1、第四章 生物分析化學4.1 慨述4.1.1 任務與作用以分析化學理論、技術和方法為基礎以生物化學和分子生物學理論技術為補充以數學、物理學和計算機技術為手段 第1頁測量并獲取生物/化學信息的前沿性交叉學科。1PTP課件三個主要任務：作為化學生物學的核心內容之一，它通過各種各樣的方法和手段得到分析數據，獲取各種物質的組成、結構和功能等方面的信息，從而為化學生物學的深入研究創造條件。第2頁1、提供生物活性物質的組成、含量、結構、形態等方面的信息；2、發展獲取上述信息的方法以及復雜生物物質的分離和純化技術；3、創制用于研究生命活性物質間相互作用的技術手段。2PTP課件生物分析化學的獨特內涵第3頁1、研

2、究對象是生命活性物質，既包括核酸、蛋白質等大分子， 又含有種類繁多的活性小分子和調控分子；2、研究手段獨特，生命體內的活性物質結構復雜、化學性質相似、 生物活性各異，并且在生理條件下相互關聯，對它們的分析測試 要求是非破壞性的原位、活體分析；3PTP課件第4頁3、細胞是生物體的基本單元，生命活性物質在細胞內存在并隨時 空和外界刺激而運動和變化，因此生物分析化學研究微環境和 時空中的多維信息，更重要的是通過生物體內物質的相對簡單 化學成分，但組合與排序構筑了復雜多變的特殊形態和多級 結構，它在服從化學基本作用規律的基礎上更多地體現 生物方面的規律；4、生命過程研究需要同時獲取大量各類分子相互作用

3、的生化信息， 因此，高速、高通量分析方法顯得尤為重要。4PTP課件4.1.2 分類 物質種類繁多，研究內容極其豐富； 可按分析方法和功能分類；分析方法：化學分析、儀器分析；功能分類：分離分析、結構分析和定量分析第5頁5PTP課件分離分析是指將復雜的生物體內物質分離成單一組分或組組分的一類方法，它主要包括電泳（毛細管電泳、二維凝膠電泳和微控芯片電泳等）、色譜技術等。 特點是綜合多種技術手段將分離與分析有機地結合在一起，提高工作效率。第6頁6PTP課件2. 結構分析： 生物物質結構復雜，且結構決定其特有的性質和功能。 研究生物物質結構和構象的方法很多，總體上分為兩大類：一類是測定溶液狀態下的分子構

4、象，如核磁共振、圓二色譜、激光拉曼光譜、熒光光譜、紫外光譜等波譜分析法；另一類是測定分子的晶體結構，如x-射線衍射分析法和小角中子衍射法。第7頁7PTP課件 3. 定量分析：生物分析化學研究的基本任務是確定生物物質的含量。 其特點：物質含量極低富集、分離測定方法靈敏度高、準確、快速、簡便、專一性第8頁8PTP課件4.4 生物活性小分子分析 生物活性小分子是具有維持機體正常功能、調節生命活動過程的化學物質的總稱；內源性外源性細胞分泌信號物質傳遞細胞內/間的信息調節自身及其他細胞的代謝和功能調節物質代謝和維持生理功能第9頁9PTP課件類別物質基本功能生長因子類介質 胰島素、表皮、血小板類生長因子傳

5、遞細胞間信息局部化學介質NO、CO傳遞細胞間信息神經遞質乙酰膽堿、多巴胺傳遞細胞間信息激素蛋白質、肽、類固醇傳遞細胞間信息第二信使Ca2+、cAMP、cGMP傳遞細胞內調控信號維生素維生素、生物素、葉酸、泛酸調節物質代謝和維持生理功能微量元素鐵、碘、銅調節物質代謝和維持生理功能部分生物活性小分子及功能第10頁10PTP課件4.4.1 一氧化氮分析 一氧化氮是機體內一種作用獨特的信號分子，在不同的器官、不同生理或病理狀態下均存在著利與弊的雙重影響。 目前，檢測NO的方法有光化學（紫外可見分光光度法、熒光法、化學發光）、電化學法、電子自旋共振法和生物檢測法。第11頁11PTP課件12PTP課件近來

6、發現一氧化氮（nitric oxide，NO）廣泛分布于生物體內各組織中，特別是神經組織中。它是一種新型生物信使分子，1992年被美國Science雜志評選為明星分子。NO是一種極不穩定的生物自由基，分子小，結構簡單，常溫下為氣體，微溶于水，具有脂溶性，可快速透過生物膜擴散，生物半衰期只有35s，其生成依賴于一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase , NOS ）并在心、腦血管調節、神經、免疫調節等方面有著十分重要的生物學作用。13PTP課件（1）在心血管系統中 NO在維持血管張力的恒定和調節血壓的穩定性中起著重要作用。 在生理狀態下，當血管受到血流沖擊、灌注壓突然升高時，N

7、O作為平衡使者維持其器官血流量相對穩定，使血管具有自身調節作用。能夠降低全身平均動脈血壓，控制全身各種血管床的靜息張力，增加局部血流，是血壓的主要調節因子。NO在心血管系統中發揮作用的可能機制是通過提高細胞中鳥苷酸環化酶（guanylate cyclase , GC）的活性，促進磷酸鳥苷環化產生環一磷酸鳥苷（guanosine 3, 5cyclic monophosphate cGMP），使細胞內cGMP水平增高，繼而激活依賴cGMP的蛋白激酶對心肌肌鈣蛋白的磷酸化作用加強，肌鈣蛋白c對Ca2+的親合性下降，肌細胞膜上K+通道活性也下降，從而導致血管舒張。NO的生物學作用14PTP課件（2）在

8、免疫系統中 研究結果表明，NO可以產生于人體內多種細胞。如當體內內毒素或T細胞激活巨噬細胞和多形核白細胞時，能產生大量的誘導型NOS和超氧化物陰離子自由基，從而合成大量的NO和H2O2，這在殺傷入侵的細菌、真菌等微生物和腫瘤細胞、有機異物及在炎癥損傷方面起著十分重要的作用。目前認為，經激活的巨噬細胞釋放的NO可以通過抑制靶細胞線粒體中三羧酸循環、電子傳遞和細胞DNA合成等途徑，發揮殺傷靶細胞的效應。免疫反應所產生的NO對鄰近組織和能夠產生NOS 的細胞也有毒性作用。某些與免疫系統有關的局部或系統組織損傷，血管和淋巴管的異常擴張及通透性等，可能都與NO在局部的含量有著密切的關系。15PTP課件連

9、續刺激小腦的上行纖維和平行纖維可引起平行纖維細胞的神經傳導產生長時程抑制(Long-term depression , LTD)，被認為是小腦運動學習體系中的一種機制，NO參與了該機制。（3）在神經系統中 有關L-Arg NO途徑在中樞神經系統(CNS)方面的研究認為，NO通過擴散，作用于相鄰的周圍神經元如突出前神經末梢和星狀膠質細胞，再激活GC從而提高水平cGMP水平而產生生理效應。如NO可誘導與學習、記憶有關的長時程增強效應（Long-term potentiation , LTP），并在其LTP中起逆信使作用。 在外周神經系統也存在L-Arg NO途徑。NO被認為是非膽堿能、非腎上腺素能

10、神經的遞質或介質，參與痛覺傳入與感覺傳遞過程。16PTP課件現已證明在人體內廣泛存在著以NO為遞質的神經系統，它與腎上腺素能、膽堿能神經和肽類神經一樣重要。若其功能異常就可能引起一系列疾病。另據報道，NO在胃腸神經介導胃腸平滑肌松弛中起著重要的中介作用，在胃腸間神經叢中，NOS和血管活性腸肽共存并能引起非腎上腺素能非膽堿能（nonadrenergic-non-cholinerrgic , NANC）舒張，但血管活性腸肽的抗體只能部分消除NANC的舒張，其余的舒張反應則能被N-甲基精氨酸消除。NO作為NANC神經元遞質，在泌尿生殖系統中起著重要作用。成為排尿節制等生理功能的調節物質，這為藥物治療

11、泌尿生殖系統疾病提供了理論依據。17PTP課件4.4.2 兒茶酚胺類神經遞質分析 兒茶酚胺類（catecholamines,CAs）是絡氨酸衍生物的總稱，包括多巴、多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素和5-羥色胺等物質。CAs類物質是人體一類重要的神經遞質和激素，對心血管、神經等組織系統的生理活動起著調控作用，與一些功能性疾病以及器質性的病變有密切關系。 研究這類物質的分析方法，對于了解他們在生命體內的調控機制以及相關的藥理學研究和疾病診斷均具有十分重要的意義。 第12頁18PTP課件4.4.3 興奮劑檢測（doping control） 興奮劑是IOC 和其他國際體育組織所確定的禁用藥物（濫用藥物

12、，doping），運動員以非正常量服用這些藥物后可以在某種程度上提高他們的競賽能力。從本質上講，興奮劑是一類對人體生理機能有重要影響的刺激性藥物，是一類特殊的生物活性小分子。第13頁19PTP課件第14頁20PTP課件欺騙公眾，欺騙法律，欺騙家人，欺騙自己，騙了七年，馬里恩瓊斯終于累了！看著她淚流滿面的照片，讀到她交回獎牌，還會鋃鐺入獄的消息，不知為何，并不因此而十分憎恨、厭惡她，反倒涌動著些許同情。5枚奧運獎牌得主、美國“女飛人”瓊斯 欺騙之后是良心的折磨，悔恨的淚水只是對犯罪的懺悔，卻不能洗刷掉對奧運精神的玷污，監獄將成為瓊斯完成自我救贖的驛站。21PTP課件據日本共同社報道，國際柔道聯盟

13、(IJF)7日在突尼斯舉行理事會，正式決定對在2009年8月荷蘭世錦賽上藥檢結果呈陽性的北京奧運會柔道女子78公斤以上級冠軍佟文處以2年禁賽處罰，禁賽期至2011年9月結束。佟文蟬聯三屆世錦賽冠軍時所獲金牌將被取消，但亞軍及以下名次不會順位上升。 佟文的恩師、教練吳衛鳳。“她（佟文）應該是無意中吃了含有大量瘦肉精的排骨才造成這樣的后果。” 22PTP課件許多化學物質被稱為瘦肉精，主要有萊克多巴胺、鹽酸克侖特羅(腎上腺類神經興奮 )、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、硫酸特布他林、西巴特羅、鹽酸多巴胺等7種。其中培林（雷托巴胺，萊克多巴胺 ，Ractopamine）毒性極低、代謝快速（無累積性），因此被美

14、國等國家允許添加入豬飼料，日本也允許使用培林（Ractopamine）的豬肉進口。目前全世界有美國等24國開放使用培林，有160多國仍禁用。 瘦肉精23PTP課件 ?To be or not to be， 24PTP課件 作用于神經系統以增強體力的刺激劑，如苯丙胺、麻黃堿、咖啡因、可卡因等42種；能產生快感和心理亢奮而降低痛感的麻醉劑，該類藥物多有成癮性，如哌替啶、嗎啡等19種；具有鎮靜作用而抑制支氣管及血管平滑肌舒張的-阻斷劑，如比索洛爾、梭達羅等9種；用以增加腎臟對尿的排泄速率使禁用藥物在尿液中不易檢出的利尿劑，如依他尼酸、芐氟噻嗪米等15種；第17頁IOC規定的興奮劑可分為下述七類：25

15、PTP課件5. 用以遮蔽檢測重要性生理指標的掩蔽劑，如表睪酮等4種；6. 用以增長肌肉和逆轉蛋白損失的合成類固醇，常見的有氯睪酮、達那唑、大力補、美雄酮等16種雄性激素衍生物；7. 增強體內紅細胞數目并提高血液載氧能力的肽類激素（內源性），包括紅細胞生成素（EPO）、絨毛膜促性腺激素（HCG）、生長激素、促腎上腺皮質激素等4種。第18頁26PTP課件 第19頁1、興奮劑檢測的基本要求與分析步驟（1）違禁藥物在體內含量低；（2）違禁藥物在體內代謝復雜，且有個體差異；（3）違禁藥物在體內本身有，需檢測內源性與外源性；（4）違禁藥物不斷出現。 興奮劑檢測任務困難、艱巨，原因：27PTP課件第20頁興

16、奮劑檢測的總體要求樣品的預處理及分離、富集技術應簡潔，盡可能保留待檢出的所有成分；分析方法在保證單一成分檢測準確的同時，應盡量擴展檢測范圍并使之能同時檢出多種成分；檢測方法對檢測物的靈敏度要高； 儀器檢測方面宜發展高效分離和檢測低限的檢測技術。28PTP課件 第21頁樣品的類型主要有三種：即尿樣、血樣和發樣尿樣是興奮劑檢測中最常用的手段，其主要原因為取樣容易、預處理簡單、尿中藥物及其代謝產物濃度高于血中，樣品易于保存；血檢的優點在于可以檢測出尿樣無法檢出的促紅細胞生長因子（EPO）等物質；發檢可提供濫用者服用禁藥數月之后的證據。29PTP課件Doping control 取樣賽后1h，名次、隨

17、機A、B樣預處理A樣多份，酸、堿、酶化組篩選陰、陽確證和復審陽性、重檢第22頁30PTP課件2、興奮劑檢測的一般技術 興奮劑樣品時一個復雜體系，它不僅存在正常食物引入的化學/生物物質和嫌疑外源性違禁物，同時也含有人體正常生理過程的分泌/代謝產物-內源性物質。因此，興奮劑樣品分離效率、監測方法的靈敏度是影響檢測結果可靠性的關鍵因素。 第23頁31PTP課件分離方法 主要依靠色譜法： GC、TLC、HPLC和MEKC。 檢測器 興奮劑的濃度很低，檢測器的靈敏度是重要依據。色譜法中先后采用氫焰離子化檢測器（FID）、氮磷檢測器（NPD）和質譜檢測技術。 第24頁32PTP課件 GC-MS一直是IOC

18、進行興奮劑檢測的最有力工具之一。目前普遍采用質譜-質譜聯用（MS/MS）、高分辨質譜（HRMS）和多離子檢測等技術。這些方法成功檢測2ng/ml的康力龍、克倫特羅、5-4-羥基甲睪等興奮劑。第25頁33PTP課件3、內源性激素的檢測與策略 第26頁刺激劑、合成類固醇、-阻斷劑等傳統興奮劑檢測方法已近完善，但一些內源性激素成為興奮劑檢測的難點。如睪酮（T）、雙氫睪酮（DHT）、EPO和人體生長激素（HGH）等。34PTP課件T的檢測 第27頁正常男性體內，內源T與表睪酮（ET）的比為30，而尿中排出的T/ET為1；如使用外源性T， T ，ET不變， T/ET ； T/ET6為陽性；如果使用30/1的T/ET，T/ET為1，但ET絕對值升高，陽性。T / ET = 30 （內源性）T / ET = 1 （尿液）T / ET 6 （尿液、陽性）35PTP課件EPO的檢測 第28頁EPO是一種