1、關于分子系統學與分子鑒定第一張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月內容什么是分子系統學什么是系統發育樹建樹方法如何建樹第二張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月分類學與系統學分類學通常被分為分類學( taxonomy)和分類學( taxonomy)等不同階段。分類學:對于多樣性的生物進行分類、描述，按照各類群生物的國際統一命名法規進行不同等級和類群的命名 分類學:通常也被稱之為系統學，即將生物的分類群或分類單位按照生物演化順序排列成一定的系統系統學是研究各等級、各類群之間的演化關系，按照生物演化順序將它們排列成一定的“系統” (英文system，拉丁文systema)。第三張，PPT共

2、六十七頁，創作于2022年6月系統發育樹A tree is a mathematical structure which represents a model of an actual evolutionary history of a group of sequences or organismsIn other words, it is an evolutionary hypothesis第四張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月Phylogenetic trees第五張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月 Topology of A TreeA tree consists of

3、nodes connected by branchesOne unique internal node is the root of the tree: the ancestor of all the sequencesInternal nodes represent hypothetical ancestorsTerminal nodes represent sequences or organisms for which we have data. Each is typically called a “Operational Taxonomical Unit” or OTU.第六張，PP

4、T共六十七頁，創作于2022年6月 Related TermsThe ingroup is the group actually studied by the investigator. That is, it is the group of interest.第七張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月A sister group is the taxon that is genealogically most closely related to the ingroup. The ancestor of the group cannot be its sister because the

5、 ancestor is a member of the group. Related Terms第八張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月An outgroup is any group used in an analysis that is not included in the taxon under study. It is used for comparative purposes, usually in arguments concerning the relative polarity of a pair (or series) of homologous character

6、s. The most important outgroup is the sister group, and considerable phylogenetic research may be needed to find the sister group. Usually more than one outgroup is needed in an analysis. Related Terms第九張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月 Related Terms第十張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月目前用蛋白質和核酸序列進行系統發育關系分析的方法有：距離法（Distance

7、Methods）其中鄰接法（Neighbor Joining, NJ）最受歡迎最大簡約法（Maximum Parsimony, MP）最大似然法（Maximum Likelihood, ML）Bayesian法Methods for Constructing Phylogenies第十一張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月用最大簡約原則（Maximum Parsimony, MP）來推斷最好的系統樹理論依據：解釋一個過程的最好假說應是假設條件最少的假說。因此，對于分子數據（DNA序列數據），該方法計算在最少的堿基替換條件下能夠解釋整個進化過程的拓撲結構（系統進化樹）。簡約原則在邏輯上的要

8、求是在多種解釋中選取最簡單的。在分析系統發育關系時，最簡約的樹是對數據集進化途徑最短的解釋（即從祖先分類單元到現生單元性狀變化的數目最少）Methods for Constructing Phylogenies第十二張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月The steps involved in creating a phylogenetic tree from molecular data are:Identify a protein or DNA sequence of interestIdentify other sequences that are related to the s

9、equence of interest and obtain electronic files of those sequencesAlign the sequencesUsing the results of alignment , generate a phylogenetic treePrint (and perhaps publish) the resultsHow to Create a Tree?第十三張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月 獲取相關基因序列數據Download from GenBankSequenced by investigator第十四張，PPT共六十七頁

10、，創作于2022年6月輸入/網址 Eurytomidae 28S ribosomal RNA gene 第十五張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月第十六張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月第十七張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月第十八張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月自行擴增后獲得的新序列從研究的樣本直接提取DNA，擴增測序，得到序列文件用Sequencher（版本3.1.1）、SeqScape或BioEdit軟件對測得的序列進行校對和編輯，確保序列的準確性保存成FASTA或純文本格式。獲取相關基因序列數據第十九張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月創建輸入文件

11、 由GenBank下載的序列創建運行MacClade軟件，在“File”菜單中選擇“New File”命令在“Taxa”下拉菜單“Improt Sequences”選擇子菜單“FASTA File”打開下載的序列文件batchseq.cgi將輸入的矩陣保存成NBRF格式（File下拉菜單中的子菜單“Export File”中的“NBRF”選項）第二十張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月創建輸入文件由自行擴增的序列創建運行MacClade軟件，在“Taxa”下拉菜單“Import Sequences”選擇“File with Only Sequence”命令；然后逐條地輸入目的序列；將輸入

12、的矩陣保存成NBRF格式（File下拉菜單中的子菜單“Export File”中的“NBRF”選項）。第二十一張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月創建輸入文件第二十二張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月Positional homolog (點同源)序列數據首先必需進行比對,以便能夠對同源位點（比較的單位）進行比較和分析目前應用得最多的關于序列排序的軟件是Clustal X 1.81 序列的比對（Alignment） 第二十三張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月利用Clustal X軟件進行序列比對 用Clustal X軟件打開以上保存的NBRF格式的文件，進行多序列的比對（

13、Multiple alignment）。在“Alignment”菜單的下拉菜單“Alingment Parameters”中選擇“Multiple Alignment Parameter”進行多序列比對的參數設置。參數設置是Gap Opening = 10，Gap Extension = 0.2第二十四張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月利用Clustal X軟件進行序列比對 第二十五張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月在“Alignment”下拉菜單“Output Format Options”中選中“NEXUS format”選項；然后做“Do Complete Alignme

14、nt”比對后，用MacClade 4.0軟件打開排序后產生的“.nxs”文件。手工校對排序的結果，并刪除那些難以比對的高變區（hypervariable regions）Swofford等(1996)認為排除這些區域，可以提高系統發育關系結果的可靠性。利用Clustal X軟件進行序列比對第二十六張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月系統發育關系分析調用目的文件：運行PAUP軟件；在“File”下拉菜單中選擇“Open”命令，找到從Clustal X排序后產生的“.nxs”文件；點擊“Execute”命令排除非信息位點：選中“Data”下拉菜單中的“Include-Exclude Char

15、acters”選項，排除“uninf”位點選擇分析原則及搜索最佳樹的參數設置：在“Analysis”菜單中選中“Parsimony”；然后進行“Heuristic”搜索；其參數設置是：General Search Options = Best trees only Starting trees for branch-swapping = Get by stepwiseStepwise-Additon Options = random, # reps = 1000Swapping algorithm = TBR第二十七張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月系統發育關系分析第二十八張，PPT共

16、六十七頁，創作于2022年6月合意樹：在“Trees”菜單中，點擊“Compute Consensus”，選中“Strict”，點擊“OK”，獲取嚴格的合意樹。系統發育關系分析第二十九張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月第三十張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月 系統發育關系分析賦根：在“Options”的下拉菜單中選中“Rooting”，為樹賦根；有兩種方案，是Outgroup rooting；是Midpoint rooting第三十一張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月系統發育關系分析輸出樹：在“Trees”下拉菜單中選擇“Print trees”以打印樹。參數設置如下：

17、Plot type = Rectangular CladogramLine width = 1.5Font = HelveticaSize = 14Styles = Bold & Italic。 第三十二張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月評價結果的可靠性在得到樹（或樹集）后，必需做的是評價結果的可靠性。主要有Bootstrapping方法。Bootstrapping（Felsenstein ，1985）用于評價系統樹各節點的支持率，通常支持率在90以上是最可信的。在測試中共重復1000次。第三十三張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月選中Bootstrap；Number of re

18、plicates = 1000Type of search = Full heuristicConsensus tree options = Retain groups with frequency 50% 評價結果的可靠性第三十四張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月評價結果的可靠性點擊Continue；在Heuristic Search的Stepwise-Addition Options中的random的# reps的值改為1000；點擊Search運算結束后，點擊Trees下拉菜單中的Print Bootstrap Consensus以打印結果第三十五張，PPT共六十七頁，創作于20

19、22年6月Parsimony Tree based on ITS sequenceT. songshanenseT. songshanenseT. taiyuanenseT. songshanense第三十六張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月Softwares 第三十七張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月紅火蟻（Solenopsis invicta）分子檢測技術研究 中國檢驗檢疫科學研究院第三十八張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月研究背景研究目的材料和方法結果分析與討論第三十九張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月研究背景分類地位膜翅目（Hymenoptera）蟻科（

20、Formicidae）家蟻亞科（Myrmicinae）火蟻屬（Solenopsis） 第四十張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月研究背景分布國外：巴西、阿根廷、安提瓜和巴布達、特立尼和多巴哥、波多黎各、巴哈馬群島、特克斯和凱科斯群島、英屬維爾京群島、美屬維京群島、美國、澳大利亞、新西蘭、馬來西亞國內：中國臺灣省、香港、澳門和廣東省吳川等第四十一張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月預測分布圖第四十二張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月中國預測分布圖第四十三張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月研究背景形態方面單家蟻屬（Monomorium）、大頭家蟻屬（Pheidole）、

21、擬大頭家蟻屬（Pheidologeton） 、熱帶火蟻（Solenopsis invicta）黑火蟻 S. richteri 相似。尤其是幼蟲和卵更難區分。分子方面紅火蟻 Solenopsis invicta，黑火蟻 S. richteri，熱帶火蟻 S. geminata和 S. quinquecuspis 四個種 第四十四張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月研究背景 危害經濟危害農作物，電力設備等社會人類健康生態環境降低生物多樣性第四十五張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月研究目的紅火蟻的分子檢測技術研究篩選引物與探針，建立紅火蟻不同蟲態卵、幼蟲、成蟲快速、準確的實時熒光PCR

22、分子檢測體系，為口岸快速查驗和大通關提供有力的技術支持。 第四十六張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月材料與方法確定紅火蟻主要分布的地區及要采樣的地點；獲取紅火蟻不同地理種群標本；篩選并優化紅火蟻分子檢測探針。第四十七張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月技術 路 線第四十八張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月國內標本收集標本國外標本序列比對基因測序DNA提取擴增構建紅火蟻分子檢測技術體系篩選分子檢測引物與探針GenBank第四十九張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月材料與方法樣品 總共選取紅火蟻5個種群和熱帶火蟻1個種群為研究對象。只選取采自同一地點，至少有兩個個體(卵

23、、幼蟲、成蟲)的同種標本提取基因組DNA。其中一頭標本用于分子生物學實驗，其余的作為形態鑒定參考(voucher species) 。第五十張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月標本號種 類采集地1Solenopsis invicta深圳公明廣記花場2Solenopsis invicta深圳光明農場3Solenopsis invicta珠海斗門白蕉鎮4Solenopsis invicta珠海回歸公園5Solenopsis geminata廣西北海6Solenopsis invicta廣東吳川第五十一張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月材料與方法提取基因組DNA采用Wizard方法（P

24、romega）提取基因組DNA，可成功提取卵、幼蟲、成蟲單個個體的基因組DNA。標本最初保存在濃度為100的酒精中；隨后轉至70的酒精中長期保存。第五十二張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月材料與方法設計引物與探針GenBank發表火蟻屬（Solenopsis）的COI基因序列有102條，分別屬于Solenopsis invicta, S. richteri，S. geminata和 S. quinquecuspis四種，標本來源分別為阿根廷、巴西和美國。用Clustal X軟件對COI基因序列進行比對后，分析保守區與高變區，針對紅火蟻的特異序列，手工設計了引物與探針。 第五十三張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月材料與方法序列的比對（alignment）與分析比對（Clustal X, Thompson et al., 1997)Neighbor-Joining Tree Thinking第五十四張，PPT共六十七頁，創作于2022年6月第五十五