1、第十章 轉基因技術與應用轉基因植物轉基因動物轉基因微生物轉基因技術是將人工別離和修飾過的基因導入到生物體基因組中，由于導入基因的表達，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，這一技術稱之為轉基因技術Transgene technology。人們常說的遺傳工程、基因工程、遺傳轉化均為轉基因的同義詞。 第一節 轉基因植物 p85目的基因和受體的獲得轉基因方法轉基因植物的鑒定轉基因植物的應用轉基因植物研究存在的問題一、目的基因的來源采用限制性內切酶，從生物組織中獲取目的基因；通過mRNA合成cDNA；人工合成的DNA片段；聚合酶鏈式反響PCR擴增特定基因片段。二、轉基因植物受體包括：葉盤、胚軸、莖尖、莖段原

2、生質體懸浮細胞愈傷組織胚狀體活體三、轉基因方法直接導入法物理法：基因槍法、電擊法、超聲法、顯微注射法、激光微束法化學法：PEG法，脂質包埋法等載體介導法：農桿菌介導、病毒介導法花粉管通道法槍擊法將待轉化的DNA沉淀在細小金屬珠的外表，用特制槍將金屬珠直接打入植物細胞，槍的威力為430 m / s，植物細胞通常是胚胎細胞、玉米籽、葉子等，但進去的DNA片段整合效率極低。電擊法將高濃度的質粒DNA參加到植物細胞的原生質體懸浮液中，混合物在 200 - 600 V / cm 的電場中處理假設干秒鐘，然后將原生質體在組織培養基中生長 1 - 2 周，再生出整株植物。直接導入法融合法將外源DNA與特殊的

3、疏水性高分子化合物混合，在水中這些疏水性化合物分子形成球狀的脂質體，后者與植物細胞原生質體融合，篩選融合子，再生植物細胞壁。T-DNA的染色體整合機制載體介導法農桿菌介導法p87共整合轉化程序二元整合轉化程序病毒介導法隨著植物病毒分子生物學及遺傳學研究的不斷深入，用病毒基因組作為載體轉化植物細胞日益受到人們的重視，因為病毒載體能將外源基因導入植物的所有組織和細胞中，而且不受單子葉或雙子葉的限制。 在大約300種特征清楚的植物病毒中，單鏈RNA病毒約占91%，雙鏈RNA病毒、雙鏈DNA病毒、單鏈DNA病毒各占3%。利用植物病毒載體轉化植物細胞大致有以下兩種戰略：轉染植物細胞原生質體轉染植物組織花

4、粉管導入法 將外源DNA沿著花粉管經過珠心進入尚未形成正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞中，從而實現基因的轉移。這一方法是我國科學家周光宇首先提出設計的，目前已應用于水稻、小麥、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的轉基因研究。 花粉管導入法的特點是直接、簡便。它的受體材料為植株整體，省略了細胞組織培養的誘導和傳代過程，排除了植株再生的障礙，特別適合于難以建立有效再生系統的植物。由于轉化的是完整植株的卵細胞、受精卵或早期胚胎細胞，導入的DNA分子整合效率較高。四、轉基因植物的鑒定選擇培養基檢測：如Ti質粒改造時插入抗生素標記基因遺傳標記檢測：選擇標記治理，如含有-葡糖苷酸酶、熒光素酶基因等目的基因檢測

5、：PCR、分子雜交等五、轉基因植物應用植物基因改進 抗蟲害植物、抗除草劑植物、高品質植物轉基因植物生產藥物富含維他命A的黃金大米轉基因番茄（抗花葉病基因）轉基因棉花（Bt基因）抗蟲玉米轉基因植物1983 年 美國和比利時科學家首次將外源基因導入煙草和胡蘿卜。1994 年 世界上第一種耐儲藏的番茄在美國批準上市。1995 年 轉基因的抗蟲、抗除草劑的玉米和棉花在美國投入生產。2000 年 美國轉基因大豆的種植面積首次超過普通大豆。迄今為止 世界上共批準了12種作物、6大類性狀的48個轉基因品種進行商業化生產，其中包括水稻、玉米、馬鈴薯、小麥、黑麥、紅薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亞麻、甜菜

6、、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡蘿卜、黃瓜、蘆筍、苜蓿、草莓、木瓜、獼猴、桃、越橘、茄子、梨、蘋果、葡萄等。藥物名稱基因來源應用植物載體核糖體抑制蛋白恬樓、玉米抑制HIV煙草血管緊張肽轉化酶牛奶抗過敏煙草、番茄抗體老鼠多種用途煙草抗原細菌、病毒病原口服疫苗煙草、馬鈴薯、番茄腦啡肽人止痛、鎮定劑油菜、擬南芥表皮生長因子人特殊細胞增值煙草促紅細胞生成素人調節紅細胞水平煙草生長激素鮭魚刺激生長煙草、擬南芥水蛭素合成血栓抑制劑油菜人血清蛋白人血栓擴張劑煙草、馬鈴薯干擾素人抗病毒蕪芩應用于生產轉基因藥物的植物六、轉基因植物研究存在的問題環境釋放平安性食品平安性生物平安的含義生物平安使指在一定的時間與空間范

7、圍內，由于自然或人類活動引起外來物種遷移，外來物種在定居、建群、繁衍、擴展的連串過程中造成對外鄉物種和生態系統的威脅、危害，使之衰退，甚至退化和滅絕；或由于人為造成環境的劇烈變化，導致生態環境的破壞或掠奪生物資源，砍伐和捕撈過度，嚴重時導致物種瀕危或滅絕；或由于科學研究、開發、生產和應用中造成對人類健康、生存環境和社會生活的有害影響。這三種情況均屬于生物平安范圍，第一種其實是外來物種入侵，或角生物入侵。第二種情況是生態環境的破碎化、片斷化和邊緣化，同樣使生物多樣性受到威脅。第三種情況是指生物技術和生物工程引起的生物平安問題，是科技進步帶來的負面影響，主要包括轉基因農作物的生物平安問題。生物平安

8、問題的提出與演化 1973年在美國新罕布爾州舉行的哥敦會議上Gordon，在討論核酸問題時，許多生物學家對即將到來的大量基因工程操作的平安性提出擔憂；1975年2月，在美國加州阿西羅瑪Asilomar舉行了一次國際會議，第一次正式討論轉基因生物的平安性問題；1976年，美國國立衛生研究院NIH發布?重組DNA分子研究準那么?，隨后，德、法、日、澳等也相繼制定了有關重組DNA技術德平安操作指南或準那么，經濟開展合作組織OECD公布了?生物技術管理條例?，歐盟公布了?關于控制使用基因修飾微生物的指令?、?關于基因修飾生物向環境釋放的指令?等。1992年6月，聯合國環境與開展大會通過?生物多樣性公約

9、?，直至2000年1月正式通過?生物平安議定書?。1993年，國際經濟合作與開展組織OECD提出轉基因食品平安性分析原那么是“實質等同性原那么。即轉基因食品及其成分應與市場上銷售的對應食品具有實質等同性。這種等同性包括表型性狀、分子特性、主營養成分及抗營養因子。2001年5月23日，中國國務院第304號令公布了?農業轉基因生物平安管理條例?。該條例共分8章，分別是總那么、研究與試驗、生產與加工、經營、進口與出口、監督檢查、罰那么、附那么等。轉基因生物的潛在生態風險 轉基因生物的“基因污染造成生態問題，引起雜草化。1998年，加拿大Alberta省發現一種Canola油菜，它由于基因污染而含有抗

10、草甘膦、抗固沙草、抗咪唑啉類除草劑等三掌轉基因堆積而成的“光譜抗除草劑基因HT基因。這種多抗性怪異油菜的種子爆莢、休眠期長、種子很小、圓而光滑，可隨風傳播到相當遠的距離，更易造成基因污染和擴散，而一般除草劑對它無可奈何，成為多抗性的“超級雜草。另一個有名的例子是：J. E. Losey 1996年在?Nature?雜志發表的一篇報導：他們用轉Bt基因玉米花粉的馬利筋葉片來飼喂大斑蝴蝶幼蟲，對照組是加普通玉米花粉的馬利筋葉片及不加玉米花粉的馬利筋葉片，結果轉基因玉米花粉的葉片飼喂幼蟲后，第二天死亡10以上，4天后死亡44。而對照組全部存活。這就說明，Bt轉基因玉米花粉可能威脅大斑蝴蝶的生存,引起

11、生態種群的破壞。轉基因生物對農田生態系統的潛在風險增加殺蟲劑的使用。由于轉基因生物可能造成的影響是抗藥基因的特性選擇和轉移或漂流到可相容的其他植物中，形成抗性雜草或超級雜草，具有很強的抗藥性。產生新的農田雜草。其原因是由于基因漂流或基因逃逸，如通過昆蟲傳播花粉引起雜交或基因污染，使近緣種變成新雜草或超級雜草。轉基因植物自身變為雜草。由于插入性狀的競爭而演變退化為雜草。產生新的病毒。由于不同病毒基因組和轉基因作物的病毒外殼蛋白重組而出現新型病毒。廣譜抗除草劑堆積基因群HT的超級雜草。產生新的作物害蟲。由于病原體與轉基因植物相互作用或是草食動物與轉基因植物相互作用而出現的新型轉基因害蟲。比方常見害

12、蟲產生抗性，并進化增強。對非目標生物的傷害。由于誤食或基因污染導致。例如2002年10月美國內布拉斯加的一塊約一英畝的剛收獲大豆的田里，發現了三株轉基因玉米。這是因為上一年種植的含一種胰島素蛋白的藥用轉基因玉米的種子遺留下來在田里發芽，結果導致總價值270萬美元的這一季大豆不得不付之一炬。轉基因生物對自然生態系統的潛在風險侵入到新的棲息地。通過昆蟲、鳥類、風力等媒介使轉基因花粉四處擴散，造成基因污染，威脅生物多樣性平安。喪失生物多樣性。轉基因生物通過生存競爭、環境脅迫或其他不確定性因素增加的影響基因、種群或物種，使生物多樣性受損害或者喪失。對非目標外鄉物種的傷害。由于改變互惠共生關系導致。營養

13、循環和環境生物地球化學過程的改變。生物與非生物環境的相互作用關系改變導致。初級生產力的改變。改變物種的組成和結構以及轉基因植物的不同性狀，都可能導致在不同程度上影響初級生產力的變化。增大土壤流失。轉基因生物對健康平安的潛在風險轉基因食品有毒性嗎？轉基因食品可能造成過敏嗎？轉基因食品中的標記基因會不會有危險？一些具有抗除草劑或毒殺害蟲功能的基因，是否會通過食物鏈進入人體內而影響健康？外源性目的基因轉入移植后是否會產生新的有害遺傳性狀或不利于健康的因素？轉基因食品對人類的生殖遺傳是否會有影響？等等。毒性問題：雖然迄今還沒有具說服力的研究報告說明轉基因食品GMF的毒性，但由于轉基因作物可能產生“非預

14、期后果，因此由其加工的食品可能存在潛藏的健康風險。例如，據1998年報導，轉基因馬鈴薯引起大鼠器官生長異常。英國2002年的研究稱，轉基因大豆制成的漢堡包食用后，在排出的糞便中仍含有轉基因DNA的成分，說明抗除草劑基因可存在于腸道細菌內并沒有被完全消化。又如，馬鈴薯中本來含有毒素茄堿綠馬鈴薯，轉基因馬鈴薯中茄堿是增加還消除了呢？過敏反響問題：過敏性風險史醫學上的“變應原性風險，一般人和動物是非常低的，但轉基因作物可能誘發或家中變應原性風險。轉基因作物帶有外源基因，即具有新的蛋白質，這些新蛋白質可能引起食用者或接觸者出現過敏反響。人類在自然環境中進化形成的人體免疫系統可能難以或無法適應轉基因生成

15、的新型蛋白質而誘發過敏癥。例如，安萬特公司推出的“星聯玉米，是含有殺蟲蛋白Cry9C的轉基因玉米，結果少數人吃了之后引起皮疹、腹瀉或呼吸系統的過敏反響并有潛伏效應。1998年美國環保局比準“星聯玉米生產時，明確規定只準供動物飼料之用，不能作為食品。2000年9月，發現美國市場的玉米面餅等300多種產品中含有微量“星聯玉米，引發大風波。為回收被“星聯玉米污染的玉米食品，安萬特公司花費了約10億美元。這就是在轉基因平安史上著名的“星聯玉米事件。抗藥性問題：轉基因操作中常常需要使用標記基因，而抗藥性基因是用得最多的標記基因。如氨芐青霉素抗性基因，卡那霉素抗性基因，四環素抗性基因，新霉素抗性基因，放線

16、菌素抗性基因等等。這些抗性基因會一直存在于植物器官中，通過食物鏈可能會被傳入人畜消化系統中細菌體內，使這些細菌對抗生素藥物的治療產生抗性。而抗生素是用來治療各種非常嚴重疾病的藥物，如果抗生素失效，那么挽救人類生命就成為問題。例如，氨基丁卡霉素被認為是人類醫藥中的“保存或“急救抗生素，是國際醫藥界儲藏的應急“救危藥物，而現在卻為GMO捷足先登，并濫用于多種GMO作為標記基因，廣泛在環境中釋放，在各種動植物機體內產生抗性。有益成分問題：研究發現，外來基因會以一種人們目前還不甚了解的方式破壞食物中的有益成分。如英國倫理與毒性中心的實驗報告稱：與一般天然大豆相比，在兩種耐除銹劑或抗除草劑的轉基因大豆中

17、具有防癌功能的異黃酮成分分別減少了12和14。GMO中插入的外源性目的基因改變了生物自身原有的復雜生物化學路徑，改變了原有的新陳代謝，其生化作用的結果很難預料，還可能受環境條件變化的影響而導致變異。免疫力問題：轉基因生物及其產品有可能降低動物乃至人類的免疫能力。 轉基因食品的概念轉基因食品是指那些轉入由植物、動物或微生物的細胞中提出的基因，從而獲得某些良好特性的生物所制成的食品成為轉基因食品或基因改造性食品轉基因食品的主要功能：1 高產、生產期短、抗病、抗蟲害和便于運輸、儲存2 改造食品營養成分含量、防病和增強體質抗金屬作物的去除土壤中污染的重金屬能力轉基因作物的種類主要有: 大豆、玉米、棉花

18、和油菜等,這四類作物占全部轉基因植物的86%，其中75%種植在北美。從轉基因作物的性狀來看,主要有抗除草劑、抗蟲、抗病等幾類。目前世界上轉基因作物種植面積最多的是：抗除草劑大豆種占轉基因植物總面積的40%；抗蟲玉米占23%；抗病煙草占13%；抗除草劑油菜占10%；抗蟲棉花占8%；抗除草劑棉花占3%。轉基因食品的平安性評價轉基因食品的平安性評價是一個很復雜和需要較長時間試驗才能得出結論的問題。轉基因食品的平安性應著重從宿主、載體、插入基因、重組DNA、基因表達產物和對食品營養成分的影響幾方面考慮。 轉基因食品的平安性評價原那么IFBC提出采用判定樹decision-tree的原那么與方法對轉基因

19、食品進行平安性評價。1)了解被評價食品的遺傳學背景與基因改造方法；2) 檢測食品中可能存在的毒素；3)進行毒理學實驗。FAO/WHO聯合專家評議會制定的生物技術食品的平安性評價政策與原那么著重強調：1) 平安性評價應與科學為依據，不能過高估計該類食品的危害性，也不能過低估計該類食品可能存在的問題。2) 任何生物技術食品的平安性評價應首先說明其分子、生物學和化學特性。3) 對基因改造微生物而制作的食品，如果其分子、生物和化學分析說明與傳統食品一致，那么主要對其雜質和加工過程進行評價，強調在加工過程中實施HACCP和GMP。 4) 對基因改造的動物性食品，動物本身的健康可作為平安性評價的標志。5)

20、 對已進行平安性評價并批準用于消費的食品，需進行有方案的使用后的人群健康監測。 轉基因食品的平安性評價的方法對轉基因食品從營養與毒理學兩方面按個案進行評價。在對一種轉基因食品進行平安性評價時，應首先了解其背景資料，包括食品名稱、來源動物、植物或微生物、基因改造方法宿主、載體、插入基因、重組生產體的特性、人體攝入量、使用目的及使用人群是否是特殊人群，如孕婦、兒童等、加工方法及食品成分等，同時確定待評價的試驗樣品與實際生產的和人類實際消費的食品是否一樣。1) SAFEST 1類食品：與傳統食品極其相同或相似的基因改造食品，不必進一步證明其平安性。2) SAFEST 2類食品：與傳統食品極其相似，但

21、存在某個新成分或新特性或缺乏某一個新成分與特性的基因改造食品。需要對其不同的成分與特性作進一步的分析評價。3) SAFEST 3類食品：與傳統食品既不相同也不相似的基因改造食品，需要作廣泛的毒理學評價。1) 關于急性毒性的試驗結果;2) 關于亞急性毒性的試驗結果;3) 關于慢性毒性的試驗結果;4) 關于對生殖產生影響的試驗結果;5) 關于變異原性的試驗結果;6) 關于癌原性的試驗結果;7) 其他必要的實驗結果(腸道毒性試驗結果等)。實質等同性原那么：即轉基因食品和傳統同類產品比較特性、化學成分、營養成分、所含毒素等評價方法：Monsanto公司的評價方法：1插入基因所表達蛋白的平安性評價2營養

22、水平的比較3健康顯示測試全食物飼喂研究數據庫的應用活體或離體動物模型 轉基因食品致敏性的評價PCR檢測的方法國外對轉基因食品管理的有關法規1 在FAO/WHO召開的第23屆(1994)食品標簽法典委員會會議上同意由美國官方機構負責起草?食品標簽的生物學技術關聯指南草案?。美國方面提出轉基因食品平安無害，應與其它食品同等對待而不必強制性標簽。 第25屆(1997) 食品標簽法典委員會會議對?指南草案?再次擬稿，提出了一個?關于采用生物技術制備食品的標簽的推薦意見?的提案，要求對轉基因食品加施GMO(基因改進有機體)標簽。2 歐洲議會于1997年5月15日通過了?新食品規程?的決議，規定歐盟成員國

23、對上市的轉基因產品必需要有GMO的標簽,這包括所有轉基因食品或含有轉基因成分的食品。標簽內容應包括：(1)GMO的來源；(2)過敏性；(3)倫理學考慮；(4)不同于傳統食品(成分、營養價值、效果等)。1998年9月1日歐盟增補了標簽指南，規定來自于轉基因豆類和玉米的食品(目前不包括食品添加劑如大豆卵磷脂)必須標簽。如果食品的原料及在加工過程中沒有添加轉基因的成分，那么可標示非轉基因食品的標簽。3 澳大利亞、新西蘭于1999年5月起實施?轉基因食品標準?，規定對用基因工程技術生產的食品必須進行平安性評價，如在平安性評價中未獲認可，將不得進入市場銷售。4 俄羅斯政府規定，從1999年7月1日起，進

24、口轉基因食品必須經俄有關部門質檢。俄授權醫學科學院食品研究所和國家生物工程中心對進口轉基因食品進行質檢。5 瑞士聯邦政府規定，食品中轉基因成分不超過1%的，不需在標簽上標明；超過1%或無法確定的，需在標簽上說明。6 加拿大還沒有要求強制性地對所有轉基因食品作標簽表述，但只要其表述是真實而無誤導的，就允許并鼓勵食品生產商進行自愿性的標簽表述。當基因突變導致對局部消費者造成可能的健康與平安風險時，基因工程生產的食品應實行強制性標簽要求，比方當引入某種的過敏原或對食品的構成或營養成分發生變化時。我國的對策我國目前還沒有方法對轉基因食品進行檢測，也沒有相應的管理方法和法規來進行監管1 借鑒國外的通行做

25、法，制訂一部專門的法規來加強對轉基因食品的管理要求出口國必須對轉基因食品加貼標簽檢驗檢疫機構應對進入我國市場的進口轉基因產品實施申報、登記制度。登記內容主要包括：產品名稱、來源動物、植物或微生物、基因改造方法宿主、載體、插入基因、重組生產體的特性、人體攝入量、使用目的及使用人群是否是特殊人群，如孕婦、兒童等、加工方法及食品成分等。出口國應向我國檢驗檢疫機構提供經過平安評價方面的證明，并承諾承擔種植和消費轉基因產品可能引起的風險。2 加緊開展對轉基因食品的檢測和平安評價工作。1加緊開展對轉基因食品的檢測工作2加緊開展對轉基因食品的平安性評價工作3 國內公司進口食品時應要求外方對轉基因食品予以申明

26、和加貼標簽轉基因植物產品的檢驗技術轉基因植物產品的平安性評估極為重要，但可能更為受到人們關注的是轉基因產品的檢測技術。目前要測試植物產品是否含有基因改造成分，或植物產品是否經過基因改造，主要有兩種方法：1 檢測是否有外來基因或DNA；2 檢測是否有外源的蛋白質。方法1是基于PCR技術，此技術能檢測樣本中是否有外耒基因，既使外耒基因量極微，PCR技術也能精確檢測，檢測包括檢測目標基因、標記基因和引物等不同方法。由于方法1操作簡便，結果精確，所以其是歐美實驗室采用最為廣泛的方法。方法2操作麻煩，有待進一步改進，局部歐美實驗室亦有采用。第二節 轉基因動物p154定義動物轉基因的流程轉基因方法轉基因動

27、物鑒定轉基因動物應用 將特定的目的基因從某一生物體別離出來，進行擴增和加工，再導入另一動物的早期胚胎細胞中，使其整合到宿主動物的染色體上，在動物的發育過程中表達，并通過生殖細胞傳給后代。這種在基因組中穩定整合有人工導入外源基因的動物稱為轉基因動物transgenetic animal。將克隆的外源基因注射到一個受精卵的細胞核中；接種后的受精卵移植到雌性受體的子宮，使其順利完成胚胎發育；移植后的受精卵發育生長為后代，其中的局部后代其細胞中都攜帶有轉入的外源基因；利用這些能產生外源蛋白的動物作為種畜或種禽，培育新的純合系。動物轉基因的流程外源目的基因的制備外源目的基因有效導入生殖細胞或胚胎干細胞選

28、擇獲得攜有目的基因的細胞選擇適宜的體外培養系統和宿主動物轉基因細胞胚胎發育及鑒定篩選所得的轉基因動物品系動物轉基因的流程圖基因的轉移的方法電穿孔法顯微注射法磷酸鈣DNA共沉淀法脂質載體包埋法病毒介導的生物學方法電穿孔法實現外源基因的轉移利用脈沖電場提高細胞膜的通透性，從而使外源DNA轉移至細胞中。此法簡單、效率較高，廣泛應用于培養細胞的基因轉移。顯微注射轉基因技術利用顯微操作技術轉移外源基因的方法。此法轉入基因長度可達數百kb；并能隨機地整合在受體細胞染色體DNA上，因此應用范圍廣。但是這種整合有時會導致轉基因動物基因組的重排、易位、缺失或定點突變。磷酸鈣DNA共沉淀法基因轉移技術這種方法是受

29、二價金屬離子能促進細胞吸收外源DNA的啟發而開展起來的。當核酸以磷酸鈣DNA共沉淀物的形式在時，細胞攝取DNA的能力顯著加強。但轉移效率較低，僅有1%5%的外源DNA可以進入受體細胞核中，大約僅有1%的DNA可以在細胞中穩定表達。脂質載體包埋法將需要轉移的外源DNA或RNA包裹于脂質體內，由于脂質體具有磷脂雙層結構，與細胞膜類似，因此可以與受體細胞膜融合，從而將外源DNA轉入宿主細胞。這種方法轉基因效率高。病毒介導的生物學方法基因顯微注射法胚胎干細胞移植法反轉錄病毒法重點介紹通過激素療法使小鼠超數排卵，開始時注射雌性妊娠血清，48小時后再注 射人絨毛膜促進腺激素，這時小鼠便會超數排卵，一般情況

30、下5-10個，超 數排卵為35個；與雄性小鼠交配，然后殺掉小鼠，從其輸卵管內取出受精卵；將經純化的轉基因樣品迅速注射入受精卵中變大的雄性原核內 ；將25-40個注射了轉基因的受精卵移植入代孕小鼠體內 ；受精卵發育成胚胎，并繁殖成轉基因小鼠子代 ；從小鼠子代體內取出DNA樣品，進行雜交，鑒定轉基因的整合與否及位 點 ；子代小鼠間進行再交配，繁殖，觀察轉基因是否遺傳及表達 。 DNA顯微注射法的根本程序一、基因顯微注射法顯微注射DNA的制備與純化DNA構型和末端結構載體DNA的長度與濃度溶解DNA的緩沖液DNA的純度鼠的準備與要求轉基因鼠實驗所用各類鼠超排卵與取卵孕馬血清PMS其有效成分為卵泡刺激

31、素FSH。人絨毛膜促性腺激素hGG雌鼠的排卵時間：雄鼠的排精時間：受精一般發生在：1 超排卵制定排卵程序：(1) 于第一日中午先向小鼠腹腔內注入5一l 0單位的PMS；(2) 過48小時(第三天中午)腹腔內注入510單位的人hCG(注射后1113 小時后排卵)；(3) 令雌雄動物一對一的合籠交配；動物半夜交尾，如未發生交配，兩周后可再重用，但成功率下降；(4) 檢查陰栓(第四日晨)；檢查陰栓可判定是否受精；如已受精那么出現陰栓。2 受精卵的收集(1)檢查陰栓：有白色陰栓的小鼠可用，引頸處死動物：(2)取輸卵管：剖開腹腔，取出輸卵管，置入含有3ml培養液的60mm直徑的瓶皿中；(3)取卵子；在2

32、0或50解剖鏡下找到輸卵管，在卵管膨大的壺腹部(于卵管開口近 處)隱約可見內含的胚卵，把胚卵團用尖攝輕輕壓擠出，用吸管移入含有400l別離 液的表玻皿中；(4)另準備45個瓶皿，每皿內均充有胚胎培養基400 l并覆蓋有厚8mm硅烷油或液 體石蠟層(Fisher產，研究用)，硅烷油和石蠟巳預先在5%CO2中置371時做平衡 處理，覆硅烷油或石蠟層的目的是為防止培養液蒸發、散熱和pH改變；(5)向含卵團表玻皿的別離液中加5 l新制備的透明質酸酶(透明質酸酶10mg1ml分 離液，Sigma產)，把胚卵團消化分散開；(6)當卵團散開后，立即把分散游離的卵細胞用吸管轉移入培養皿中，通過硅油層接 種入任

33、一培養液小滴中)，以去除酶的繼續作用；(7)再依次通過皿內其余培養液小滴，以繼續除掉酶和擺脫碎片(碎片能堵塞吸管口)， 此時的卵己可用作DNA注射之用。DNA顯微注射制備持卵管與注射針在火焰燈上將微玻璃管拉成中間較細的約510cm長的一段，其口徑約80120m，用玻璃刀將其在離頸部2cm處切斷，再把切口燒成如圖形狀，口徑約15 m。將尖部移近火焰噴燈略加熱，用鑷子輕觸尖部適宜位置，使變成如下圖角度。由拉針器制成，針的口徑應低于1 m。1硅烷油注入：取培養皿或表玻皿，注入已經過平衡處理過的液體硅烷油或石蠟 厚約5mm；2加培養基：通過硅烷油或石蠟層向培養皿底接種培養液，以100l為單元的小滴 數

34、個，各滴間相距1一2cm(視小滴多少而定)；3胚卵接種：吸取待受注射胚卵數個，通過油層分別接種入培養液小滴中；4DNA準備：從Eppendorf管中取一份DNA后；用75%乙醇漂洗后，真空中枯燥， 重懸于注射緩沖液中(含1mgDNAml)，使其最終濃度為：；5于臨注射前把DNA樣品在Eppendorf 管中再離心一次(1200rpm，10分鐘)，以消 除末溶解物，防止阻塞注射管口；6把待注射用的DNA裝入注射管中；2 DNA注射7在顯微鏡下把支持吸管轉移到培養液小滴中，選一健康胚卵；先吸少量培養 液， 僅令充入吸管末端，然后吹出；在吸管保持負壓狀態下吸住胚卵，繼 之把支持管調至皿底令胚卵靠于皿

35、底面中央部；8調注射針至胚卵近處，先調顯微鏡焦點看清針尖，然后通過透明帶刺入胚卵 細胞膜內(小鼠胚卵直徑約10m)，進而繼續進針再刺入任一原核內雄性原 核多位于周邊部，體積較大，為主要注射對象。注射針刺入細胞內進行注 射時，如細胞核微微發生膨脹，證明DNA已被注入，反之需重新進行注射； 注射細胞數量越多越好； 9用支持吸管把已注射細胞移入另一培養小滴中，使之與未注射細胞分開；待 注射結束后，把所有細胞均移入培養液中，置入溫箱培養30分種；10鏡下觀察細胞，發現有溶解死亡崩潰者棄掉。體內接種1在手術前夜令受體母鼠與已結扎輸精管雄性小鼠合籠，次日晨取出雌鼠備用；2取注射吸管兩支，分別作為向兩側輸卵

36、管注入胚卵之用；先吸入少許培養液，排出后留少許液體并保存一兩個氣泡，繼之吸入胚卵數個(在管腔內成串)； 最后仍保存一個氣泡，以使管內胚卵限制于氣泡之間不易移動并利于識別；3 麻醉小鼠，深度適當，置動物于小手術平臺上，呈腹臥位(背朝上)；4 剪出背腎部兩側毛，碘酒酒精消毒；5 使動物軀干部一側斜向上，在髂骨和腎臟下方間剪一縱切口，長2cm；6 輕輕牽出輸卵管，找尋輸卵管口(剛排卵動物輸卵管壺腹部微膨脹，內可見 成團未受精卵子)一手用鑷子輕輕持住輸卵管系膜，另一只手持一個含有胚 卵的注入管，伸入輸卵管口內，把吸管內已含有外源DNA的胚卵全部注入 輸卵管內；7 把輸卵管及周圍組織送回腹腔內；8 仔細

37、緊密縫合創口，9 再令動物倒向另側；按同樣操作方法向該側輸卵管內輸入同等量的胚卵。優點： 轉基因范圍廣，轉移基因大，可達數百kb；且轉基因不含任何病毒基因組片段，絕對平安 。缺點：整合機制不明確，無規律隨機整合，多拷貝整合導致轉基因不表達；整合位點隨時機造成轉動物基因組的重排、突變、易位缺失等；需顯微操作儀，技術性要求強。 胚胎干細胞embryonic stem cell，ES是從早期胚胎內細胞團ICM別離出來的，能在體外培養的一種高度未分化的多能干細胞。它是一種含正常二倍體染色體的具有發育全能性的細胞。可以在體外進行人工培養，擴增，并能以克隆的形式保存。胚胎干細胞方法優點：基因轉移效率大大提

38、高，且能進行定位基因轉移。缺點：需要多代才能得到純合的轉基因動物，這對飼養本錢高，產仔數較少的大型哺乳類動物來說，要獲得轉基因動物是一件需要大量資金投入的事情。通過物理方法將重組DNA分子轉入包裝細胞 反轉錄病毒載體的工作原理：寄生在受體細胞中的重組病毒由于沒有包裝信號，能生產病病毒RNA和所有蛋白質，但不能包裝成病毒顆粒；病毒載體轉化受體細胞后，載體上的包裝信號將使包裝蛋白把載體包裝成為侵染生的病毒顆粒。反轉錄病毒法優點：能有效地將轉基因整合入受體細胞的基因組內，單拷貝整合型；轉基因整合后能穩定地遺傳；整合機制相應明確，在TR區域內進行，不會破壞轉基因結構 缺點：載量較小，一般只有8kb，可能會因缺少必須的調控元件而影響轉基因表達；盡管病毒載體被設計為復制缺陷型的，但在包裝細胞的包裝過程中，假設與整合型輔助表達基因組發生同源重組，就有可能組裝成野生型逆轉錄病毒顆粒，因此在構建具有商業價值的轉基因動物時，一般使用受到限制。操作繁瑣。 斑點雜交和PCR擴增Southern雜交Northern雜交表達產的檢測轉基因動物的檢測四、 轉基因動物的應用轉基因動物轉基因動物在生命科學根底研究中的應用轉基因動物在醫藥研究領域中的應用轉基因生物反響器多莉熒光小鼠轉基因山羊轉基因豬轉基因動物1 轉基因動物從屠宰場殺掉的奶牛體內收集 卵母細胞，并使之在體外成熟用公牛精液對成熟卵母細胞進 行體外