5079201029643241361001418353728特異庾 (%)937995

48、95959998959391:9092829595 、95957777/41iJrJ.L.腆腺Dfc/結直腸fp V-前列朦f_41一 察丸66靈敏度(%)注：Pro-SFTPB為前外表活性蛋白B ; CYFRA21-1為細胞角蛋白19可溶性片段；CEA為癌胚抗原；CA為糖類抗原；AFP為甲胎蛋白； APF-L3為甲胎蛋白異質體3 ; PIVKA-口為異常凝血酶原；HE4為人 附睪蛋白4 ;NMP22為尿核基質蛋白22 ;BTA為膀胱腫瘤相關抗原； PSA為前列腺特異抗原；0-HCG為人絨毛膜促性腺激素；LDH為乳 酸脫氫酶圖1不同人體部位血清腫瘤標志物的靈敏度和特異度總之，現有的癌癥篩查手段

49、比擬匱乏，依賴于軟件及硬件的支持，對 廣大基層醫療衛生機構的醫療資源和技術水平要求較高，民眾接受度 較低，花費較大，收益較小。基于以上國情，研發和推廣具有更高效 率、更高性能以及更經濟的腫瘤早期篩查技術對我國的腫瘤防治工作 具有重要意義。二、液體活檢在不同癌種中的篩查進展近年來涌現出許多癌癥早篩、早診的方法，可以提前檢出或者幫助鑒 別診斷良惡性腫瘤。液體活檢作為體外診斷的重要分支，具有快速便 捷且侵入性小等優點。常見的生物標志物包括循環腫瘤細胞(circulating tumor cell ,CTC )、循環腫瘤 DNA( circulating tumor DNA , ctDNA )、細胞游

50、離 DNA ( cell-free DNA , cfDNA )、夕卜泌 體和循環腫瘤RNA等。ctDNA是基于對腫瘤相關驅動基因變異的檢 測，因而利用其進行腫瘤篩查可能具有較好的特異度；但由于早期腫 瘤患者突變負荷低，目前的檢測技術難以檢測到濃度極低的ctDNA含 量，因此ctDNA的檢測多用于局部晚期或遠處轉移的腫瘤。ctDNA某些區域的異常甲基化也可作為早期篩查的生物標志物。基因啟動子 區域的甲基化改變在癌癥發生的早期階段就會出現，甚至早于基因突 變出現之前。在早期癌癥中，相關的特異性甲基化位點眾多，其改變有數量級上的優勢。除了 DNA，外周血中包含多種RNA ,其中微小RNA ( mic

51、roRNA , miRNA )在細胞生長、發育及疾病開展中起著d分重要的作用，血清中miRNA在腫瘤中會呈現特異表達，但是單個miRNA作為生物標志物的預測效能缺乏,因此基于循環miRNA和外 泌體miRNA進行多個標志物的建模以及標準化miRNA的別離和定量和用于數據分析的方法是目前探索的主要方向（圖2）。下文將主要 就液體活檢在常見惡性腫瘤早期篩查取得的重要突破研究分別進行闡 述（圖3）。注：cfDNA為細胞游離DNA圖2液體活檢與常規檢查在腫瘤篩查的區別 注：cfDNA為細胞游離DNA ; AUC為曲線下面積；EBV DNA為EB 病毒DNA ; PPV為陽性預測值；NPV為陰性預測值；

52、ctDNA為循環 腫瘤DNA ; miRNA為微小RNA ;圖中斜體代表各類生物標志物名稱 圖3液體活檢在單癌種篩查的進展 cfDNA甲基化：夾受/野生AUC 0.99EBV DNA：靈敏度97. 1%,特異度98. 6%, PPV11.0%. NPV 100.0% ctDNA突變：靈敏度74. 2%,特異度92.0% cfDNA甲基化：AUC 0.81 iR-92a聯合iR-133a： AUC 0.91食管 cfDNA甲基化：靈敏度74. %,特異度95. 9%ctDNA突變：IID期靈敏度41.0%67.0%, 特異度98.0%cfDNA甲基化：IAHI期靈敏度51. 681. 4%, 特

53、異度95. 8%cfDNA片段圖譜：靈敏度90.0%,特異度80.0%6個腫痛自身抗體組合：III期靈敏度92. 2%, 特異度85. 7%, PPV 59. 4%, NPV 97.5%7個miRNA組合：靈敏度83.2,特異度93. 9% cfDNA甲基化：靈敏度83. 6%,特異度96.0%10個甲基化標志物蛆合：靈敏度83. 3%,特異度90.5%5羥甲基胞噎喔/末端序列/片段分布/核小體印 跡：靈敏度95.4樂 特異度98.0%SEPT9甲基化位點：靈敏度48. 2%,特異度91. 5% cgl0673s33甲基化位點：具敏度89. 7%,特異度86.8%多犯點甲基化；靈敏度83. 6

54、%87.特異度83. 391. 9%290：靈敏度70. 1、，特異度91. 2%cfDNA片段圖譜：靈敏度97. 4、，特異度94. 8%2個甲基化標志物（尿液）：靈敏度90.0%，特異度83. 1、4個說!?獨組合：靈敏度82.0X,特異度91.0%8個miRNAtS合：AUC 0. 923個甲基化標志物組合：靈敏度57.9%,特異度88. 1% cfDNA 5-羥甲基胞啜唳：AUC 0.920.94多個uiRNAlfl合：靈敏度85.0,特異度64. 3%85. 4%5個外泌體蛋白蛆合：靈敏度86.4%,特異度81.0% 12個111獨組合：靈敏度87.0,特異度68. 4樂PPV6. 6%, NPV 99. 5%產.cfDNA甲基化，而液AUC 0.99.尿液AUC 0. 86外泌體（尿液）.靈敏度91. 9%,特異度34.0事丸iR-371a-3p：靈敏度90.1樂 特異度94.0(一)肺癌cfDNA可以在突變、甲基化和片段化三個層面為肺癌早期篩查提供信 息。有研究說明利用cfDNA突變特征區