1、關(guān)于生物催化與生物轉(zhuǎn)化第一張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第一章 概論一 微生物的多樣性和微生物資源的開拓1 微生物的生境： 指微生物在自然界中存在的場所，包括土壤、水域、動物、植物、極端環(huán)境、特殊環(huán)境和大氣2 多樣性的廣度人們在實驗室所設(shè)計的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件還不能重復生境中的條件3 原核生物是未曾觀察到的多數(shù) 分布、數(shù)目和組分：原核生物的數(shù)目估計為（4-6）1030個細胞，含碳量是植物含碳量的60%-100%4 活的但不能夠培養(yǎng)的微生物長時期低溫保存在無營養(yǎng)料的鹽水中的霍亂弧菌和大腸桿菌第二張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月5 已知的菌種來源和菌種保藏中心二 改進培

2、養(yǎng)方法和尋找新類型微生物及其產(chǎn)物1 新類型微生物的分離取樣預(yù)處理選擇性培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)例如；抗生素生產(chǎn)菌的發(fā)展趨勢放線菌 細菌 霉菌 真菌 極端環(huán)境和特殊環(huán)境中的微生物 藻類2 富集培養(yǎng)樣品富集培養(yǎng)活的菌株純化菌株分離菌種第三張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月所需菌種產(chǎn)品3 代謝產(chǎn)物的篩選（1）篩選的要求；建立專一性的模型，操作簡便，能進行高通量篩選（2）篩選方法抑制細菌細胞壁的合成：內(nèi)酰胺酶抑制劑；以細胞壁模擬三肽逆轉(zhuǎn)糖肽抗生素，從而篩選新的抗生素抑制真菌的抗生素：根據(jù)真菌細胞壁合成篩選抑制劑根據(jù)代謝途徑的有無而設(shè)計篩選方法殺蟲、殺螨、殺球孢蟲抗生素除草劑：以枯草桿菌為模型，在合

3、成培養(yǎng)基中菌的生長受到抑制，但在谷氨酰胺存在時不受抑制第四張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月酶抑制劑和生理活性物質(zhì)血管緊張肽原血管緊張肽I血管緊張肽酶原血管緊張肽II血管緊張肽受體血管收縮第五張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月治療愛滋?。汉Y選抑制愛滋病毒復制的HIV核糖核酸酶抑制劑腫瘤篩選的兩種模型：以DNA拓撲異構(gòu)酶為靶酶的模型；DNA損傷修復系統(tǒng)中的抑制劑模型二 生境中微生物基因組DNA的開拓1 從土壤和水樣提取DNA及多樣性研究 16SrRNA序列分析得到的系統(tǒng)進化樹從生境中取樣：能代表自然環(huán)境中的多樣性微生物2 土壤微生物DNA的文庫構(gòu)建步驟土壤偏基因組DNAB

4、AC載體轉(zhuǎn)化E.coli第六張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月注意事項：（1）偏基因組文庫：土壤微生物群體的基因組（2）系統(tǒng)進化樹的比較分析：基因水平和氨基酸水平（3）從文庫中篩選生物活性物質(zhì)（4）組合生物合成（5）聚酮體化合物第七張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第二章 微生物工程的發(fā)展與趨向一 微生物工程發(fā)展的幾個里程碑抗生素工業(yè)生產(chǎn)帶動了生化工程的建立 大罐無菌深層發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化的興起 可的松類激素的合成（黑根霉）微生物發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸 谷氨酸、賴氨酸固定化技術(shù) 補充：固定化酶和固定化細胞的差異蛋白酶抑制劑和其他酶抑制劑 50多種具有專一性和特殊結(jié)構(gòu)的蛋白酶、多肽酶等

5、抑制劑第八張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月基因工程技術(shù) 大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、面包酵母、畢赤酵母、漢遜酵母菌、黑曲霉、乳酸菌二 微生物代謝產(chǎn)物的類型初級代謝產(chǎn)物：氨基酸、核苷酸、維生素、有機酸、脂肪酸、乙醇次級代謝產(chǎn)物：抗生素、毒素、胞外多糖、植物堿轉(zhuǎn)化產(chǎn)物：甾體、烷烴、芳烴、雜環(huán)化合物三 微生物工程面臨的形勢微生物工程與化學合成工業(yè)的競爭第九張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月農(nóng)業(yè)生物工程對微生物工程與化學工業(yè)的沖擊第十張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月四 微生物工程的發(fā)展方向提高現(xiàn)有微生物發(fā)酵工業(yè)水平（1）抗性菌株的選育（2）前體的應(yīng)用（3）增加合成操

6、縱子拷貝（4）關(guān)鍵基因的過量表達利用重組DNA技術(shù) 內(nèi)酰胺類抗生素、蝦青素、孕烯醇酮和孕甾酮開拓極端酶 古細菌的菌種中存在新的代謝途徑，可能產(chǎn)生具有新的活力和用途的酶。第十一張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第十二張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第十三張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第十四張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第十五張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第十六張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第2章 生物轉(zhuǎn)化操作與轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型一、生物轉(zhuǎn)化的一般操作1 生物轉(zhuǎn)化的催化劑生長中的菌體休止菌體酶固定化酶固定化菌體2

7、生物轉(zhuǎn)化的特點反應(yīng)專一性區(qū)域?qū)Ｒ恍缘谑邚垼琍PT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月立體專一性 3 操作步驟4 矛盾的解決 誘導酶 基因工程菌二 生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的類型甾體的生物轉(zhuǎn)化 第一個應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的生物轉(zhuǎn)化第十八張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第十九張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月紫蘿酮的羥基化：光學活性2-羥基胡蘿卜素合成的起始原料第二十張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月烷烴的雙端氧化：通過突變，可使氧化受阻，獲得烷烴的雙端 氧化氧化脫氨：轉(zhuǎn)化頭孢菌素C為7-氨基頭孢烷酸所依據(jù)的反應(yīng)，包括D-氨基酸氧化脫氨，所產(chǎn)生的酮基中間產(chǎn)物，再經(jīng)細菌酰化酶的

8、作用，最后產(chǎn)生7-ACA。環(huán)氧化反應(yīng)第二十一張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月C-C鍵的脫氫：多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)第二十二張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月碳鏈氧化降解：降解甾體物質(zhì)側(cè)鏈的一個重要反應(yīng)，可用于制備天然芳香物質(zhì)。第二十三張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月碳雙鍵加水反應(yīng)（1）采用固定化的Aspergillus wentii中丁烯二酸酶催化反丁烯二酸產(chǎn)生蘋果酸，產(chǎn)量達237g/L, 轉(zhuǎn)化率為82%。（2）采用Rhizobium催化立體專一性加水反應(yīng)生產(chǎn)治療心臟病藥物L-肉堿，產(chǎn)量達300g/L, 轉(zhuǎn)化率為95%第二十四張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作

9、于2022年6月碳雙鍵加氨第二十五張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月腈水化酶脫氨用?；傅诙鶑?，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月生物轉(zhuǎn)化茚為1,2羥基茚：AIDS蛋白酶抑制劑的半合成部分結(jié)構(gòu)第二十七張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十八張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 第三章 膽固醇合成抑制藥物的生物轉(zhuǎn)化一 膽固醇合成抑制劑的作用機制1 膽固醇生物合成途徑第二十九張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2 常見的膽固醇合成抑制劑HMG-CoA還原酶抑制劑：洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀對還原酶有競爭性抑制作用第三十張，PPT共一百二十

10、九頁，創(chuàng)作于2022年6月二 4種膽固醇合成抑制劑的合成途徑第三十一張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月三 美伐他汀生物轉(zhuǎn)化為普伐他汀Hosobuchi等采用S.carbophilus SANK6285轉(zhuǎn)化美伐他汀存在底物的誘導（羥基化活力）和抑制作用。Matsuoka等觀察到美伐他汀轉(zhuǎn)化為普伐他汀是由細胞色素P450催化。四 用Actinomadura SP. 進行轉(zhuǎn)化第三十二張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月五 辛伐他汀的生物轉(zhuǎn)化高濃度抑制產(chǎn)物形成營養(yǎng)養(yǎng)料第三十三張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第四章 內(nèi)酰胺抗生素母核的生物轉(zhuǎn)化1 6-APA的生成 大部

11、分的半合成青霉素由6-APA合成，后者主要由酶法或化學法降解青霉素而來。第三十四張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 化學法和酶法相比，酶法更具有優(yōu)越性，使用的酶為青霉素酰化酶，又稱青霉素酰胺酶，按照優(yōu)先水解青霉素的能力又分為：青霉素G?；?，青霉素V?；负桶逼S青霉素酶。（A）產(chǎn)生菌及其培養(yǎng)和性質(zhì)PGA最常用于工業(yè)化生產(chǎn)的是大腸桿菌、巨大芽孢桿菌、淡紫灰鏈霉菌、無色桿菌、游動放線菌、產(chǎn)黑假單孢菌和產(chǎn)黃青霉菌。廣泛應(yīng)用的大腸桿菌一般培養(yǎng)基含營養(yǎng)肉湯、玉米浸出液、胨、葡萄糖和苯乙酸。PGA的底物專一性非常寬。PVA主要由曲霉和Epidermophyton interdigitale產(chǎn)生

12、，屬于胞內(nèi)酶氨芐青霉素?；钢饕杉賳捂呔鷮偕a(chǎn)（B）育種與基因工程多年來主要靠傳統(tǒng)誘變技術(shù)處理。基因工程菌株的構(gòu)建是通過改變調(diào)節(jié)區(qū)域的堿基、SD與ATG之間的距離提高PGA的表達水平，PGA的表達是溫度敏感型的，受葡萄糖阻遏和苯乙第三十五張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月酸誘導，受細胞生長速度的影響。（C）PGA和PVA基因的表達和翻譯加工底物青霉素G的疏水側(cè)鏈結(jié)合位點是A亞基的Met168區(qū)域；催化位點在B亞基的Ser290。第三十六張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2 青霉素?；傅募兓盁岱€(wěn)定性第三十七張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3 青霉素?；?/p>

13、酶的固定化固定化可維持高活力和專一性，控制污染，還可長期使用。第三十八張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月5 日本旭化成公司固定化酰化法生產(chǎn)6-APA巨大芽孢桿菌B-400的該酶能水解青霉素G苯乙酰7-ADCA、阿莫西林Cephalexin、Cephalothin，但不能水解青霉素V。固定化的方法菌株肉湯培養(yǎng)基中36度培養(yǎng)30-40小時用醋酸調(diào)pH6.0Celite No560吸附硫酸氨沉淀Sephadex凝膠脫鹽固定于胺化多孔聚丙烯腈第三十九張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十一張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于20

14、22年6月6 固定化菌體用于APA的生產(chǎn)菌種改良和培養(yǎng)條件優(yōu)化細胞固定化技術(shù)：多種固定化材料進行比較以殼聚糖最好。運轉(zhuǎn)的穩(wěn)定性：采用分批攪拌反應(yīng)器固定化基因工程菌株7 國內(nèi)青霉素G?；干a(chǎn)6-APA的工藝和設(shè)備利用固定化基因工程改造的大腸桿菌轉(zhuǎn)化青霉素G：活力仍需誘導，受葡萄糖阻遏，對溫度敏感利用巨大芽孢桿菌的固定化酶進行轉(zhuǎn)化：采用對流控制的模式操作，縮短了反映器內(nèi)的裂解反應(yīng)時間，采用聚砜中空纖維膜和平板膜第四十二張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十三張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月二 7-氨基脫乙酰氧基頭孢烷酸（7-ADCA）和7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）的

15、生產(chǎn)1 、7-ACA和7-ADCA是半合成頭孢菌素的母核，前者由青霉素G和青霉素V經(jīng)青霉素?；该撊?cè)鏈而來，后者由7-苯乙酰胺脫乙酰氧基頭孢烷酸或7-苯氧乙酰胺脫乙酰氧基頭孢烷酸脫區(qū)側(cè)鏈而來。2、固定化青霉素?；干a(chǎn)7-ADCA第四十四張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3、直接發(fā)酵生產(chǎn)7-ADCA第四十五張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月荷蘭的Gist-Brocades公司在1994年申請了兩項專利，提供生產(chǎn)7-ACDA的方法第四十六張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月三 酶法轉(zhuǎn)化頭孢菌素C為7-ACA半合成抗生素是一類高效、廣譜抗生素，內(nèi)酰胺類抗生素的銷

16、售值占抗生素總量的78.3%,其中頭孢霉素又占了70%,年消耗量早1600-2000噸之間.頭孢菌素類抗生素的前體為7-ACA.我國生產(chǎn)的第一個品種頭孢噻吩后,先后研制了11各品種,實際生產(chǎn)品種僅有8種,但處于產(chǎn)量小、品種少、70%依賴進口的狀態(tài)。半合成頭孢菌素抗生素的母核7-ACA的生產(chǎn)是發(fā)展這類抗生素的主要原料，其起始合成的物質(zhì)為頭孢菌素C第四十七張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月化學裂解法：主要方法，工藝成熟，7-ACA的收率在80%以上，但所使用的劇毒化學品、超低溫等條件，必然提高能耗和設(shè)備要求一步法轉(zhuǎn)化CPC生成7-ACA的研制一步裂解法需要CPC酰化酶，多數(shù)產(chǎn)生菌從土壤

17、中分離，但是活力均比較低。許多人試圖通過對野生型的CPC酰化酶進行蛋白質(zhì)工程改造來提高它對CPC的酶解活力，同時增加它的表達量。例如使CPC酰化酶第269位的甲硫氨酸變?yōu)槔野彼幔?05位的半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸，可使活力提高60%且表達量升高2-3倍對CPC?；高M行純化和固定化兩步法轉(zhuǎn)化CPC生成7-ACA的研制D-氨基酸氧化酶脫氨、脫羧；GL-7-ACA?；该撊ノ於；谒氖藦垼琍PT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十九張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）DAO的存在，固定化及副反應(yīng)微生物來源的DAO與FAD結(jié)合比較牢固，在工業(yè)上有良好的應(yīng)用前景。DAO易失活，細胞

18、內(nèi)的穩(wěn)定性較高，經(jīng)透性化處理的三角酵母細胞通過戊二醛和殼多糖相連，可以用于轉(zhuǎn)化。采用多孔性的樹脂固定化純化的DAO酶表觀活力很高。副反應(yīng)的干擾第五十張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月DAO基因的克隆，不同表達系統(tǒng)的表達和在CPC轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用第五十一張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月GA宿主菌的改造和發(fā)酵條件的優(yōu)化大多數(shù)產(chǎn)生GA的野生型假單孢菌屬于G-，產(chǎn)酶高峰一般出現(xiàn)在對數(shù)生長末期，屬胞內(nèi)酶。野生型產(chǎn)生菌活力較低，可經(jīng)誘變、篩選獲得高產(chǎn)和組成型菌株。第五十二張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月GA基因工程菌發(fā)酵條件優(yōu)化（1）溫度（2）補料：流加補糖；定時補充低

19、濃度的葡萄糖（3）調(diào)節(jié)pH和通氣量（4）高密度發(fā)酵DAO與GA產(chǎn)生菌細胞對CPC實行共轉(zhuǎn)化DAO產(chǎn)生菌與GA工程菌的細胞共固定對CPC實行共轉(zhuǎn)化DAO與GA兩酶共固定化對CPC實行共轉(zhuǎn)化兩酶基因在同一宿主中克隆、表達并對CPC實行共轉(zhuǎn)化第五十三張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十四張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月直接發(fā)酵生產(chǎn)7-ACA的基因工程菌的構(gòu)建努力構(gòu)建產(chǎn)黃頂孢霉或產(chǎn)黃青霉基因工程菌直接發(fā)酵生產(chǎn)7-ACA提高關(guān)鍵酶的基因劑量，增加合成CPC的產(chǎn)量。Conder等人的方法第五十五張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十六張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)

20、作于2022年6月7-ACA合成的關(guān)鍵技術(shù)通過透性化、pH和加熱等細胞預(yù)處理方法提高了三角酵母DAO的表觀活力，并消除了過氧化氫酶、酯酶等雜酶的干擾。通過宿主菌染色體上的ampC基因鈍化而克服了內(nèi)酰胺酶的破壞作用。成功解決了CPC發(fā)酵提煉精制液直接用于酶促轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵問題在線控制與檢測第五十七張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第五章 長鏈二元酸的生物轉(zhuǎn)化正構(gòu)烷烴發(fā)酵生產(chǎn)單一長鏈二元酸合成麝香類物質(zhì)單一長鏈二元酸是高級麝香型香料、醫(yī)藥、合成纖維、工程塑料的中間體原料?；瘜W合成具備一定的困難，1972和1978年日本科學家報道采用陰溝假絲酵母合成二元酸，16碳二元酸最高得率為54g/L.

21、我國采用熱帶假絲酵母誘發(fā)多倍體突變株，其中休止細胞轉(zhuǎn)化最高產(chǎn)量可達109 g/L。以單一長鏈二元酸作為中間原料，經(jīng)2-4步化學反應(yīng)可合成各種類型名貴的麝香型香料和藥品。要研制單一長鏈二元酸，國內(nèi)外無現(xiàn)存原料、菌種和工藝，需要解決的問題主要有：單一正構(gòu)烷烴的分離篩選對各種長度碳鏈都有氧化能力的菌種尋找適合工業(yè)化生產(chǎn)、得率高的發(fā)酵條件和轉(zhuǎn)化條件第五十八張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月單一二元酸合成麝香型香料藥物的反應(yīng)路線正構(gòu)烷烴的蒸餾用單管精餾塔對錦西石油六廠出品的12-18碳的混合油為原料進行精餾，收集各種單一純烷烴，純度在95%以上，回收率在80%左右。單一長鏈二元酸生產(chǎn)菌株的篩

22、選和轉(zhuǎn)化工藝熱帶假絲酵母多倍體誘變育種N-26號0.2%秋水仙堿28度振蕩48h多次分離獲得的穩(wěn)定菌株亞硝基胍0度處理40分鐘高產(chǎn)突變株第五十九張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月獲得的多倍體高產(chǎn)突變株十五碳二元酸最高產(chǎn)量可達77.2g/L,油的轉(zhuǎn)化率在60%以上。休止細胞轉(zhuǎn)化工藝第六十張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月正構(gòu)烷烴發(fā)酵二元酸的調(diào)節(jié)過量的尿素對酵母的氧化酶系、異檸檬酸脫氫酶、異檸檬酸裂解酶、琥珀酸脫氫酶以及過氧化物酶有顯著促進，對氧化酶有顯著抑制。第六十一張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月用單一長鏈二元酸化學合成麝香型香料麝香T（十三碳二羧酸乙二醇

23、酯）合成第六十二張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月經(jīng)濟效果及其意義由正構(gòu)烷烴生產(chǎn)單一長鏈二元酸合成麝香類物質(zhì)的研究工作開始于1972年，到80年代已經(jīng)成熟。其獨特之處在于：菌種產(chǎn)酸率高：通過多倍體誘變育種獲得的菌株對奇數(shù)和偶數(shù)烷烴都有很強的氧化產(chǎn)酸能力。休止細胞轉(zhuǎn)化工藝操作簡便，產(chǎn)品純度高單一長鏈二元酸用途廣泛，富有生命力（1）過去都要從油篩油脂中提取短碳化合物，再將碳鏈接長，不僅工藝復雜，而且需要大量溶劑及有毒物質(zhì)，不適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。（2）轉(zhuǎn)化方法優(yōu)于天然原料的化學合成，附加值高第六十三張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月采用單管式和多管式填料精餾塔在減壓條件下先分餾

24、得到各種餾分正烷烴，然后再按需要分別發(fā)酵生產(chǎn)不同長度的單一二元酸正構(gòu)烷烴發(fā)酵生產(chǎn)長鏈二元酸長鏈二元酸的來源（1）植物油裂解制?。?）化工方法合成制取化學氧化時正烷烴發(fā)生斷鏈得不到和正烷烴相應(yīng)鏈長的單一二元酸，所以很難用化工方法從石油中的正構(gòu)烷烴直接氧化制取。（3）生物工程技術(shù)生產(chǎn)微生物具有一種特異的氧化能力，通過胞內(nèi)酶的作用，可在常溫常壓下，氧化石油中的正構(gòu)烷烴的兩端兩個甲基，一步加上4個氧原子，生成與基質(zhì)正烷烴相應(yīng)鏈長的各種長鏈二元酸；此外微生物也能氧化脂肪族醇、酸和酯，生成相應(yīng)鏈長的飽和或不飽和二元酸。第六十四張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月國內(nèi)外長鏈二元酸的研究概況基礎(chǔ)理論

25、研究階段：1970年以前，W-氧化應(yīng)用研究階段：從正烷烴制取長鏈二元酸的研究有了新的突破，進入了應(yīng)用研究階段。工業(yè)生產(chǎn)階段：20世紀80年代以后生產(chǎn)菌株的誘變篩選C10以上的長鏈二元酸，天然存在的少，化工上難以合成所有野生菌株都難以積累和基質(zhì)鏈長相同的長鏈二元酸，它們的氧化能力，即對二元酸的降解能力太強。菌種誘變（1）亞硝基胍（2）紫外線照射處理（3）亞硝酸鈉處理（4）多倍體誘變育種第六十五張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（5）N+離子注入誘變處理（6）構(gòu)建基因工程菌菌種篩選代謝調(diào)控微生物氧化正烷烴生產(chǎn)二元酸是胞內(nèi)酶的作用。B氧化的抑制：丙烯酸，尿素W氧化的促進作用：青霉素引起細

26、胞膜透性的變化；苯巴比妥和巴比妥酸鈉、維生素B12和吐溫等對提高二元酸的產(chǎn)量有較好促進作用。擴試和中試第六十六張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十七張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月工業(yè)生產(chǎn)試驗和工業(yè)化生產(chǎn)長鏈二元酸發(fā)酵的特點四相體系發(fā)酵：菌體、空氣、烴類、水需要氧和發(fā)熱量大長鏈二元酸在水中溶解度小第六十八張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月發(fā)酵工藝和條件攪拌速度pH控制溶解氧罐壓控制溫度控制補料二元酸的分離提取方法水中沉淀結(jié)晶醇中沉淀結(jié)晶溶劑中沉淀結(jié)晶有待解決的問題理論研究和應(yīng)用研究 通過基因工程方法構(gòu)建氧化阻斷型和W氧化擴大型工程菌，再通過發(fā)酵過第六十

27、九張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月程的計算機優(yōu)化控制，進一步提高二元酸產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本仍是努力方向。生產(chǎn)研究（1）發(fā)酵罐的放大（2）能源的消耗問題（3）價廉高效的乳化劑第七十張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第六章 組合生物合成定義在微生物次生代謝產(chǎn)物生物合成基因和酶學研究基礎(chǔ)上形成的，對許多參與次生代謝生物合成的單個分開的具明顯的功能區(qū)域所組成的多酶體系進行替換、阻斷、重組等均有可能改變生物合成途徑而產(chǎn)生新的代謝旁路，形成新的化合物，設(shè)R為可利用的基因數(shù)，N為每個基因的不同等位形式，從理論上講可得到RN個化合物。例子放線紫紅素生物合成的C6位的羥基化酶基因在曼得霉

28、素產(chǎn)生菌異源宿主菌中獲得了表達，將原榴菌素吡喃環(huán)H原子立體構(gòu)型變成放線紫紅素中吡喃環(huán)的手性構(gòu)型。將碳霉素產(chǎn)生菌異戊酰基轉(zhuǎn)移酶克隆至螺旋毒素產(chǎn)生菌，報道獲得了4-異戊酰螺旋霉素化合物,日本學者將該基因克隆至泰洛菌素產(chǎn)生菌，產(chǎn)生4-異戊酰泰洛菌素。結(jié)構(gòu)不同、但生物合成途徑相似的抗生素生物合成基因之間，可以進行重組、組合或互補產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)的化合物第七十一張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月對一些次級代謝產(chǎn)物生物合成酶系結(jié)構(gòu)和功能的深入研究及分子生物學技術(shù)的發(fā)展，使得有可能對這些多酶體系進行重組改造及協(xié)調(diào)，促使組合生物合成這一創(chuàng)制新化合物的新技術(shù)得到了較大的發(fā)展。第七十二張，PPT共一百二十九

29、頁，創(chuàng)作于2022年6月第七十三張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月組合生物合成的基本原理組合生物合成是建立在天然產(chǎn)物生物合成的基礎(chǔ)之上的。聚酮合酶的結(jié)構(gòu)與組成（1）聚酮類化合物從結(jié)構(gòu)上分芳香族、大環(huán)內(nèi)酯類、多烯類、聚醚類和安莎類，具有重要的生物活性，包括抗細菌、抗結(jié)核、抗真菌、抗腫瘤、抗病毒、抗蟲以及免疫抑制作用。（2）它們均以低級脂肪酸為起始單位，由聚酮合酶催化，經(jīng)過類似于脂肪酸合成的碳鏈B氧化過程，再經(jīng)過環(huán)化和環(huán)化后的修飾而形成的。（3）PKSI為模塊式結(jié)構(gòu)，含有多拷貝的活性位點，催化大環(huán)內(nèi)酯類、聚醚類、多烯類及安莎類的生物合成；PKSII有與PKSI類似的活性位點，但是分散在

30、幾個較小的單功能的多肽上，催化柔紅霉素等芳香族化合物的生物合成。第七十四張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 每個單元至少含有B-酮酰基硫酯合成酶(KS)、酰基轉(zhuǎn)移酶(AT)、酰基載體蛋白域(ACP)，某些單元中至少還有特異性組合的酮基還原酶(KR)、脫水酶(DH)、烯醇還原酶(ER)和硫酯酶(TE)。 DEBS3的C端有TE域參與14碳鏈聚酮體的完成及環(huán)化，形成6-脫氧內(nèi)酯。第七十五張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月由編碼PKS的3個閱讀密碼框架組成，它們是KS、ACP和CLF，在生物合成芳香族化合物中它們重復被使用。此外還含有KR、芳香化酶、環(huán)化酶的參與。第七十六張，

31、PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第七十七張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月二、聚酮合酶結(jié)構(gòu)的特異性和專一性 DEBS1單獨或以DEBS1 C端部分ACP與DEBS3單元6中的ACP6和TE融合構(gòu)建DEBS1 +TE，均能在S coelicolor中表達產(chǎn)生三酮體（1和2）。在S coelicolor中也可以乙酸為起始單位形成化合物2。 DEBS3 在S coelicolor中表達化合物3。 DEBS1+單元3+TE的系統(tǒng)在S coelicolor中可表達形成化合物4和5。將單元6中ACP6與單元5中KR5融合+TE，去掉單元6，可形成12環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯化合物6。第七十八張，

32、PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月三、聚酮多酶體系的特異性1 起始單位底物特異性DEBS的AT-ACP荷載域?qū)Φ孜锏奶禺愋杂休^大的寬容性，如果將整個ATL或ATL-ACPL域去掉，仍能產(chǎn)生6-dEB和衍生的紅霉素，利用這一特點，可以改變起始單位以合成不同的衍生物，如以阿維菌素合成的起始單位異丁酸 或2-甲基丁酸可以合成新的三酮體，同樣將阿維菌素ATL-ACPL域替代紅霉素的AT-ACP可以產(chǎn)生以異丁酸 或2-甲基丁酸為起始物的紅霉素衍生物。第七十九張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2 聚酮鏈延伸單位的底物特異性A PKS單元中AT底物特異性PKS單元中各個AT域?qū)Φ孜镉邢喈?/p>

33、嚴格的結(jié)構(gòu)和立體構(gòu)型的要求，僅識別（2S）-甲基丙二酰CoA，成為聚酮體合成的守門員，控制聚酮鏈延伸單位的合成。第八十張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月利用AT域?qū)Φ孜锏奶禺愋钥梢栽诓煌股厣a(chǎn)菌的PKS中進行互換、替代產(chǎn)生新的化合物，如用帕雷霉素PKS中識別丙二酰CoA底物的AT2替代紅霉素DEBS1 +TE系統(tǒng)的AT1組成雜合單元1在S coelicolor中可以產(chǎn)生新的化合物14和15，同樣用雷帕霉素AT14替代DEBS PKS AT1和AT2，在紅霉素產(chǎn)生菌中則產(chǎn)生系列去甲基紅霉素（16），12-去甲基紅霉素B（17）和10-去甲基紅霉素A（18），同樣用雷帕霉素AT2替

34、代DEBS AT6在S coelicolor中也產(chǎn)生2-去甲基衍生的紅霉內(nèi)酯（19，20）第八十一張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月B 酰基載體蛋白域?qū)Φ孜餆o特異性C 酮基縮合酶的底物特異性將DEBS中KR5或ER4域去掉可以形成5-酮（21）和6，7-脫水的6-dEB紅霉內(nèi)酯衍生物，說明KS6均能接受天然B-羥基-6-酮基底物非還原型B-酮酰基前體。由于DEBS KS2對底物的特異性要求不專一，因此有可能進行前體定向的生物合成。加入正常甲基丙二酰NAC可形成6-dEB，加入二酮體模擬物-NAC甲基丙二酰不同衍生物（23，24，25），在DEBS: （KS1缺失）介導下，在S co

35、elicolor中可形成不同6-dEB。第八十二張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第八十三張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月酮基還原酶KR的底物特異性KR域?qū)Φ孜锏囊筝^寬容，它可以接受許多非天然底物。B-酮?；?ACP還原所生的羥基的D-或L-取決于每個KR域所在的性質(zhì)。在DEBS1+單元3+TE系統(tǒng)如將KR5替代KR2所得三酮體的立體構(gòu)型是一樣的，但如果用RAPS KR2替代DEBS KR2則產(chǎn)生3R三酮體化合物 。硫酯酶底物特異性DEBS中TE通常在單元6的C末端催化六酮體C-13羥基與?；?ACP硫酯羰基反應(yīng)，形成成熟的聚酮體14元環(huán)的6-dEB內(nèi)酯。TE對聚酮

36、體的結(jié)構(gòu)也有一定的寬容性。 對于PKSI型多酶體系中單元酶系的研究，使人們在設(shè)計基因組合中能夠比較有針對性。一般來講?；D(zhuǎn)移酶荷載域有較廣的底物寬容性，在此基礎(chǔ)上可進行前體定向組合生物合成；延伸單位酰基轉(zhuǎn)移酶底物特異性要求嚴格；縮合酶對底物的識別程度與某些功能基團的存在位置有關(guān)；酮基還原酶、脫水酶、烯醇還原酶可以接受許多不同于天然的產(chǎn)物；ACP域?qū)μ烊换蚍翘烊坏闹虚g體無差異；硫酯酶可以在6至16元環(huán)中起作用，對底物的立體構(gòu)型有較高要求。第八十四張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月四 PKS模塊間的相互作用傳統(tǒng)手段的組合生物合成產(chǎn)物的產(chǎn)率往往比較低：基因重組蛋白的穩(wěn)定性基因重組蛋白介導

37、產(chǎn)物的產(chǎn)率化學的構(gòu)象上游基因重組產(chǎn)生的中間體是否被下游基因單元繼續(xù)后加工等問題第八十五張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 從上述序列可知，在ACP保守域C端和下一單元KS域N端有一段不同的序列，單元間模塊M2和M3、M4和M5為非共價結(jié)合，而其他相鄰的兩者之間均為共價結(jié)合，連接序列有明顯不同，單元間連接序列較短；上游單元N端和下游單元C端連接序列較長。連接序列在異源基因表達中起重要的作用第八十六張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月連接序列可能影響組合生物合成產(chǎn)物的產(chǎn)量（1）DEBS基因M5中AT5+苦霉素pik KR5+苦霉素M6+TE 產(chǎn)生3mg/mL（2）將pik A

38、CP5pikKS6之間的198bp片段去掉，化合物產(chǎn)量下降5-7倍第八十七張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 組合生物合成的基因操作通過不同的基因組合操作可以產(chǎn)生新的化合物第八十八張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第八十九張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第九十張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第九十一張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第九十二張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）整個單元操作改變聚酮體鏈的長度：去掉特定的PKSI中的結(jié)構(gòu)域的單個ORF可以改變鏈長，利用異源單元可以增加聚酮體的多樣性（2）替代菏載域

39、LD改變生物合成起始單位：用異源LD域替代原LD域例：利福霉素產(chǎn)生菌突變體當加入HBA-3-羥基苯甲酸和DHBA-3,5-二羥基苯 甲酸,可以合成新的四酮體. 雷帕霉素突變株加入脯氨酸可形成雷帕霉素衍生物第九十三張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）前體定向生物合將DEBS單元1的KS1缺失，KS2可識別新的前體，合成新化合物，由新的前體介導的生物合成稱為前體定向生物合成（4）AT域的互換不同的AT域識別不同的延伸單位，相互替代或置換AT域可以產(chǎn)生新的化合物。（5）B碳鏈延伸域修飾的操作KR、DH、ER的缺失可導致紅霉素衍生物的產(chǎn)生，引入還原域也可形成產(chǎn)物的多樣性。（6）單元連接

40、序列的操作基因組合生物合成中間體在非天然單元之間傳遞時的可容納性，在單元間及單元內(nèi)的連接序列進行操作。（7）對聚酮體進行后修飾糖苷化 聚酮體只有被引入羥基、羰基、雙鍵等結(jié)構(gòu)，與脂肪酸、氨基酸進行酰化后，或進行O-、N-、C-甲基化，或聚酮體糖苷化后才具有生物活性第九十四張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第九十五張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月例：將合成與四環(huán)素類似結(jié)構(gòu)的聚酮體基因蔟克隆至含有D-橄欖酸基因產(chǎn)生菌S. fradiae，可產(chǎn)生糖苷化的四環(huán)素。將megosamine合成基因簇克隆至紅霉素產(chǎn)生菌，可以產(chǎn)生巨霉素第九十六張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年

41、6月第九十七張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月酮酯類化合物對大環(huán)內(nèi)酯耐藥菌比較有效，C12位羥基化是酮內(nèi)酯進一步被肼基取代的必要過程（8）體外表達系統(tǒng)DEBS1+TE、DEBS1+單元3+TE或DEBS3+TE系統(tǒng)均能在體外合成相應(yīng)產(chǎn)物，而且可以接受兩種構(gòu)型的底物形成兩種構(gòu)型的化合物。第九十八張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月組合生物合成的表達系統(tǒng)載體系統(tǒng)第九十九張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百零一張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百零二張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月

42、第一百零三張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月其他較新的聚酮類化合物基因簇及進行基因組合生物合成的可能性1 埃波霉素基因簇含有9個單元PKS、22個開放閱讀密碼框和1個非核糖體肽合成酶組成用基因突變或缺失可進行埃波霉素的改造，如使2MT域缺失，可以獲得4-單甲基依普希隆。第一百零四張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2 拉伐他汀基因簇由兩個PKSI型酶、拉伐他汀的九酮體合成酶和二酮體合成酶組成。第一百零五張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3 海洋微生物中的PKS基因海洋微生物中分離到產(chǎn)生腸菌素和wailupemycin兩種三維結(jié)構(gòu)的聚酮體化合物。第一百零六張，P

43、PT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月非核糖體多肽合成酶類型基因組合生物合成許多具生物活性、分子量較小的多肽的合成是由非核糖體多酶體系介導。NRPS是由四種以上多功能酶組成，包括活化、起始、延伸、終止。NPRS首先將氨基酸活化為腺嘌呤核苷酸，然后將氨基酸縮合至酶的SH基團，再逐步聚合成多肽。最后由硫酯酶環(huán)化和從酶系中將肽鏈釋放。第一百零七張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月微囊藻素生物合成基因簇由10個ORF組成，6個多功能酶負責前體的摻入，生物合成過程有非通常功能的酶的參與，因而形成一些特殊的結(jié)構(gòu)。第一百零八張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月組合生物合成存在的問題多酶

44、體中經(jīng)組合的前一酶系所產(chǎn)生的中間體有時不能被下一酶系所接受，影響了終產(chǎn)物的形成。宿主的限制修飾系統(tǒng)產(chǎn)物的后修飾需要綜合考慮基因組合改變原來酶系對底物的特異性和對新產(chǎn)物后修飾酶的可塑性生物學與化學的有機組合鏈霉菌的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)尚未成熟發(fā)展體外蛋白系統(tǒng)廣泛的開發(fā)基因資源第一百零九張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第七章 胡蘿卜素的生物合成胡蘿卜素生物合成的基因工程 胡蘿卜類色素廣泛分布于藻類、植物和一些細菌包括藍細菌，已知結(jié)構(gòu)的胡蘿卜素已經(jīng)超過600多個，其主要用途是作為維生素A的營養(yǎng)源、動物飼料色素、化妝品等，同時也發(fā)現(xiàn)具有抑癌活力和防止慢性疾病功能。第一百一十張，PPT共一百二十九

45、頁，創(chuàng)作于2022年6月生物合成途徑的基因和酶迄今為止，已經(jīng)有150個以上的基因，編碼24個不同crt酶已從細菌、植物、藻類和真菌分離。第一百一十一張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月利用已經(jīng)克隆出來的合成基因可以在重組微生物中構(gòu)建一系列的胡蘿卜素。為了擴大結(jié)構(gòu)不同的胡蘿卜素，將不同的合成基因進行組合后在E.coli中進行表達將合成胡蘿卜素前體的另一個途徑的基因，包括參與IDP合成的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶和idi在E.coli中過量表達，B-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)可達到1.5mg/g干重。第一百一十二張，PPT共一百二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月微藻酮基胡蘿卜素的產(chǎn)生（1）Ph