1、定量與常規PCR的差別Opticon實時熒光定量PCR儀之 常規PCR技術：對PCR擴增反應的終產物進行定量及定性分析定量PCR技術：通過對PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析三個關鍵詞：實時，定量，熒光Opticon實時熒光定量PCR儀之 如何定量？Ct值的概念Ct值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數增長階段的閾值所對應的循環次數。 為什么要用Ct值定量實時熒光定量PCR方法利用循環閾值（Ct）的概念，在指數擴增的開始階段進行檢測，此時樣品間的細小誤差尚未放大，因此該Ct值具有極好的重復性。 定量原理初始 DNA量越多, 熒光達

2、到某一值（域值）時所需要的循環數越少Log濃度與循環數呈線性關系，根據樣品擴增達到域值的循環數就可計算出樣品中所含的模板量確定初始模板的濃度Opticon實時熒光定量PCR儀之 SYBR Green 1Molecular Beacons TaqMan熒光化學Opticon實時熒光定量PCR儀之 AmplifluorRoche熒光化學Opticon實時熒光定量PCR儀之 陰陽探針R1R2RQSYBR Green I 工作原理Opticon實時熒光定量PCR儀之 SYBR Green 1 結合到雙鏈DNA的小溝部位SYBR Green 1 染料只有和雙鏈DNA結合后才發熒光。GTTTGGCCCCC

3、CCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT變性 DNA未結合SYBR Green 1 dye變性: 無熒光信號SYBR Green I 工作原理Opticon實時熒光定量PCR儀之 SYBR Green I 應用范圍起始模板濃度定量融解曲線分析 -可區分單一產物、變異產物、多種產物和（或）引物二聚體基因型分析Opticon實時熒光定量PCR儀之 SYBR Green I 優點使用方便 - 不必設計復雜的引物 沒有序列特異性 - 可以用于不同的模板 便宜 靈敏Opticon實時熒光定量PCR儀之

4、SYBR Green I 缺點與非特異性產物結合Opticon實時熒光定量PCR儀之 Molecular BeaconsMolecular BeaconsOpticon實時熒光定量PCR儀之 發夾型雜交探針Molecular Beacons原理：熒光諧振能量傳遞（FRET） 莖由互補配對的序列組成環與目標序列完全配對莖Opticon實時熒光定量PCR儀之 熒光素淬滅劑環變性: 產生非特異性的熒光Molecular BeaconsOpticon實時熒光定量PCR儀之 Molecular Beacons SNPTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQ熒光素目標序

5、列莖淬滅劑Opticon實時熒光定量PCR儀之 延伸: 沒有熒光Molecular Beacons SNPOpticon實時熒光定量PCR儀之 Molecular Beacons 應用范圍定量起始模板濃度基因型分析鑒定產物單核苷酸多態性（SNP）檢測Opticon實時熒光定量PCR儀之 Molecular Beacons 優點對目標序列有很高的特異性 用于SNP檢測的最靈敏的試劑之一熒光背景低Opticon實時熒光定量PCR儀之 Molecular Beacons 缺點設計困難無終點分析功能只能用于一個特定的目標價格較高Opticon實時熒光定量PCR儀之 TaqMan探針熒光素淬滅劑Opti

6、con實時熒光定量PCR儀之 TaqMan水解型雜交探針TaqMan目標特異性探針5 為熒光素， 3 為淬滅劑5 熒光素3淬滅劑與目標序列互補Opticon實時熒光定量PCR儀之 TaqMan 工作原理Opticon實時熒光定量PCR儀之 退火: 無熒光信號3355模板和探針雜交延伸: 聚合反應5533TaqMan 工作原理Opticon實時熒光定量PCR儀之 3355延伸: Taq酶切下5端熒光素出現熒光TaqMan 工作原理Opticon實時熒光定量PCR儀之 TaqMan SNP分析TACCGGGGGTTACGAACGGTAATG A T C C T A C CG A T C C C A C COpticon實時熒光定量PCR儀之 TaqMan 應用范圍定量起始模板濃度基因型分析產物鑒定SNP分析Opticon實時熒光定量PCR儀之 TaqMan 優點對目標序列有很高的特異性 -特別適合于SNP檢測與 Molecular Beacons 相比設計相 對簡單Opticon實時熒光定量PCR儀之 兼容化學試劑總結結合于雙鏈DNA的小溝中發夾型雜交探針水解型雜交探針（5-3外切）延伸復性任何步驟定量和檢測目標基因融解曲線分析SNP分析定量和檢測目標基因SNP分析定量和檢