1、 PAGE 47 南京(nn jn)林業大學 本科畢業設計(shj)（論文）題 目：植物酯酶的提取及純化(chn hu)研究學 院： 化學工程學院 專 業： 環境工程 學 號： 070205223 學生姓名： 王康 指導教師： 范欽華 職 稱: 講師 二零一一 年 五 月 二十日摘 要 本文(bnwn)通過實驗條件篩選(shixun)，初步確定了小麥酯酶的提取純化(chn hu)方法及不同濃度的有機磷農藥對酶活性的抑制效果，結果發現：如下： 1.通過單因素條件改變實驗，確定了提取小麥粗酶液的固液比、溫度、緩沖液pH值、提取時間、小麥粉目數的最優條件。 2.通過一次鹽析及二次鹽析，確定了通過鹽析

2、法初步提純酶液的飽和度條件及提純效果。 3.驗證了超濾法在小麥酶液純化過程中去除鹽分的可行性及對酶液純化的效果。 4.通過Sephadex G100凝膠層析后，順利將酶液的比活力提高了7.2倍，確定了純化酶液的方法。 5.通過繪制毒死蜱對小麥脂酶的活性抑制標準曲線，確定了小麥脂酶對于有機磷農藥抑制作用的線性表現。AbstractIn this paper, the extraction and purification plants for lipase extraction and purification of the conditions, and the mapping of the

3、organic phosphorus pesticide on wheat lipase inhibition standard curve, through literature review and selection of experimental conditions, initially identified wheat lipase Extraction and purification method and explore the inhibitory activity of organophosphorus pesticides for the preliminary natu

4、re of the experimental results are as follows: 1.Conditions by changing a single factor experiment, the crude enzyme extract of wheat solid-liquid ratio, temperature, buffer pH, extraction time, the best wheat flour mesh conditions. 2.And the second by a salting salting salting method determined by

5、the initial saturation of purified enzyme solution conditions and the purification effect. 3.Validated ultrafiltration method in the wheat enzyme purification process to remove salt feasibility and effect of the purified enzyme. 4.By Sephadex G100 gel chromatography, the successful enzyme specific a

6、ctivity will be increased 7.2 times to determine the method of solution of pure enzyme. 5.By drawing on wheat of chlorpyrifos inhibited the activity of lipase standard curve to determine the organic phosphorus pesticide for wheat lipase inhibition of linear performance.目 錄前言(qin yn)61.文獻(wnxin)綜述7 1

7、.1有機磷農藥(nngyo)7 1.1.1有機磷農藥的特點7 1.1.2有機磷農藥的毒性7 1.2農藥檢測方法8 1.2.1分析檢測法8 1.2.2酶抑制法10 1.2.3兩種酶抑制法比較11 1.2.4動物膽堿脂酶法11 1.2.5植物脂酶抑制法14 1.3植物脂酶的純化及檢測15 1.4總結15實驗藥品、器材及方法17 2.1.1實驗藥品與材料17 2.1.2實驗器材17 2.2試劑配置17 2.2.1磷酸緩沖液配置17 2.2.2 0.8%固蘭B鹽溶液（顯色劑）配置18 2.2.3-乙酸(y sun)萘脂丙酮溶液18 2.2.4考馬斯亮藍（顯色劑）配置(pizh)18 2.2.5小麥粉制

8、取18 2.3實驗(shyn)步驟19 2.3.1-奈酚標準曲線繪制19 2.3.2粗酶液提取19 2.3.3酶活的測定19 2.3.4蛋白質含量測定19 2.3.5硫酸安鹽析20 2.3.6超濾20 2.3.7凝膠柱層析20 2.3.8毒死蜱抑制率曲線制作21實驗結果22 3.1 -萘酚標準曲線22 3.2蛋白質標準曲線22 3.3粗酶液提取單因素條件結果23 3.3.1固液比23 3.3.2培養時間24 3.3.3緩沖液pH值24 3.3.4培養溫度25 3.3.5小麥粉目數26 3.3.6粗酶液提取優化條件總結26 3.4一次鹽析26 3.5二次鹽析29 3.6超濾29 3.7凝膠柱層析

9、29 3.8毒死蜱對酶活抑制標準曲線314.實驗(shyn)結論32致謝(zh xi)33參考文獻34前 言農藥作為重要的農業生產資料，在農產品生產中對病、蟲、草、鼠害的防治起到了非常重要的作用，為人類(rnli)創造了巨大的經濟效益，但同時也給環境安全和人體健康帶來了一定威脅。在農業生產中應用的農藥主要可分為四大類:第一類是以滴滴涕、六六六為代表的有機氯殺蟲劑，這類殺蟲劑由于致畸、致癌、致突變、高殘留等缺點，已停止生產和使用;第二類是有機磷殺蟲劑;第三類是氨基甲酸酷類殺蟲劑;第四類是擬除蟲菊酷類殺蟲劑。在所有的農藥中，有機磷農藥是目前最常用的一類農藥，它包括殺蟲劑、殺菌劑、除草劑等，具有品種

10、多、防治對象多、殺蟲效率高等特點，在各種農作物尤其是水果蔬菜生產中廣泛應用。有機磷農藥(nngyo)中的部分品種具有高毒性的特點，大量使用會造成環境污染、作物藥害及人畜中毒。大多數有機磷農藥(nngyo)具有手性，它們的一對對映異構體之間存在著不同的生物活性，包括毒性、酶抑制活性和生物降解(shn w jin ji)能力等。通過非手性分析得到的農藥濃度所指示的可能與實際的生態毒理學效應并不相符，所以隨著人類對環境污染物認識的不斷深入，在對映體水平上研究農藥的環境毒理學將會成為必然。近年來，由蔬菜中有機磷農藥殘留所引起的中毒現象十分嚴重。據世界衛生組織統計，全世界每年農藥中毒人數約30萬人，其中

11、有機磷農藥中毒占70%。我國專家對為數眾多的農藥品種進行分級排隊，從中篩選出的十種強污染農藥中，有七種屬于有機磷類，可見，農藥殘留檢測的重點應該放在有機磷類殺蟲劑。目前，在我國農藥殘留快速檢測技術應用最多的是酶抑制法，其較高的靈敏性、準確性及低成本等優點已受到人們的廣泛關注。酶抑制檢測法由于具有能在短時間內檢測大量樣本，成本低、對操作人員技術要求不高、易于在農產品生產基地和批發市場推廣等優點而受到廣泛重視。本法的關鍵材料是敏感酶源，植物醋酶作為酶抑制法的生物識別元件由于其來源廣泛、價格低廉，而且檢測的靈敏性好，檢測限低，可以滿足農藥殘留檢測普及化、市場化的要求，近年來得到了較多的關注，但深入研

12、究較少。因此本文選擇小麥為酶源，深入研究了粗酶液提取的最佳條件，酶的進一步分離純化以及毒死蜱對于小麥脂酶的抑制的線性性質。1.文獻綜述1.1有機磷農藥(nngyo)1.1.1有機磷農藥(nngyo)的特點 早在20世紀30年代，德國的SChrader就合成了一系列有機磷酸醋類化合物，并發現其中一些具有殺蟲殺瞞活性。目前全世界有機磷殺蟲劑的品種約為100余種，常用的有50多種。我國農藥市場上有機磷品種30余個，占我國殺蟲劑品種的38%，而產量卻占75%。有機磷殺蟲劑作為(zuwi)我國使用最廣泛、用量最大的一類殺蟲劑，其品種繁多，性能也千差萬別。綜合起來主要具有以下幾個方面的特點1:絕大多數有機

13、磷殺蟲劑在堿性條件下易分解。因此，不能與堿性物質混用在自然環境和動植物體內易降解。因此，在高等動物體內無累積毒性，正確使用時殘留問題小，不致污染環境。殺蟲效率高，廣譜，作用方式多樣(如觸殺、喂毒、熏蒸)，不少品種為內吸殺蟲劑，且許多品種同時又是殺瞞劑。化學結構復雜多變，品種多，適用范圍廣。毒性差異大。辛硫磷、馬拉硫磷、敵百蟲等毒性低，而對硫磷、甲拌磷為劇毒品種。總的來說，有機磷殺蟲劑的毒性偏高。易解毒。對有機磷殺蟲劑引起的急性中毒有特效的解毒藥，如解磷定和阿托品。與有機氯農藥、擬除蟲菊醋類殺蟲劑相比，害蟲對有機磷殺蟲劑的抗藥性發展緩慢。1.1.2有機磷農藥的毒性 目前國內外普遍使用的有機磷農藥

14、被認為是非持久農藥，其降解半衰期一般在幾周至幾個月。研究表明，有機磷農藥在某些環境條件下也會有較長的殘存期，并在動物體內產生蓄積作用;模擬實驗也顯示，在模擬降雨19d后，在地表徑流中仍能檢測到痕量的有機磷農藥。據研究，對硫磷在蘋果上降解半衰期為15一17d，在儲存期，殘留于蘋果上的對硫磷的降解半衰期為13d2；;；長期食用農藥殘留超標的農副產品，雖然不會導致急性中毒，但可能引起人和動物慢性中毒，導致疾病的發生，甚至影響到下一代。試驗證實，農藥可能破壞某個特定的身體器官比如肝臟、腎、骨髓等，而且還會改變酶的活性，長期接觸農藥還會對人體有致畸、致癌作用。有關流行病學調查顯示，惡性腫瘤的發病率逐年上

15、升與蔬菜中的農藥殘留有關。 作為典型的酶毒劑，有機磷農藥可以通過消化道攝入，也可以通過皮膚(p f)、粘膜、呼吸道吸收3。有機磷的急性毒性主要歸因于對膽堿能神經突觸后膜上的乙酞膽堿醋酶活性的抑制，使酶不能起催化乙酞膽堿水解的作用，導致組織中能使神經過度興奮的乙酞膽堿過量蓄積。這種乙酞膽堿傳導介質代謝紊亂，可導致遲發性神經毒性，引起(ynq)運動失調、昏迷、呼吸中樞麻痹、癱瘓甚至死亡。有實驗證明對氧磷和對硫磷酞化人腦膽堿醋酶一般約經4天即“老化”，酶活不易再恢復4。2農藥檢測(jin c)方法1.2.1分析檢測法 農藥殘留分析方法是對待測樣本中痕量農藥殘留進行定量和定性分析的技術，農藥殘留分析技

16、術既需要精細的微量操作手段，又需要高靈敏度的痕量檢測技術。目前常用的方法包括色譜法、超臨界流體技術以及近些年來發展迅速的快速檢測法。(l)超臨界流體技術超臨界萃取技術 超臨界流體萃取技術(supereritiea一FluidExtraetion，sFE)是利用超臨界流體(SF)密度大、粘度低、擴散系數大、兼有氣體的滲透性和液體的分配作用的性質，將樣品中的待測物質溶解并從基體中提取出來的一種新的分離技術。它能同時完成萃取和分離兩步操作，分離效率高、操作周期短、傳質速度快、溶解力強、選擇性高、無環境污染。近年來，SFE技術在農藥殘留分析中的應用隨著SF的性質、萃取機理、過程控制的深入研究而日益(r

17、y)廣泛，并顯示其獨特的優勢。Juhler在用SF技術研究牛肉中的有機磷農藥(OPS)和非有機磷農藥(NOPS)及其混合物的殘留量時，對超臨界CO:的溫度、壓力、流量和提取時間對回收率的影響進行了考察，選擇了適合不同樣品(yngpn)、不同農藥類型的操作條件，獲得較好的回收率78%一95%和滿意的檢出限0.01一0.03m叭g，并確定了適合幾種農藥殘留(cnli)聯合分析的萃取條件5。將SFE萃取過程與氣相色譜(GC)、液相色譜(HPLc)、毛細管柱液相色譜一GC聯用可實現過程的自動化，減少樣品用量、縮短分析時間、提高重現性、靈敏度和檢出限。超臨界流體色譜技術 超臨界流體色譜技術(S叩erer

18、itiealFluidChromatogaphy，SFC)是以超臨界流體為色譜流動相的分離技術，可以在較低溫度下分析分子量較大、對熱不穩定的化合物和極性較強的化合物;可與各種氣相、高效液相色譜檢測器匹配;可與紅外、質譜聯用。SFC彌補了GC和HPLC的不足，適用于分析熱不穩定而HPLC又不易分析的化合物。許多在GC或HPLC上需要經過衍生化才能分析的農藥，都可以用SFC直接測定。SFC可與SFE直接相聯，使樣品的提取、凈化和測定一次完成。SFC與火焰光度檢測器連接還可以分析番茄和洋蔥中的樂果、馬拉硫磷等。(2)色譜法 色譜法是根據分析物質在固定相和流動相之間分配系數的差異達到分離目的，當樣品混

19、合物在兩相相對運動時，各組分在兩相中反復多次重新分配，結果使混合物得到分離，通過將被分析物質的濃度轉換成易被測量的電信號(電壓、電流等)，并送到記錄儀記錄下來。目前應用于農藥殘留檢測的色譜法主要有薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法薄層色譜。薄層色譜法 薄層色譜法是利用(lyng)被檢測物經顯色后同標準有機磷農藥(OPS)比較來定性，用薄層(bo cn)掃描儀來定量的測定方法。薄層色譜法顯色反應類型多，顯色劑范圍廣，快速，具有(jyu)不受物質的限定，在方法設計、擬定和實際應用上機動靈活，適用于對多種農藥檢測與鑒定。薄層層析法設備簡單，操作方便，展開時間短，定性分離效果好，適用于微量成分的分

20、離和鑒定，也應用于各種有機化合物如親水性物質或親脂性物質等的分離、精制和鑒定分析。20世紀70年代，Kumar等對膽堿酷酶使用的顯色基質及薄層定量方法進行了研究，近年來，國內開始關注植物膽堿酷酶的研究。楊娟，阮長青等利用有機磷農藥抑制植物膽堿酷酶活性的原理，確定了小麥膽堿酷酶液與Q一乙酸蔡醋的酶促反應過程中的最大吸收波長、顯色溫度、顯色時間以及酶液稀釋倍數。通過酶抑制法與薄層層析的逐步分離過程相結合分析實現了10種常用有機磷農藥的定性分析6，為分離有機磷農藥多殘留以及植物膽堿酷酶抑制法快速檢測有機磷農藥殘留的深入研究提供依據。氣相色譜法 氣相色譜法(GC)是以惰性氣體為流動相的柱色譜分離技術，

21、是目前檢測有機磷農藥的國家標準方法，該方法是利用經提取、純化、濃縮后的OPs注入氣相色譜柱，程序升溫氣化后，不同的OPs在固定相中分離，經不同的檢測器檢測掃描繪出氣相色譜圖，通過保留時間來定性，通過峰或峰面積與標準曲線對照來定量。具有即定性又定量、準確、靈敏度高，并且一次可以測定多種成分的優點。美國的EPAMethod1657就是使用GC來測定城市和工業廢水中的45種有機磷農藥;袁慧娟，宋國新等采用GC從s技術對上市蔬菜中有機磷類農藥(甲胺磷、敵敵畏、久效磷、馬拉硫磷等9種)殘留同時測定。蔬菜樣品經超聲波提取、簡單的凈化處理后可直接進樣分析。樣品加標回收率在70%一127%之間，檢測限為0.0

22、20.20mg/kg7。該分析方法簡便、快速、準確，適用于蔬菜中農殘的定性定量分析。高效(o xio)液相色譜法 高效液相色譜(HPLC)是以液體為流動相采用高壓輸液泵、高效固定相和高靈敏度檢測器等裝置的一種柱色譜分離技術，常用于揮發及熱不穩定性的農藥殘留分析。李永新等采用高效液相色譜柱分離、紫外檢測以及外標法定量，建立了同時測定蔬菜水果中12種農藥殘留的反相(fn xin)高效液相色譜分析方法。該方法的檢測限為0.014林留L一0.0266協留L;在水果中的平均加標回收率為62.2%一118.2%，在蔬菜中的平均加標回收率為52.1%一124.6%8。陳珠靈等采用高效液相色譜法對蔬菜中甲基對

23、硫磷、乙基對硫磷、甲拌磷進行同時分離和檢測，以Shim一packVP一ODS為分離柱，紫外檢測波長為250nm，該方法(fngf)所測得的3種有機磷在0.02g/L一2.0g/L范圍內具有良好的線性，檢出限達1.0g/L一5.0g/L，加標回收率在97.44%一101.22%9。1.2.2.酶抑制法 目前檢測有機磷農藥殘留普遍采用的方法如色譜法、超臨界流體技術，檢測結果準確，靈敏度高，但成本高，測定時間長，且需要具有一定技術水平的專業人員才能進行操作，只適合在實驗室分析;而近些年來興起的酶抑制法具有操作簡便，速度快，適合現場檢測、大批樣品篩選檢測以及我國小規模、分散的銷售體系中經常性的現場快速

24、檢測，因此作為一種檢測農藥的常用方法得到廣泛應用。而如何選擇酶源是實現快速、準確檢測的關鍵。 膽堿脂酶廣泛存在于動物的組織中，1953年stedman等首先從馬血清中分離出乙酞膽堿脂酶，此后不同來源的乙酰膽堿脂酶相繼得到純化和研究10。目前已分離純化的動物來源的乙酰膽堿脂酶主要集中(jzhng)在動物肝臟和血液，如豬肝，雞血等。也有利用蛆蝴以及海洋魚類，甲殼類動物的神經組織(zzh)，腦組織分離乙酰膽堿脂酶1113。近年來很多學者致力于從昆蟲體內提取乙酰膽堿脂酶如:家蠅、麥二叉蚜、黃猩猩果蠅、煙草天蛾、光葉庫蚊、黃粉甲、美洲淤夜蛾、豆莢草盲蜷、馬鈴薯葉甲、騷擾角蠅、棉鈴蟲等。迄今為止，酶抑制法

25、進行農藥殘留檢測以從敏感家蠅中提取的乙酰膽堿脂酶效果最佳，其敏感性優于其他來源的乙酰膽堿脂酶，更有進一步研究表明，家蠅羽化后2一3d時其頭部的乙酰膽堿脂酶敏感性最高。植物來源的脂酶作為農藥殘留檢測的三種酶標記物之一，由于其來源廣泛、價格低廉，近年來得到了較多的關注。但是，幾乎所有的研究都是直接以面粉作為酶源，篩選用于農殘檢測的最佳小麥品種或者是以面粉作為酶標記物，制成酶片，對酶片檢測農殘顯色反應的溫度、時間、顯色劑的選擇等方面進行比較研究。尚未見到用提取純化的酷酶制品(zhpn)對大量有機磷農藥的靈敏性和最低檢測限進行研究的報道。1.2.3兩種酶抑制法的比較 酶抑制法測定有機磷農藥殘留是根據有

26、機磷農藥的毒性對酶分解底物的抑制作用進行的，其酶源有來自動物的膽堿酷酶和從植物中提取的植物酷酶。動物膽堿酷酶法是基于有機磷農藥的毒性抑制乙酞膽堿酷酶催化底物水解生成乙酸和膽堿，后者與5，5一二硫代一雙一2一硝基苯甲酸反應，生成黃色產物5一硫代一2一硝基苯甲酸，其在410nln處有最大吸收，測定其在單位時間內的生成量，即可測得乙酞膽堿酷酶的活性。植物酷酶可以催化乙酸蔡酷水解為蔡酚和乙酸，蔡酚與顯色劑固B作用形成紫紅色的偶氮化合物，從而發生顯色反應，具體反應見下式。 有機磷農藥能抑制植物脂酶的活性，使反應(fnyng)速率發生變化，紫紅色的偶氮化合物產量(chnling)不同，吸光度值也不同，即酶

27、的活性受到抑制的程度不同14。很多學者經過大量實驗，比較了動物脂酶和植物脂酶反應(fnyng)的條件、總脂酶活力和靈敏度，并對其檢測條件進行了優化。2004年黃志勇等比較了快速測定蔬菜中有機磷農殘的膽堿脂酶抑制法和植物脂酶抑制法，并通過正交實驗優化了兩種酶抑制法的測定條件。結果發現兩種酶抑制快速測定方法均可用于蔬菜中有機磷農殘的測定，其加標回收率都達到85%以上，但植物脂酶法測量精密度更勝一籌14。而后對植物脂酶和動物脂酶在不同pH值下的酶活、抑制程度等性質進行的實驗研究也表明了動物脂酶中的蒼蠅酶、蠅蛆酶與植物脂酶中的小麥脂酶相比，它們的活力和被農藥抑制程度處于相近的水平15。可見，植物酷酶與

28、動物酷酶均可用于蔬菜中有機磷農藥殘留的快速測定，而且兩種酶抑制法測量的精密度都較好，準確度也相當。與動物脂酶相比，植物脂酶的酶活、抑制程度等各項指標均不遜色。此外，植物脂酶具有來源方便、成本低的優勢，能夠穩定而準確地檢測到濃度為10-3mol/L的敵敵畏，達到了其安全限值16。1.2.4動物(dngw)膽堿脂酶法 自從1951年發現有機磷農藥(nngyo)在體外也能抑制膽堿脂酶以來，絕大多數研究都是基于動物膽堿脂酶這一原理進行的。目前，膽堿脂酶法檢測有機磷的方法主要有酶片法、酶抑制分光光度法以及膽堿脂酶生物傳感器法。(1)酶片法酶片法是將敏感生物的膽堿脂酶和生色基質液經固化處理后加載到濾紙片或

29、類似載體物質上，基質在膽堿脂酶的催化作用下迅速分解，生成膽堿(藍色）和乙酸。有機磷和氨基甲酸酷農藥對膽堿脂酶有抑制作用，使催化、水解、變色的過程發生改變。將膽堿脂酶與樣品提取液反應，若膽堿脂酶受到抑制，基質就不能水解、不變色，表明(biomng)樣品中含有機磷和氨基甲酸脂類農藥(呈陽性)。目前廣泛使用的速測箱、速測卡法均屬于酶片法。近年來國內常見的用固化含有膽堿脂酶和靛酚乙酸醋試劑的試紙片建立的適合我國蔬菜中部分農藥殘留限量的現場監督檢測的速測卡法，其檢出限一般在0.3一3.5m叭g，檢出時間為15min，操作簡單，速度快，測試成本低廉17。也有學者利用馬血清中的乙酰膽堿脂酶與底物氯化乙酞膽堿

30、作用，根據反應前后的pH值變化及指示劑的顏色變化情況，建立的一種可以作定性及半定量分析的酶片快速檢測法，應用于實際檢測黃瓜中農藥殘的效果較好18。在國外方面，Hwa一YoungNO和YoungAhKim等用涂有乙酰膽堿脂酶的試紙檢測樣品中農藥殘留的含量，實驗表明以HybondN+為酶載體，苯基乙酸脂為底物最合適，此時有機磷和氨基甲酸酷類農藥的檢出限分別為:10-6102和10-6100g/mL，實驗還發現:與對氧磷相比，試紙法對被氧化的對氧磷更敏感19。(2)酶抑制分光光度法 有機磷類農藥對乙酰膽堿脂酶活性有抑制作用，濃度越高，抑制率越高。通過分光光度計測定吸光度隨時間的變化值，并與空白對照比

31、較求得酶抑制率，從而判定樣品中是否有有機磷或氨基甲酸酷類農藥的存在。該法所需儀器設備簡單、靈敏度高、前處理簡單、檢測時間短，可及時檢測含農殘的蔬菜。曾有報道以雞腦為酶源提取乙酞膽堿醋酶，利用酶抑制分光光度法檢測油白菜中有機磷農藥(對硫磷、辛硫磷、氧化樂果)的殘留量，可使3種農藥的回收率分別達到97%，101%和99%。Ingridwalt等從鐮刀菌pisi中提取角質酶，利用酶抑制分光光度法和%孔板法同時檢測多個樣品中有機磷和氨基甲酸酷類殺蟲劑的含量，該法對毒死蟀和對氧磷的檢測限分別為2.6mg/L和0.04mg/L。(3)膽堿(dn jin)酷酶生物傳感器膽堿醋酶生物傳感器法是目前農藥殘留速測

32、技術中的研究熱點，其在研究方法多樣化、靈敏度、準確性、響應時間等方面都具有很大優勢。方法較為多樣化，主要包含了電化學型、光化學型以及壓電型，與本文關系不大，不做具體(jt)介紹。1.2.5植物(zhw)脂酶抑制法 酶法快速檢測農藥殘留的方法中，多采用敏感家蠅頭部獲得的乙酞膽堿醋酶，但是動物酷酶常表現為保持期短，需冷凍低溫保存。而植物酷酶酶源豐富，提取和保存較為方便，只需以一定比例的水或緩沖液混合離心獲得的上清液即可作為粗酶液，并在一4保存即可。而且與動物醋酶相比，植物酷酶抑制法的測量準確度和精密度均不遜色，能達到快速檢測農藥殘留的目的。1987年，中國農業部環保所研制出一種酶片和顯色基質片，不

33、需儀器，即可在田間或菜市場快速測定蔬菜和水果中的有機磷類農藥，其檢測限為0.5一10mg/kg。而后有人利用自制的植物酶片和高靈敏度化學檢測液(速測靈)，使檢測出有機磷農藥殘留的靈敏度達到0.4一10mg/L和0.18一10mg/kg，檢測時間為5一10min，檢測成本為0.2一0.3元人民幣20,21。至此，植物酷酶法檢測有機磷農藥殘留開始受到了研究學者的廣泛關注，各方面的研究也隨即展開。在酶源的篩選方面，依據對有機磷農藥的敏感性而定，許多研究者直接從面粉中提取酶，但不同的小麥酶對農藥的敏感性不同即使對于同一品種小麥，產地不同、種植方法不同、所處生長期不同時，其對農藥的敏感度也會存在較大差異

34、。因此，需要作進一步的研究，以確定可以進行定量分析而且具有互換性的植物脂酶酶源。在顯色液方面，由于酶抑制法檢測農藥殘留常需借助于固藍B鹽和乙酸萘脂組成的生色基質液的顯色完成。但該顯色液非常不穩定，在室溫下40min以后顯色能力大大下降，不能再用來測定，需現用現配，這給檢測工作帶來了諸多不便23。為此，董超等改進了顯色劑的配方，將其制成固體顯色劑，大大延長了顯色劑的有效使用期限，使其在室溫下放置3個月后性能不變，且該法對甲胺磷、敵敵畏、對硫磷、辛硫磷等的檢出濃度為10-410-7（V/V）24。也有學者改用其它顯色劑一2，6一二氯乙酰靛酚，先用植物酷酶水解橙色的2，6一二氯乙酸靛酚，然后用分光光

35、度法測定分解的靛酚(藍色)吸光度，計算可得有機磷的含量，該法對常用的幾種有機磷及氨基甲酸脂類農藥的測定限均在0.0015一0.3300mg/L范圍內。通過進一步實驗比較兩種不同顯色劑(2，6一二氯靛酚乙脂和固藍B鹽的顯色原理與性能，證實了采用2，6一二氯靛酚乙酷既兼顧了底物和顯色劑的雙重作用，且從顯色底物液使用的方便程度、穩定性以及便于現場快速檢測等方面看，使用2，6一二氯靛酚乙醋顯色劑比用固藍B鹽來顯色更具有優越性25,26。進一步研究還發現了小麥酷酶活性與保存溫度的關系:在20儲存sd酶活只剩余39.6%，在4儲藏sd剩余75.6%，酶活衰退較快，而將該酶用液氮在一1%保存sd，酶活仍有9

36、7.5%，可見酶的保存需要較低的溫度177。近年來研究人員主要利用酶固定化技術解決酶液難以貯藏的問題，如用離子交換樹酷作為固定化載體對植物酷酶進行固定化，不僅可使酶的穩定性大大提高，而且與游離酷酶相比，對農藥抑制的響應敏感性也有明顯的提高。也有選用聚苯乙烯微孔反應板作為酶的載體，將自制的植物醋酶固定在載體上的微孔內壁表面，制成農藥快速檢測板，檢測有機磷和氨基甲酸酷類農藥的靈敏度可達0.01mg/kg0.lmg/kg。最近有報道采用原位溶膠一凝膠法制備PVA/SiO2有機/無機雜化溶膠，并將顯色劑和植物酷酶分散于溶膠中，制成一類親水一親丙酮可調，貯存性好的傳感膜。固定于該雜化膜中酶的穩定性在冷藏

37、和室溫條件下均比在溶液狀態下有明顯提高。由此可見，酶的固定化方法在檢測農藥殘留中將起到非常重要的作用。1.3植物脂酶的純化(chn hu)及檢測 關于酷酶的提取純化，國外的研究大多集中在從假絲酵母(jiom)、霉菌、假單胞菌、細菌、鏈球菌、乳酸菌、醋酸菌等菌類中提取，只見到ChristinaeStuhleflder等通過硫酸錢鹽析沉淀、Q一sPeharose層析等步驟提取西紅柿中的植物酷酶27。國內也僅見到紀淑娟等通過水提取、離心、硫酸餒鹽析沉淀以及Sephadex G200凝膠層析從小麥種子中提純醋酶。關于農藥殘留檢測(jin c)用植物酷酶的來源，近年來有很多的研究報道直接以市售面粉作為酶

38、原，用面粉中的植物醋酶檢測農藥殘留，在面粉中按一定比例加入蒸餾水，振蕩離心所得溶液即為檢測用的脂酶溶液。少見有人對植物脂酶的提取、純化工藝進行進一步的研究確定。 1.4小結(xioji) 本章介紹了有機磷農藥的特點、毒性及其酶抑制活性等方面的研究(ynji)情況，綜述了國內外對酶抑制法檢測有機磷農藥的研究進展。綜上所述，筆者認為(rnwi)，目前植物脂酶的研究多為直接用面粉作為酶源，研究具體測定方法，缺少對植物脂酶這個檢測材料進一步純化的研究，而此項研究對于為進一步提高酶抑制法測定農藥的效果以及提高酶抑制法的實際應用性能提供必要的理論支持是十分必要的;隨著人們對蔬菜中農藥殘留及食品安全性問題的

39、關注，進一步探索更有效的分離純化方法，更大程度地提高植物醋酶法的檢測靈敏度和準確性也具有較大的現實意義。此外，研制便宜、簡便、準確的農藥速測儀器，盡快將研究成果投入實際運用;對植物醋酶的結構進行研究，明確其作用靶標部位都是該領域值得研究的方向。2實驗(shyn)部分(b fen)2.1實驗材料(cilio)與器材2.1.1藥品、試劑與材料 丙酮、甲醇、甲醛、乙醇（95%)、磷酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸銨、氯化鈉 -乙酸萘脂 -萘酚 固蘭B鹽 考馬斯亮藍 微孔濾膜 超濾膜 Sephadex G100凝膠 小麥種子 毒死蜱 壓縮(y su)氮氣2.1.2實驗(shyn)器材 高速(o s)粉

40、碎機 檢驗篩（20目100目） 恒溫水浴振蕩器 恒溫水浴鍋 臺式高速離心機 紫外可見分光光度計 層析柱2.2.試劑配制2.2.1磷酸緩沖液 22.24g磷酸二氫鈉定容至1L得0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液 73.2g十二水合磷酸氫二鈉定容至1L得0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液按下表混合后可得不同PH值的緩沖液。表2.1pH值0.2mol/LNa2HPO4溶液（%）0.2mol/LNaH2PO4溶液（%）5.88.092.05.910.090.06.012.387.76.531.568.57.061.039.07.584.016.08.094.75.32.2.2 0.8%固蘭B鹽溶液（顯色劑）稱

41、取3.6g SDS溶解(rngji)于100ml蒸餾水，稱取0.8g固蘭B鹽，加入SDS溶液中溶解，用微孔(wi kn)濾膜過濾，濾液即為固蘭B溶液。2.2.3-乙酸萘脂丙酮(bn tn)溶液 稱取0.3724g-乙酸奈脂，溶于丙酮后定容至50mL。2.2.4考馬斯亮藍準確稱取350mg考馬斯亮藍溶于100mL95%的乙醇中，然后加入2O0mL88%(w/v)的磷酸，得到Bradford儲存液;取30mLBradford儲存液，并加入30mL88%的磷酸、1m5L9%5的乙醇、425mL蒸餾水，得到Bradford工作液50OmL，然后用1號濾紙過濾，室溫保存于棕色瓶中備用。2.2.5小麥粉制

42、取把挑選好的小麥種子置于高速粉碎機中粉碎，打開開關，每粉碎10秒需關閉20秒，防止過熱而使小麥脂酶失活。粉碎完畢后過篩收集至廣口試劑瓶保存與冰箱中。2.3實驗方法2.3.1-奈酚標準曲線繪制 稱取0.0036g-奈酚，溶解于蒸餾水定容至100mL，得0.25mol/mL溶液。 用移液管分別移取2.5mL、2.0mL、1.5mL、1.0mL、0.5mL-萘酚溶液，用緩沖液稀釋至3mL，再取3mL緩沖液作空白。 在6支25mL比色管中分別加入上述溶液和0.5mL0.8%固蘭B鹽-3.6%SDS顯色劑，置于30攝氏度恒溫水浴5min后做光譜掃描，并在最高吸收峰測吸光度。 用測得的結果做標準曲線2.3

43、.2粗酶液提取稱去一定量制得的小麥粉與一定量緩沖液充分(chngfn)混合后于恒溫水浴振蕩器中培養一定時間后將充分混合的液體于在臺式高速離心機中于8000rpm離心10min，得粗酶液。2.3.3酶活的測定(cdng)參照李紹中等方法并加以改進。將酶液按一定(ydng)比例稀釋，取3 mL稀釋酶液，加入0.5mL的0.04mol/L-乙酸萘酯丙酮溶液，漩渦震蕩均勻，30恒溫水浴5 min。之后加入0.5mL 0.8%固蘭B鹽-3.6%SDS混合溶液，漩渦震蕩均勻，于30恒溫水浴5 min。用未加-乙酸萘酯的反應液作空白，待1 min讀數穩定后在595nm處讀取OD值。計算酶液的活性：式中，E酯

44、酶活性，U/mL；C酶液的稀釋倍數；k-萘酚標準曲線的斜率；y-萘酚標準曲線的截距；OD反應液的吸光度；V反應酶液的體積，mL；U酶活單位，mol/min。282.3.4蛋白質含量測定取0.5克酶液于比色管中，加入5mL考瑪斯亮藍工作液，混合后于37保溫10min后于595nm測吸光度，對應標準曲線得到蛋白質含量。2.3.5硫酸銨鹽析單次鹽析在提取好的粗酶液中加入一定量的硫酸銨，緩慢加入確保完全溶解以防止局部濃度過大，待硫酸銨全部溶解后將酶液放入冰箱中，24h后將酶液取出，與臺式高速離心機中離心10min，將上清液取出測酶活及蛋白質含量。二次鹽析在提取好的粗酶液中加入一定量的硫酸銨，緩慢加入以

45、確保全部溶解后，放入冰箱中。24h后取出，離心(lxn)并棄去沉淀后在上清液中再加入一定量硫酸銨，放入冰箱，24h后取出并離心。離心后取沉淀溶解，得到鹽析提純后的酶液。2.3.6超濾 將鹽析(yn x)后的酶液用1號 所得酶液倒入組裝好的超濾器中，接通(ji tn)壓縮氮氣，以0.15MPa超濾24h。得到超濾后的酶液。2.3.7凝膠柱層析 Sephadex G-100凝膠預處理 A.100ml燒杯，稱取5克sephadex G-100,加入50ml去離子水，浸泡溶脹24小時。 B.傾去sephadex G-100溶脹后凝膠上層的水，加入凝膠等體積的1.0 mol/L NaOH液處理，用攪棒輕

46、輕攪動，并浸泡1小時處理后傾去。用去離子水洗滌。洗滌過程中，用傾去法除去 細顆粒。其方法是用攪棒將凝膠攪勻（注意不要過分用力攪拌，以防止顆粒破碎），放置數分鐘，將未沉淀的細顆粒隨上層水倒掉。浮選3-5次，直至上層沒有細顆粒為止，再浸泡水洗至PH中性。 C.將Sephadex G-100凝膠水溶液盛放于抽濾瓶中，用洗耳球塞住杯口，減壓抽氣30分鐘，除去凝膠溶液內的氣泡，將脫氣后的凝膠溶液輕輕倒入燒杯中，其中盛有1/2去離子水。 裝柱 A.層析柱(1.050cm)用水清洗干凈，柱的上、下端聯接塑料管接上小乳膠管，裝上螺旋夾。將層析柱垂直裝好。校直過程用下端綁有鑰匙的繩子掛于鐵架的不同位置，從多角度

47、校正使柱垂直。打開柱上端口，從柱底下出口管朝柱內注入水，使柱底全部充滿水而不留氣泡，關閉柱出口。最終柱內留存有2 cm的水。從出口處接上一根直徑2 mm細塑管，塑管另一端固定在柱的上端部位。 B.攪動凝膠溶液（切勿攪動太快，以免空氣再逸入），使形成均一的薄膠漿，并立即沿玻棒倒入層析管內，讓加入的凝膠在柱內自然(zrn)沉降，待柱底面上積起約1-2 cm的凝膠床后，打開柱出口水流。隨著柱內水的流出，上面不斷加入凝膠液，使形成的凝膠床面上有凝膠連續(linx)下降（如果凝膠床面上不再有凝膠顆粒下降，應該用攪棒均勻地將凝膠床攪起數厘米高，然后再加凝膠，不然就會形成界面，影響層析效果）。 C.凝膠沉積

48、到柱內凝膠是否均勻，有否“紋路(wn l)”或氣泡。若層析柱不均一，必須重新裝柱。洗脫 在裝好的層析柱中加4mL二次鹽析后的酶液，在梯度洗脫器的一端加蒸餾水，一端加0.2mol氯化鈉溶，液調節蘭格蠕動泵轉速為3.5rpm，梯度洗脫，并打開電腦記錄洗脫液在280nm處的吸光度，并用自動收集器收集洗脫后的液體。待出現吸收峰后穩定一段時間，不再有吸收峰出現后，取吸收峰附近時間的洗脫液測酶活及蛋白質含量。2.3.8毒死蜱抑制率曲線制作 取0.5mL485g/L的毒死蜱，用一定量水溶解后用石油醚混合于分液漏斗中，靜置分層，萃取后將石油醚定溶至50mL，再將其稀釋，直至濃度為48.5mg/L，分別將其稀釋

49、到24.25mg/L、19.4mg/L、14.55mg/L、9.7mg/L、4.85mg/L，各取0.5ml與0.5ml的酶液混合均勻后測定酶活，并取以份不加農藥的酶液作為參照，于分光光度計606nm處測吸光度，以毒死蜱濃度為X軸，酶活力抑制率為Y軸繪制標準曲線。3.實驗(shyn)結果3.1-萘酚標準(biozhn)曲線表3-1-萘酚含量0.0050.0100.0150.0200.025吸光度0.1590.3240.5040.6720.817 測得上表數據后，依照(yzho)實驗方法繪制下圖，得到-萘酚標準曲線如圖圖3-1： 圖3-13.2蛋白質標準曲線數據應用自：胡曉燕，有機磷農藥對植物醋

50、酶的抑制及應用研究得到蛋白質標準曲線圖3-2：3.3粗酶液提取單因素(yn s)條件結果3.3.1固液比圖3-3分別(fnbi)稱取10g小麥粉置于5個錐形瓶中。量取60mL，70mL，80mL，90mL，100mL緩沖液，倒入5個錐形瓶中與小麥粉充分(chngfn)混合。將混合好的錐形瓶固定于恒溫水浴振蕩器中，以185rpm，40培養4小時。培養完成后，離心取得粗酶液稀釋并測酶活，得到1:7固液比下有最高酶活力0.348U/mL。以其為100%得到圖3-3，并確定(qudng)最佳固液比為1:7.3.3.2培養時間圖3-4：分別(fnbi)稱取10g小麥粉置于8個錐形瓶中，以1：7固液比與緩

51、沖液混合均勻放置(fngzh)于恒溫水浴振蕩器中，在185rpm，40下分別(fnbi)培養1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h。每個樣培養完成后于高速臺式離心機以8000rpm離心10min得粗酶液，稀釋并測酶活，得到酶活力在4h時有最大值0.461U/mL，以其為100%作圖得圖3-4，并確定最佳培養時間為4h。3.3.3緩沖液pH值圖3-5：按表2.1配得pH為6、6.5、7、7.5、8的緩沖液，分別(fnbi)量取70mL后與10g面粉充分(chngfn)混合后置于恒溫水浴振蕩器上以185rpm、40培養4h，培養結束(jish)后于高速臺式離心機以8000rpm離心10mi

52、n后得粗酶液，稀釋并測酶活，得到pH=7.5時有最大酶活力0.236。以其為100%作圖，得到圖3-5，并確定最佳pH值為7.5。3.3.4培養溫度圖3-6：分別稱取10g小麥粉置于6個錐形瓶中，以1：7固液比用pH7.5緩沖液充分混合后置于恒溫水浴振蕩器中，以185rpm培養，調節培養溫度分別為20、25、30、35、40、45，培養4h后于高速臺式離心機以8000rpm離心10min后得粗酶液，稀釋并測酶活，得到在35時有最大酶活0.222U/mL。以改值為100%作圖，得圖3-6，并確定最佳提取溫度為35。3.3.5小麥粉目數圖3-7: 將小麥置于高速粉碎機粉碎后的產物(chnw)分別過

53、100目、80目、60目、35目、20目的檢驗篩，各得10g小麥粉后與70mL緩沖液于錐形瓶中混合(hnh)均勻，置于恒溫水浴振蕩器中以185rpm，35培養4h，培養結束(jish)后于高速臺式離心機中以8000rpm離心10min后得粗酶液，稀釋并測酶活，在80目時有最大酶活0.426U/mL。以該值為100%作圖，得圖3-7并確定最佳小麥粉目數為80目。3.3.6粗酶液提取優化條件總結 依據上述3.3.13.3.5實驗結果，可以得到小麥脂酶粗酶液提取最佳條件如下表表3-2：固液比培養時間緩沖液pH值培養溫度小麥粉目數1：74h7.53580目3.4一次鹽析(yn x)圖3-8：圖3-9：

54、圖3-10：圖3-11:圖3-12：圖3-13：通過對圖3-8至圖3-13的分析，可以看出(kn ch)，在硫酸銨飽和度為20%時，既能夠將一定量雜蛋白通過沉淀取出，又能在上清液中保留較大部分的酶活，宜將20%飽和度作為二次鹽析中的第一此鹽析的硫酸銨濃度，并且棄去沉淀而取上清液。在硫酸銨飽和度為60%時，上清液中包含了大部分雜蛋白，而沉淀中保存了大部分酶活。因此，宜將60%飽和度作為二次鹽析中的第二次鹽析硫酸銨濃度，棄去上清液，去沉淀再溶解后進入下一步處理。3.5二次鹽析(yn x) 二次鹽析后，測得酶液中酶活力為0.347U/mL，蛋白質含量為2.4mg/mL，比活力相較于鹽析前的0.045

55、U/mg提高了3.22倍，說明二次鹽析起到了去除(q ch)除一部分雜蛋白的效果，達到了初步提純的目的。3.6超濾 將酶液稀釋超濾后，測得酶活力為0.0178U/mL，蛋白質含量為0.0747mg/mL。比活力為0.238U/mg。超濾能夠起到取出鹽分的作用，并且能夠去除一部分雜蛋白，相較于超濾前，比活力提高了1.64倍，在去除鹽分的同時得到了一定的提純效果。3.7凝膠柱層析表3-3：洗脫時間時間36h37h38h39h40h蛋白質（mg/mL）0.004430.008210.01010.008230.0043酶活（U/mL）0.002610.006140.01160.01410.00501比

56、活力（U/mg）0.59 0.75 1.15 1.71 1.17 吸光度0.190.250.410.320.21電腦實時間記錄顯示在38h時，280nm處出現了蛋白質吸收峰，將38h附近5個樣取出并測酶活及蛋白質含量后，得到表3-3中的數值，按所得數據(shj)繪圖，得圖3-14及3-15。圖3-14：圖3-15： 根據圖示，發現在層析過程中，酶活力的峰值要稍滯后于蛋白質吸收峰值的出現，最高比活力相較于層析前得到了7.2倍的提升，取得了相當好的提純效果。充分說明凝膠柱層析對酶的提取(tq)純化有相當好的效果，進一步純化可以得到純酶。3.8毒死蜱對于小麥脂酶抑制的標準曲線(qxin)繪制 通過一

57、定濃度毒死蜱對于小麥酶液的的抑制(yzh)而繪制的標準曲線表明，毒死蜱對于小麥活性確實存在著線性關系，并且線性關系較好。R2=0.9979精度較高。4實驗(shyn)結論4.1粗酶液最優提取(tq)條件確定 依據(yj)3.3.13.3.5實驗結果，可以得到小麥脂酶粗酶液提取最佳條件如下表：固液比培養時間緩沖液pH值培養溫度小麥粉目數1：74h7.53580目 通過這些實驗，確定了粗酶液提取的最優條件，對后續續研究提供了先決條件，方便了粗酶液的快速提取，對于農藥初步檢測有著積極意義。4.2粗酶液提純的探索 通過鹽析、超濾、凝膠層析等方法，將酶液比活力從0.045U/mg提高到了1.71U/mg

58、，為提取出純酶液進行進一步研究提供了實驗方法和條件，提高了對植物脂酶提純的認識，確定了這些方法的可行性。4.3有機磷農藥對于(duy)小麥脂酶的活性抑制 通過繪制毒死蜱抑制(yzh)小麥脂酶活性的標準曲線，確定了小麥脂酶活性與毒死蜱含量之間的線性關系，證實了利用小麥脂酶測定農藥含量有可行性并且有相當的精確度。致 謝 本論文是在范欽華老師的悉心指導下完成的。一直以來老師嚴謹求實的治學態度，獨到(ddo)的見解，執著探索的精神給作者留下了深刻的印象，使作者終身受益。在論文的完成過程中，導師注重作者科研能力和綜合素質的培養，幫助作者開闊思路，把握方向為本文的順利完成傾注了大量的時間和精力。在此，謹向尊敬的恩師致以崇高的敬意。參考文獻1張一賓，張怪.農藥(nngyo)M.北京:中國物資出版社.1997，279一280.2安鳳春，莫漢宏，王大華，等.對硫磷在蘋果上的殘留動態(dngti)J.農業環境保護，2001，20(2):11一119.3紐偉民，趙曉聯，趙春城.有機磷農藥檢測方法綜述J.江蘇食品(shpn)與發酵，2001，22(l):28一30.4李勁彤，張雨.對硫磷與對氧磷抑制人腦乙酞膽堿醋酶的老化及重活化J.中國藥理學和毒理學雜志，2002，16(2):143一146.5JuhlerRK.Super