1、ITRAQ技術簡述1994年,MarcWilkins在Siena雙向凝膠電泳（two-dimensionalelectrophoresis,2-DE）會議上最早提出了蛋白質組（proteome）概念，并于1995年7月的Electrophoresis雜志上發表。隨著高通量、高靈敏度、高分辨率生物質譜技術的出現,蛋白質組學技術取得飛速發展,人們不再滿足于對一個細胞或組織的蛋白質進行定性研究,而是著眼于蛋白質量的研究,于是蛋白質組學概念就被提出,并得到了廣泛的應用。蛋白質組學（Proteomics）是蛋白質（protein）與基因組學（genomics）兩個詞的組合體,表示“一種基因組所表達的全套

2、蛋白質”,即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質。蛋白質組學研究,就是要把一個基因組表達的絕大多數蛋白質或一個復雜的混合體系中絕大多數蛋白質進行精確的定量和鑒定。蛋白質組本質上指的是在大規模水平上研究蛋白質的特征,包括蛋白質的表達水平,翻譯后的修飾,蛋白與蛋白相互作用等,由此獲得蛋白質水平上的關于疾病發生,細胞代謝等過程的整體而全面的認識。蛋白質組學是一門以全面的蛋白質性質研究為基礎,在蛋白質水平對疾病機理、細胞模式、功能聯系等方面進彳丁探索的科學。目前最新的iTRAQ蛋白定量分析技術在此基礎上被提出，并被得到廣泛應用。僅僅知道蛋白質的身份并不足以對蛋白質給出最終定論，因為蛋白質的濃度對

3、于實現其在細胞中的功能來說極其重要，一種特殊蛋白質在濃度上的變化，就能預示細胞的突變過程。因此，科學家能夠對蛋白質的相對和絕對濃度進丁測量，是很重要的事情。過去，科學家通常先進行二維凝較電泳，切斷條帶，再用質譜方法測量條帶中的蛋白質。可是，這種方法不是很理想：既不是非常敏感，也不是非常精確。新澤西醫學及牙科大學的蛋白組學研究中心主任說：“當我們開始蛋白組學研究時，就采用凝膠技術，但得出的信息量卻讓大伙很失望，因為許多蛋白質已經改變了自身的代謝過程，如熱休克蛋白或者是管家蛋白。”蛋白組學中的方法一直在不斷提高。基于高度敏感性和精確性的串聯質譜方法，不需要凝膠，就可以獲得相對和絕對定量的蛋白質結果

4、。iTRAQ和iCAT是這些新進展中的兩大主力，但是，新技術也有不盡如人意的地方，需要不斷改進。iTRAQ技術是由美國應用生物系統公司（AppliedBiosystemsIncorporation，ABI）2004年開發的同位素標記相對和絕對定量（isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation,iTRAQ)技術，是一種新的、功能強大的可同時對四種樣品進行絕對和相對定量研究的方法，這種方法是建立在iTRAQ試劑的基礎上。上海舜百生物公司目前所采用的就是這種iTRAQ技術。該技術的主要特點在于：1.分離能力強、分析范圍廣；2.定性分析結果可靠，可以同時

5、給出每一個組分的分子量和豐富的結構信息；3.MS具備高靈敏度、檢測限低；4分析時間快，分離效果好；5自動化程度高；6.iTRAQ技術不僅可發現胞漿蛋白，還有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白。iTRAQ技術可檢測出低豐度蛋白、強堿性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。上海舜百生物使用的液相色譜儀是型號是日本島津公司2D-nano-HPLC,質譜儀型號是美國ABI公司的MALDI-TOF-TOF4700，標記試劑盒是美國ABI公司的ITRAQ標記試劑盒。舜百生物所采用的iTRAQ試劑是一種小分子同重元素化學物質，包括三部分：一端是報告部分(reportergroup)，另一端是肽反應部分(pepti

6、dereactivegroup)，中間部分是平衡部分(balancegroup)。其中，reportergroup：質量為114Da、115Da、116Da、117Da，因此iTRAQ試劑共四種。peptidereactivegroup：將reportergroup與肽N端及賴氨酸側鏈連接，幾乎可以標記樣本中所有蛋白質。balancegroup：質量為31Da、30Da、29Da、28Da，使得四種iTRAQ試劑分子量均為145Da，保證iTRAQ標記的同一肽段m/z相同。舜百生物公司iTRAQ的操作程序如下：將蛋白質裂解為肽段，然后用iTRAQ試劑進行差異標記。再將標記的樣本相混合，這樣就可

7、以對其進行比較。與樣本結合后，通常用MudPIT多維蛋白質鑒定技術進行下一步的操作，用2D液相色譜串聯質譜進行分析。在質譜分析鑒定特殊肽離子片斷結構的基礎上，采用美國應用生物系統公司的軟件包MASCOT和ProteinPilot對每一個肽段進行鑒定。其具體操作如下圖所示：iTRAQ技術對檢測標本也有一定要求。舜百生物要求檢測蛋白量最低不少于50ug，濃度最低不少于5ug/uL，否則同位素無法標記。而對蛋白提取試劑也要求使用普通的組織、細胞裂解液即可，切忌不要使用二維電泳試劑提取。iTRAQ技術區別與以往二維電泳技術具有更明顯的優勢，兩者比較如下：1、二維電泳所檢測的發生表達變化的蛋白都位于細胞漿內，而iTRAQ可檢測到蛋白有胞漿蛋白外，還有線粒體蛋白、膜蛋白和核蛋白。2、二維電泳觀察到的蛋白變化在2倍以上，而用iTRAQ計算出的蛋白變化在1.3-1.6倍之間。3、iTRAQ技術在鑒定大分子和小分子蛋白方面也有優勢。4、二維電泳是通過切斷條帶，再用質譜方法測量條帶中的蛋白質，但該方法既不是非常敏感，也不是非常精確，獲取的信息量很少。而itraq技術是基于高度敏感性和精確性的串聯質譜方法，不需要凝膠，就可以獲得相對和絕對定量的蛋白質結果。5、iTRAQ可以對任何類型的蛋白質進行鑒定，包括高